Name: assessing lysosomal alkalinization in the intestine of live caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-04-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer o centro de genética Caenorhabditis para tensões, as ciências naturais e Conselho de pesquisa de engenharia (NSERC) e a Fundação do Canadá para a inovação (TPI) para financiamento. Gostaríamos de agradecer o Dr. Lizhen Chen (departamento de sistemas de célula e anatomia, UT saúde San Antonio) por permitir o uso irrestrito de seus laboratórios para todos os experimentos de c. elegans , bem como Dr. Exing Wang (diretor associado, Optical Imaging Facility UT saúde San Antonio) para obter assistência com microscopia confocal. Também gostaríamos de agradecer o Dr. Myron Ignatius para fornecer apoio e incentivo para facilitar a gravação do vídeo.

1. mancha e lisossomos intestinais de imagem
<ol><li>Placas de mídia de crescimento nematoide de semente (NGM) OP50
	<ol>
<li>Preparar pratos NGM conforme o protocolo recomendado19 e permitir que as placas fechadas secar por 2 dias à temperatura ambiente.</li>
		<li>Inocular as bactérias OP50 no caldo estéril de caldo Luria (LB) e crescer em um tremendo banho de incubadora ou água a 37 ° C por 36 h ou até que o OD está entre 0,2 e 0,4. Evitar o uso de uma cultura bacteri...

<ol>
	<li>Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+aging+and+failure+to+segregate+damaged+proteins+in+Sir2+mutants.">Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants.</a> Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).</li><li>Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+for+the+avoidance+of+neurodegeneration.">Autophagy for the avoidance of neurodegeneration.</a> Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).</li><li>Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+intracellular+protein-degradation+pathways+in+neurodegeneration.">The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration.</a> Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).</li><li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity.">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).</li><li>Cuervo, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+aging:+the+importance+of+maintaining+&amp;#34;clean&amp;#34;+cells.">Autophagy and aging: the importance of maintaining &amp;#34;clean&amp;#34; cells.</a> Autophagy. 1 (3), 131-140 (2005).</li><li>Harrington, A. J., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+identifying+effectors+of+alpha-synuclein+misfolding+and+dopaminergic+cell+death+associated+with+Parkinson's+disease.">Caenorhabditis elegans as a model system for identifying effectors of alpha-synuclein misfolding and dopaminergic cell death associated with Parkinson's disease.</a> Methods. 53 (3), 220-225 (2011).</li><li>Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+amyloid+formation,+and+neurodegeneration:+a+critical+role+for+molecular+chaperones?.">Protein misfolding, amyloid formation, and neurodegeneration: a critical role for molecular chaperones?.</a> Neuron. 35 (1), 9-12 (2002).</li><li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decline+in+chaperone-mediated+autophagy.">Age-related decline in chaperone-mediated autophagy.</a> J Biol Chem. 275 (40), 31505-31513 (2000).</li><li>Tonoki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+evidence+linking+age-dependent+attenuation+of+the+26S+proteasome+with+the+aging+process.">Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process.</a> Mol Cell Biol. 29 (4), 1095-1106 (2009).</li><li>Squier, T. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+cellular+and+molecular+mechanisms.">Autophagy: cellular and molecular mechanisms.</a> J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).</li><li>Boya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+function+and+dysfunction:+mechanism+and+disease.">Lysosomal function and dysfunction: mechanism and disease.</a> Antioxid Redox Signal. 17 (5), 766-774 (2012).</li><li>Kim, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-aging+treatments+slow+propagation+of+synucleinopathy+by+restoring+lysosomal+function.">Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function.</a> Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).</li><li>Vila, M., Bove, J., Dehay, B., Rodriguez-Muela, N., Boya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+membrane+permeabilization+in+Parkinson+disease.">Lysosomal membrane permeabilization in Parkinson disease.</a> Autophagy. 7 (1), 98-100 (2011).</li><li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+intracellular+proteolytic+systems+change+with+age?.">How do intracellular proteolytic systems change with age?.</a> Front Biosci. 3, d25-d43 (1998).</li><li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+lysosomes+get+old.">When lysosomes get old.</a> Exp Gerontol. 35 (2), 119-131 (2000).</li><li>Gachet, Y., Codlin, S., Hyams, J. S., Mole, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=btn1,+the+Schizosaccharomyces+pombe+homologue+of+the+human+Batten+disease+gene+CLN3,+regulates+vacuole+homeostasis.">btn1, the Schizosaccharomyces pombe homologue of the human Batten disease gene CLN3, regulates vacuole homeostasis.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5525-5536 (2005).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Preston, R. A., Murphy, R. F., Jones, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+vacuolar+pH+in+yeast+and+identification+of+acidification-defective+mutants.">Assay of vacuolar pH in yeast and identification of acidification-defective mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7027-7031 (1989).</li><li>Pringle, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+methods+for+yeast.">Fluorescence microscopy methods for yeast.</a> Methods Cell Biol. 31, 357-435 (1989).</li><li>Baxi, K., Ghavidel, A., Waddell, B., Harkness, T. A., de Carvalho, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Lysosomal+Function+by+the+DAF-16+Forkhead+Transcription+Factor+Couples+Reproduction+to+Aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulation of Lysosomal Function by the DAF-16 Forkhead Transcription Factor Couples Reproduction to Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 207 (1), 83-101 (2017).</li><li>Colacurcio, D. J., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+of+lysosomal+acidification-The+emerging+role+of+v-ATPase+in+aging+and+neurodegenerative+disease.">Disorders of lysosomal acidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease.</a> Ageing Res Rev. 32, 75-88 (2016).</li><li>Kang, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screening+identifies+ATM+as+a+target+for+alleviating+senescence.">Chemical screening identifies ATM as a target for alleviating senescence.</a> Nat Chem Biol. 13 (6), 616-623 (2017).</li><li>Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+formation+reduces+levels+of+mutant+huntingtin+and+the+risk+of+neuronal+death.">Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death.</a> Nature. 431 (7010), 805-810 (2004).</li><li>Brunk, U. T., Terman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial-lysosomal+axis+theory+of+aging:+accumulation+of+damaged+mitochondria+as+a+result+of+imperfect+autophagocytosis.">The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis.</a> Eur J Biochem. 269 (8), 1996-2002 (2002).</li><li>Gerland, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autolysosomes+accumulate+during+in+vitro+CD8++T-lymphocyte+aging+and+may+participate+in+induced+death+sensitization+of+senescent+cells.">Autolysosomes accumulate during in vitro CD8+ T-lymphocyte aging and may participate in induced death sensitization of senescent cells.</a> Exp Gerontol. 39 (5), 789-800 (2004).</li><li>Poon, H. F., Vaishnav, R. A., Getchell, T. V., Getchell, M. L., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+analysis+of+differential+protein+expression+and+oxidative+modification+of+specific+proteins+in+the+brains+of+old+mice.">Quantitative proteomics analysis of differential protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice.</a> Neurobiol Aging. 27 (7), 1010-1019 (2006).</li><li>Yin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+basis+of+lipofuscin,+ceroid,+and+age+pigment-like+fluorophores.">Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores.</a> Free Radic Biol Med. 21 (6), 871-888 (1996).</li><li>Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reduction+in+intestinal+cell+pHi+due+to+loss+of+the+Caenorhabditis+elegans+Na+/H++exchanger+NHX-2+increases+life+span.">A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44657-44666 (2003).</li><li>Chakraborty, K., Leung, K., Krishnan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+lumenal+chloride+in+the+lysosome+is+critical+for+lysosome+function.">High lumenal chloride in the lysosome is critical for lysosome function.</a> Elife. 6, (2017).</li></ol>

Uma variedade de eventos celulares e moleculares contribuem para o envelhecimento, influenciado pela história de vida características e fatores genéticos. Nosso recente estudo22 sugere que o ciclo reprodutivo desempenha um papel importante no controle da aptidão da soma através da regulamentação da dinâmica dos lisossomos pH. Nós mostramos que a proteólise lisossomal mediada é promovido enquanto animais reproduzem-se ativamente por upregulation de transcrição v-ATPase, que por sua vez...

A aparência de agregados de proteínas é amplamente aceito para ser uma marca registrada de envelhecimento em pilhas eukaryotic1,2,3e a formação do que é pensado para estar entre os condutores de princípio da senescência celular4 , 5 , 6 , 7. há evidência crescente que, como células de idade catabolismo proteico é prejudicado, levando a um aumento na agregação da proteína. O colapso da proteólise em células de envelhecimento envolve uma imparidade de autofagia8 , bem como a degradação de proteínas mediada por Proteassoma9. Finalmente, oxidação de proteínas irreversível é aumentada em células velhas, prejudicando ainda mais o catabolismo de proteína10.
Autofagia foi inicialmente pensada para ser um processo não-seletivo para degradação em massa de proteínas danificadas, mas estudos recentes têm indicado que autofagia é altamente seletiva para o catabolismo de agregados de proteínas e organelas disfuncionais que não são passível de degradação através de de mecanismos de autorização outros proteína11. Durante o processo de autofagia, proteínas danificadas e agregadas são isoladas em uma vesícula de dupla membrana chamada o autophagosome. Este autophagosome então funde-se com as organelas ácidas chamadas lisossomos, o que leva à degradação do autophagosome carga12. Lisossomos representam o ponto de extremidade da via autophagic e participarem de diferentes processos celulares, tais como a reparação da membrana, controle transcricional e detecção de nutrientes; destacando seu papel centralizado na homeostase celular (revisto em ref. 13). Vários estudos têm demonstrado uma associação entre uma redução dependente da idade na função dos lisossomos e várias de doenças neurodegenerativas13. Consistentemente, restaurando a função dos lisossomos em células mais velhas pode retardar o aparecimento de fenótipos relacionadas ao envelhecimento14,15. Estudos da composição do meio de intralumen sugerem que o colapso da função dos lisossomos em células mais velhas não é devido a uma redução na produção de proteases lisossomais16. Como alternativa, tem sido proposto que perda da acidez intralysosomal, um requisito fundamental da sua actividade enzimática, pode fundamentam a diminuição da proteólise mediada por lisossoma17. Para ser capaz de explorar essa hipótese, é essencial desenvolver protocolos para sondar mudanças dinâmicas no pH dos lisossomos em células vivas de uma forma consistente e replicável e reagentes.
O intestino de c. elegans é o principal tecido metabólico em worms e é um crítico regulador da homeostase sistêmica e vida útil. Temos desenvolvido ensaios para avaliar alterações na acidez do lúmen de lisossomos intestinais de worms para determinar como mediada por lisossoma proteólise contribui para o envelhecimento. Embora sensíveis ao pH fluorophores têm sido utilizados anteriormente em c. elegans para marcar lisossomos intestinais, ainda não houve um esforço para estabelecer um protocolo bem sucedido que pode detectar pequenos aumentos no pH dos lisossomos na vivo18.. Aqui, nós fornecemos um protocolo que pode ser usado para detectar a perda da acidez dos lisossomos em células intestinais de c. elegans usando um protocolo de alimentação simples e conveniente que incorpora um fluoróforo sensíveis ao pH (cDCFDA) OP50 comida.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1166">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:475px;">OP50 (E. coli)</td>
			<td style="width:188px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:385px;">Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">5(6)-carboxy-2&#8217;,7&#8217;-dichlorofluorescein diacetate&#160;</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">C369</td>
			<td>Commonly known as cDCFDA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:475px;">9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">L7528</td>
			<td>Commonly known as Lysotracker Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510)</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">ImageJ</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">LB Broth powder</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">22700041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Bacto Agar</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5306-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">NaCl</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Bacto Peptone</td>
			<td style="width:188px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S71604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Cholesterol powder</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3045&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">CaCl2</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">449709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">MgSO4</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">K3PO4</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">DMSO</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:188px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Cover Slips</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">3406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Agarose</td>
			<td style="width:188px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Incubator</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Mirror or other smooth flat surface</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing lysosomal alkalinization in the intestine of live caenorhabditis elegans

O nemátodo Caenorhabditis elegans (c. elegans) é um sistema de modelo que é amplamente utilizado para estudar a longevidade e os caminhos do desenvolvimento. Tais estudos são facilitados pela transparência do animal, a capacidade de transmitir e reverter ensaios genéticos, a relativa facilidade de gerar proteínas fluorescente etiquetadas e o uso de corantes fluorescentes que podem também ser injetadas no início embrião ou incorporados em seu alimento (e. coli estirpe OP50) para rotular organelas celulares (por exemplo, 9-dietilamino-5h-benzo (a) phenoxazine-5-1 e (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Aqui, apresentamos o uso de um corante fluorescente de sensíveis ao pH que manchas lisossomos intestinais, fornecendo uma leitura visual de alterações fisiológicas, dinâmicas na acidez dos lisossomos em worms ao vivo. Este protocolo não mede pH dos lisossomos, mas prefiro visa estabelecer um método confiável de avaliação fisiológicas relevantes variações na acidez dos lisossomos. cDCFDA é um célula-permeant composto que é convertido para o fluorescente fluoróforo 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) após hidrólise por esterases intracelulares. Protonação dentro de lisossomos armadilhas cDCF nestas organelas, onde se acumula. Devido a sua baixa pKa de 4.8, esse corante tem sido usado como um sensor de pH no fermento. Aqui nós descrevemos o uso de cDCFDA como suplemento alimentar para avaliar a acidez dos lisossomos intestinais em c. elegans. Esta técnica permite a detecção de lisossomos alcalinizante em animais vivos,, e tem uma ampla gama de aplicações experimentais, incluindo estudos sobre envelhecimento, autofagia e biogênese dos lisossomos.

cDCFDA manchas de lisossomos em uma maneira dependente do pH, e seu pKa baixo e captação pronta em lisossomos torna um sensor de pH ideal21. cDCFDA intensidade de coloração é inversamente proporcional dos lisossomos pH (ou seja, coloração aumentos de intensidade como pH diminui)18,22. os sinais cDCFDA são consistentemente fracos lisossomos de animais tratados com 20mm de cloroquina, um inib...

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Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Um guia passo a passo para sondar a perda da acidez dos lisossomos no intestino de c. elegans usando o corante vital sensíveis ao pH 6 - carboxi - 2', 7'-diclorofluoresceína diacetato (cDCFDA)

Avaliação dos lisossomos Alkalinization no intestino de viver elegans de Caenorhabditis

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

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Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Biologia do Desenvolvimento

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

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Espaciais e temporais Análise do Active ERK na<em&gt; C. elegans</em&gt; germinativa

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

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In Vitro Ovule cultivo para viver-pilha de imagem do zigoto polarização e padronização do embrião em Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

O c. elegans intestino como um modelo para intercelular Lumen morfogênese e In Vivo biogênese de membrana polarizada no nível de célula única: rotulagem por anticorpos, RNAi perda--função de análise e de imagem

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Imobilização de Caenorhabditis elegans , para analisar o transporte intracelular nos neurônios

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Aplicação de RNAi e calor-choque-induzida expressão de fator de transcrição para reprogramar as células germinativas de neurônios em c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Estudando estresse oxidativo causado pelo estreptococos grupo Mitis em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Microscopia de folha de luz isotrópica e análise de linhagem de células automatizadas para catalogar Caenorhabditis elegans Embryogenesis com resolução subcelular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...