Name: investigation of protein recruitment to dna lesions using 405 nm laser micro-irradiation
Uploaded: 2018-03-20T15:00:00
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Diese Arbeit wurde von den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada [Discovery Grant 5026 bis Uhr] und eine nächste Generation von Wissenschaftlern Stipendium von der Cancer Research Society [21531 bis Uhr] unterstützt. Wir danken Jean-François Lucier bietet hervorragende Qualitätskontrolle der Fidschi-Python-Skripten und Ratschläge zur statistischen Analyse. Wir danken Dr. Stephanie A. Yazinski für IF Fixierung Lösung Rezept. Wir danken Paul-Ludovic Karsenti für Hilfe bei Lasermessungen macht.

1. Pre-Sensibilisierung der Zellen
<ol><li>24 h vor der Mikro-Bestrahlung Experiment seed 40.000 U2OS Zellen pro Bohrloch in 1 X DMEM mit 10 % FBS in 8-Well Kultur mit 170 µm dicken Deckglas-wie Glas/Kunststoff-Böden gleitet zu gewährleisten maximale Durchlässigkeit von 405 nm Laserlicht und exzellente Bildgebung mit einem Laser-scanning invertiert confocal Mikroskop. Wenn ein 8-Brunnen-Objektträger, verwenden Sie 500 µL Medien oder Lösungen pro Bohrloch für alle nachfolgenden Behandlungen und waschen Schritte ...

<ol>
	<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+damage+response:+making+it+safe+to+play+with+knives.">The DNA damage response: making it safe to play with knives.</a> Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li><li>Bekker-Jensen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+mammalian+genome+surveillance+machinery+in+response+to+DNA+strand+breaks.">Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks.</a> The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).</li><li>Limoli, A. C. L., Ward, J. 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W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Laser+Micro-irradiation+for+Examination+of+Single+and+Double+Strand+Break+Repair+in+Mammalian+Cells.">Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).</li><li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation.">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).</li><li>Mortusewicz, O., Am&#233;, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback-regulated+poly(ADP-ribosyl)ation+by+PARP-1+is+required+for+rapid+response+to+DNA+damage+in+living+cells.">Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).</li><li>Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+reveals+a+&#947;H2AX-53BP1+interaction+in+the+DNA+damage+response.">Chemical proteomics reveals a &#947;H2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).</li><li>Soultanakis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+detection+of+8-oxoguanine+in+nuclear+and+mitochondrial+DNA+of+cultured+cells+using+a+recombinant+Fab+and+confocal+scanning+laser+microscopy.">Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy.</a> Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).</li></ol>

Verwenden die oben beschriebenen Methoden, ermöglicht 405 nm Laser Mikro-Bestrahlung von Zellen mit BBET oder BrdU bereits sensibilisiert die lokalisierte Erzeugung von DNA-Läsionen einschließlich der DSB in den Kernen der anhaftende menschliche Zellen. Kinetik der DDR bei diesen DSB ähneln denen generiert mit anderen Methoden in eukaryotischen Zellen9,18,19. DSB-Resektion an Mikro-bestrahlten Standorten führt zu SsDNA-Gene...

Zellen sind ständig endogenen und exogenen Quellen von DNA-Schäden ausgesetzt, die ihre genomischen Unversehrtheit bedrohen. Die DDR ist ein Ensemble der Signalwege, die erkennen, zu signalisieren und zu reparieren DNA-Läsionen um Genomstabilität aufrecht zu erhalten. Im DNA-Doppelstrang-Brüchen (DSB), tritt die DDR hauptsächlich auf zwei komplementäre Plattformen: γ-H2A.X-mit der Bezeichnung Chromatin und einer resezierten einzelsträngiger DNA (SsDNA) Region in der Regel mit dem SsDNA-Bindung komplexe RPA1,2beschichtet.
UV-Laser Mikro-Bestrahlung von Zellen, die bereits mit dem Thymidin analoge 5-Bromo-2' Deoxyuridine (BrdU) oder der Bisbenzimide Ethoxide Trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) DNA-Farbstoff sensibilisiert schafft eine Mischung aus einsträngiger Pausen (einschließlich DNA-Läsionen SSBs) und DSB, die eine lokalisierte DDR auf das Chromatin und SsDNA Plattformen3,4zu entlocken. Vorherigen Arbeiten zeigten, dass die Rekrutierung von Genom Wartungsfaktoren, diese zwei unterschiedlichen Plattformen auf DSB mit hochenergetischen UV-A-Lasern (335-365 nm) kombiniert mit IF2,5diskriminiert werden kann. Mikroskope mit solchen Lasern ausgestattet sind teuer, da sie ein Hochenergie-Laser und spezielle UV-A Übertragung Ziele damit weit weniger verbreitet in akademischen und pharmazeutischen Einstellungen als Laserscanning-konfokale Mikroskope mit 405 nm Laser erfordern Linien. Die Untersuchung von Protein-Rekrutierung und Austausch an Mikro-bestrahlten Standorten ist auch durch die mühsame manuelle Bildanalyse erforderlich, um das dynamische Verhalten des Genoms Wartungsfaktoren beschreiben ausgeschlossen.
Hier zeigen wir, dass die Pre-Sensibilisierung der Zellen mit BrdU oder BBET Nukleinsäure-Fleck gefolgt von Mikro-Bestrahlung mit einem 405 nm-Laser auf eine gemeinsame confocal Mikroskop ermöglicht die Überwachung des Genoms Wartung Faktor Dynamik bei DNA-Läsionen. Mit γ-H2A.X oder RPA komplexe Untereinheiten als Plattform Marker zusammen mit Z-Stapeln für größere Schärfentiefe und Dekonvolution für verbesserte Auflösung ermöglicht den Experimentator, Faktoren zu unterscheiden, die lokal zu DSB von denen geworben werden, die zu verbreiten großen Chromatin Domains rund um die ersten Läsion. Diese Untergliederungen nach unterschiedlichen Intra nuklearen Fächer hilft die möglichen Rollen des Fußgelenkes Proteine rekrutiert zu Mikro-bestrahlt Websites zu verfeinern. Wir bieten bequeme Protokolle und optimiert Rohrleitungen um die Dynamik des Genoms Wartungsfaktoren mit Open-Source-Software Fidschi (eine ImageJ-Verteilung)6,7,8schnell zu analysieren. Diese Verfeinerungen zu aktuellen Mikro-Bestrahlung Methoden ermöglichen die Studie der DDR in praktisch jedem Labor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1022">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">FluoView FV3000 software (version 2.1)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">405 nm laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Radiation source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>OKO-UNO-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">60X /1.4 Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Oil immersion objective</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">8-well culture slides on coverglass (X-well)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6190.802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">U2OS osteosarcoma human cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-96</td>
			<td>Stable cell lines&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">4&#8217;,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Caution toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">5-bromo-2&#8242;-deoxyuridine&#160;(BrdU)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59-14-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Caution toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Trypsin EDTA 0.1%&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRX777.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Tween-20&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Sucrose&#160;</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SUC507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">JetPRIME transfection reagent&#160;</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>114-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">DMEM 1X, + phenol red</td>
			<td>Wisent&#160;</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">DMEM 1X, - phenol red</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-051-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Wisent&#160;</td>
			<td>080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Mouse anti-RPA32 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2175</td>
			<td>1:500 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Rabbit anti-&#947;-H2A.X antibody</td>
			<td>Cell Signaling&#160;</td>
			<td>9718S</td>
			<td>1:500 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Rabbit Anti-53BP1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling&#160;</td>
			<td>4937S</td>
			<td>1:500 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Rabbit Anti-PRP19 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27692</td>
			<td>1:500 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Cell Signaling&#160;</td>
			<td>4414S</td>
			<td>1:250 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Goat anti-mouse&#160; IgG Alexa Fluor 488&#160;</td>
			<td>Cell Signaling&#160;</td>
			<td>4408S</td>
			<td>1:250 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Fiji image analysis open-source software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">1918-K Power meter&#160; with a 918D-SL-0D3 sensor</td>
			<td>Newport</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of protein recruitment to dna lesions using 405 nm laser micro-irradiation

Die DNA-Schäden als Reaktion (DDR) verwendet eine Vielzahl von Proteinen zu erkennen, zu signalisieren und DNA-Läsionen zu reparieren. Abgrenzung dieser Reaktion ist entscheidend für die Genom-Wartung-Mechanismen zu verstehen. Da Rekrutierung und Austausch von Proteinen bei Läsionen sehr dynamisch sind, erfordert ihre Studie die Fähigkeit, DNA-Schäden schnell und räumlich abgegrenzt zu generieren. Hier beschreiben wir Verfahren zur DNA-Schäden in den menschlichen Zellen mit einem handelsüblichen Laserscanning-konfokale-Mikroskop verfügt über eine 405 nm Laserlinie lokal zu induzieren. Ansammlung von Genom-Wartung, die Faktoren bei Laser Streifen durch Immunfluoreszenz (IF) oder in Echtzeit bewertet werden können mittels Proteine mit fluoreszierenden Reporter verschlagwortet. Verwendung von phosphorylierten Histon H2A. X (γ-H2A.X) und Replikation Protein A (RPA) als Marker, die Methode bietet ausreichenden Auflösung lokal rekrutiert Faktoren von denen zu unterscheiden, die auf angrenzenden Chromatin verteilt. Wir bieten weitere ImageJ-basierte Skripts effizient überwachen die Kinetik der Protein Relokalisierung DNA Websites beschädigen. Diese Verfeinerungen erleichtern erheblich die Studie der DDR Dynamik.

Nach Mikro-Bestrahlung dürfen Zellen für einen bestimmten Zeitraum abhängig von der Art des Genoms Wartung Proteine1,12zu erholen. DSB werden bearbeitet von Nukleasen, weitgehend in den S und G2-Phasen des Zellzyklus, eine begrenzte Region SsDNA erstellen, die schnell von RPA und andere Genom Wartung Faktoren9beschichtet ist. SsDNA Region ist umgeben von Chromatin, die ausgiebig in der DDR, die Rekrutier...

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Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

DNA-Schäden reparieren Kinetik Studium erfordert ein System zur Läsionen an definierte Sub-atomaren Regionen zu induzieren. Wir beschreiben eine Methode zum Erstellen von lokalisierter Doppelstrang-Pausen mit einem konfokale Laserscanning-Mikroskop ausgestattet mit einem 405 nm-Laser und bieten automatisierte Verfahren zur Quantifizierung der Dynamik der Reparatur Faktoren bei dieser Läsionen.

Untersuchung von Protein-Rekrutierung, DNA-Läsionen mit 405 Nm Micro-Laserbestrahlung

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Research

JoVE Journal

Genetics

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

RNA-Interferenz-basierte Untersuchung der Funktion von Heat Shock Protein 27 während Hornhautepithels Wundheilung

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Forschung

Genetik

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

Tools, um die Rolle der Architektur-Protein HMGB1 zur Untersuchung bei der Verarbeitung von Helix verzerrenden, ortsspezifische DNA-Quervernetzungen zwischen

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

Protokolle für C-Brick DNA Standard Assembly mit Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation In Vivo zellulären Reaktionen auf einfache und komplexe DNA-Schäden zu studieren

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Untersuchung der RNS-Synthese mit 5-Bromouridine Kennzeichnung und Immunopräzipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

Ein einfacher, rasches und quantitativen Assay zur Maßnahme Reparatur von DNA-Protein-Querverbindungen auf Plasmide transfiziert in Säugerzellen

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analysen mithilfe der OpenProt-Datenbank zu enthüllen neue Proteine übersetzt aus dem nicht-kanonischen Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...