Name: development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;
Uploaded: 2018-06-14T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃŽÂ± at JoVE.com

DD ويجك الاعتراف بدعم من وكالة الاستخبارات الوطنية (مشروع إيفنكس، لا. CE17001002) وإيمونوكوري AG لتوفير الأجسام المضادة. نشكر بريجيت بدر-مونير بيلون ناثاليا، كريستين بودمر، بيلو أليكس، ملكي إيزابيل وكارتر بيير لتقديم العينات السريرية. يجك يقر "مجلس البحوث الأوروبي" (GA 309449: الزمالات إلى يجك)، وإعانة دولة تديرها الوكالة الوطنية للبحوث (فرنسا) ضمن برنامج "الاستثمار من أجل المستقبل" إذ تضع الإشارة ANR-10-إياهو-01.

<ol>
	<li>Isaacs, A., Lindenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classics+in+Oncology+Virus+Interference:+I.+The+Interferon.">Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).</li><li>Isaacs, A., Lindenmann, J., Valentine, R. C., Alerts, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pillars+Article:+Virus+Interference.+II.+Some+Properties+of+Interferon.">Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).</li><li>Hunt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombotic+Microangiopathy+Associated+with+Interferon+Beta.">Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta.</a> N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).</li><li>Hooks, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Interferon+in+the+Circulation+of+Patients+with+Autoimmune+Disease.">Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease.</a> N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).</li><li>Greenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-alpha/beta+Mediated+Innate+Immune+Mechanisms+in+Dermatomyositis.">Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis.</a> Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).</li><li>Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+interferonopathies+a+novel+set+of+inborn+errors+of+immunity.">Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).</li><li>Rodero, M. P., Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+interferon+-+mediated+monogenic+autoinflammation:+The+type+I+interferonopathies,+a+conceptual+overview.">Type I interferon - mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview.</a> J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).</li><li>Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+biological+assay+for+interferons.">A sensitive biological assay for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).</li><li>Meager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+assays+for+interferons.">Biological assays for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).</li><li>Hua, J., Kirou, K., Lee, C., Crow, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Assay+of+Type+I+Interferon+in+Systemic+Lupus+Erythematosus+Plasma+and+Association+With+Anti+-+RNA+Binding+Protein+Autoantibodies.">Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti - RNA Binding Protein Autoantibodies.</a> Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).</li><li>Niewold, T. B., Kariuki, S. N., Morgan, G. A., Shrestha, S., Pachman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+serum+interferon-alpha+activity+in+juvenile+dermatomyositis:+associations+with+disease+activity+at+diagnosis+and+after+thirty-six+months+of+therapy.">Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy.</a> Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).</li><li>Seo, Y., Kim, G., Kwak, H., Nam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+HeLa+Mx2+/+Luc+Reporter+Cell+Line+for+the+Quantification+of+Human+Type+I+Interferons.">Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons.</a> Pharmacology. 84, 135-144 (2009).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+surface+expression+of+Fc&#947;+receptor+RI+(+CD64+),+a+biomarker+reflecting+type-I+interferon+levels+in+systemic+lupus+erythematosus.">Monocyte surface expression of Fc&#947; receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).</li><li>Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Vesicular+Stomatitis+Virus+Replicon-Based+Bioassay+for+the+Rapid+and+Sensitive+Determination+of+Multi-Species+Type+I+Interferon.">A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon.</a> PLoS One. 6, e25858 (2011).</li><li>Rissin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assay+detects+serum+proteins+at+subfemtomolar+concentrations.">Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations.</a> Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).</li><li>Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+array+(Simoa)+assay+with+optimal+antibody+pairs+for+cytokine+detection+in+human+serum+samples.">Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples.</a> R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).</li><li>Simoa. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+Principle+of+SimoaTM+(Single+Molecule+Array)+Technology.">Scientific Principle of SimoaTM (Single Molecule Array) Technology.</a> Whitepaper 1.0. , 1-2 (2013).</li><li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assays+Theoretical+considerations.">Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations.</a> J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).</li><li>Yeung, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+highly+sensitive+immunoassay+technologies+for+quantitative+measurements+of+sub-pg+/+mL+levels+of+cytokines+in+human+serum.">Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum.</a> J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+measurements+of+tumor+necrosis+factor+&#945;+and+interleukin-6+in+the+plasma+of+patients+with+Crohn's+disease.">Single molecule measurements of tumor necrosis factor &#945; and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease.</a> J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).</li><li>Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Changes+of+Post-Translationally+Modified+Forms+of+CXCL10+and+Soluble+DPP4+in+HCV+Subjects+Receiving+Interferon-Free+Therapy.">Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy.</a> PLoS One. 10, e0133236 (2015).</li><li>Decalf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+DPP4+activity+in+humans+establishes+its+in+vivo+role+in+CXCL10+post-translational+modification:+prospective+placebo-controlled+clinical+studies.">Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies.</a> EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).</li><li>Rabing Brix Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+in+plasma+from+patients+with+diabetic+retinopathy+-+development+and+validation+of+digital+ELISA+by+Single+Molecule+Array+(Simoa)+technology.">Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy - development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology.</a> J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).</li><li>Disanto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+Neurofilament+Light:+A+Biomarker+of+Neuronal+Damage+in+Multiple+Sclerosis.">Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis.</a> Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+ultrasensitive+measurement+of+amyloid-+&#946;+1+-+42+peptide+in+human+plasma+with+utility+for+studies+of+Alzheimer's+disease+therapeutics.">A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- &#946; 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics.</a> Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).</li><li>Passaes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+HIV-1+p24+Assay+Detects+Single+Infected+Cells+and+Differences+in+Reservoir+Induction+by+Latency+Reversal+Agents.">Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents.</a> J. Virol. 91, e02296 (2017).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Detection+of+Bacterial+Genomic+DNA+at+Sub-Femtomolar+Concentrations+Using+Single+Molecule+Arrays.">Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays.</a> Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).</li><li>Cohen, L., Hartman, M. R., Amardey-wellington, A., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+direct+detection+of+microRNAs+using+single+molecule+arrays.">Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays.</a> Nucleic Acids Res. 45, e137 (2017).</li><li>Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AIRE-Deficient+Patients+Harbor+Unique+High-Affinity+Disease-Ameliorating+Autoantibodies.">AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies.</a> Cell. 166, 582-595 (2016).</li><li>Simoa. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homebrew+Assay+Development+Guide.">Homebrew Assay Development Guide.</a> Simoa HD-1 Analyzer &amp; Quanterix SR-X. User-0021 08. , (2017).</li><li>Rodero, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+interferon+alpha+protein+reveals+differential+levels+and+cellular+sources+in+disease.">Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease.</a> J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).</li><li>Pleil, J., Angrish, M., Madden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemistry+for+high-throughput+screening+of+human+exhaled+breath+condensate+(EBC)+media+implementation+of+automated+Quanterix+SIMOA+instrumentation.">Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation.</a> J. Breath Res. 9, 047108 (2015).</li><li>Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Proteomic+Strategy+for+Clinical+Biomarker+Discovery.">Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery.</a> Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).</li><li>Wilson, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Simoa+HD-1+Analyzer:+A+Novel+Fully+Automated+Digital+Immunoassay+Analyzer+with+Single-Molecule+Sensitivity+and+Multiplexing.">The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing.</a> J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).</li><li>Rivnak, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully-automated,+six-plex+single+molecule+immunoassay+for+measuring+cytokines+in+blood.">A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood.</a> J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).</li><li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Plasma+Proteome.+History,+character,+and+diagnostic+prospects.">The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).</li><li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISA+in+the+multiplex+era:+Potentials+and+pitfalls.">ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls.</a> Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

هنا، نحن ووصف التنمية والتحقق جزيء واحد استنساخه بدرجة عالية، أولتراسينسيتيفي صفيف أليسا الرقمية للقياس الكمي المباشر من البروتين IFN-α في العينات البشرية (الخطوات الملخصة في الجدول 1). إحدى الخطوات الأكثر أهمية في التنمية للفحص هو اختيار جسم زوج16، مع الخصائص من حيث الحركية وملزمة حانمه يجري مفتاح مقايسة ناجحة. من المهم تجنب استخدام مقترن بالأجسام المضادة التي تستهدف حانمه نفسه أو التي تسبب عائق الفراغية. [بولكلونل] أجسام يمكن أن تستعمل كالكشف عن الأجسام المضادة للتغلب على هذه القيود. وإذا لم يتحقق في أي خطوة معينة حساسية المرجوة، كذلك ينبغي النظر إمكانيات التحسين. وقد يشمل استخدام أزواج جسم البديلة، وتغييرات في بارامترات مثل نوع البروتين (مثل جيش صرب البوسنة < الكازين)، الأس الهيدروجيني (6.0-8.5) والقوة الأيونية وقدرة التخزين المؤقت (مثل تركيزات كلوريد الصوديوم والفوسفات)، الخرز الناقل، أو وجود التوتر السطحي. طائفة واسعة من المعلمات يخدع الأمثل عند وضع مقايسة صفيف جزيء واحد. ومع ذلك، عموما، الشروط التي إعطاء نسب عالية إشارة: الخلفية ولودس الحد الأدنى هي تلك التي تفضل (انظر الشكل 1و الشكل 2و الشكل 3).
فيما يتعلق بخصوصية، أظهر الفحص IFN-α اختبار لا تفاعلية عبر لأي ايفنس الأخرى (β، γ، λ1، λ2، ω) (الشكل 4 أ) وكان قادراً على الكشف عن جميع أنواع فرعية IFN-α 13 (الشكل 4 باء). بيد أن التحليل أظهر تقارب أدنى للنوع الفرعي IFN-α2، (الشكل 4 باء و التكميلية الجدول 4). من المثير للاهتمام، حساسيات مختلفة لفئات مختلفة من IFN-α2 (أ، ب، ج) ولوحظت أيضا، الذي قد يكون بسبب إجراءات التصنيع متميزة أو تسلسل الأحماض الأمينية المختلفة، كما تم الحصول على الأنواع الفرعية IFN-α2 من التجارية المختلفة الموردين. مع هذا الاستثناء الوحيد، أعطى جميع الأنواع IFN-α الردود متشابهة جداً. وتجلى خصوصية المقايسة كذلك المعالجة المسبقة للعينات مع مكافحة-إيفن-α استنساخ، الذي ألغى الإشارة (الشكل 6 و التكميلية الجدول 6).
واحدة من المزايا الرئيسية لهذه التكنولوجيا أن أي أكثر من الفائدة يمكن أن يحتمل أن تكون مستهدفة16. وعلاوة على ذلك، يمكن اختبار العينات البيولوجية المختلفة، مثل المصل والبلازما والسائل الدماغي النخاعي، ليساتيس الخلوية، supernatants ثقافة31 والتنفس حتى32. عادة، يتم إضعاف 1:3 من البلازما لتجنب انسداد المحتملة من محلل الصفيف جزيء واحد. ومع ذلك، أكثر الفائدة يمكن أن تكون موجودة بتركيزات منخفضة جداً في العينة البيولوجية ذات الصلة وقد تكون تركيزات أعلى من العينة المطلوبة (اعتماداً على تحليل الحساسية)33. على الرغم من أن هناك إمكانية للإرسال المتعدد مع الحفاظ على حساسية جيدة34، هو عملية أكثر تحديا وفحوصات لقياس أكبر من 6 البروتينات داخل نفس التجارب بعد أن وضعت35.
القدرة على كشف وتحديد السيتوكينات والبروتينات البيولوجية الأخرى ذات الصلة مثل تركيزات منخفضة يفتح مجموعة جديدة كاملة من التطبيقات33،36. فمن المعروف جيدا أن بروتينات عديدة تمارس آثارها حتى بتركيزات منخفضة جداً، التي كانت أقل من الحد من الكشف عن اليساس أفضل37حتى الآن. بينما توفر تكنولوجيات المناعة الأخرى مزايا أكثر تقليدية أليسا19، نثبت هنا أن جزيء واحد صفيف رقمي أليسا منصة استنساخه وقوية للكشف عن أولتراسينسيتيفي السيتوكينات التركيز المنخفض في العينات البشرية. على هذا النحو، تتيح هذه التكنولوجيا إمكانات هائلة لاكتشاف العلامات البيولوجية وتحسين إدارة المريض لمجموعة واسعة من الأمراض.

النوع الأول ايفنس هي عائلة السيتوكينات التي تلعب دوراً محوريا في تنسيق الاستجابات المناعية المضادة للفيروسات. أنها كانت أول من اكتشف إيزاك و 60 ليندنمان منذ سنوات1،2 ، ومن المعروف الآن أن هذه الأسرة غير متجانسة من البروتينية وتضم 14 فئات فرعية مختلفة (13 IFN-α المخططات و 1 IFN-β). نوع أنا ايفنس ضرورية لإزالة الألغام العدوى الفيروسية، ولكن أيضا قد تورط في علم الأمراض من مجموعة متنوعة من الدول الأمراض البشرية، بما في ذلك أمراض المناعة الذاتية الذئبة الحمامية الجهازية (SLE)، التهاب الأحداث (JDM)، ونوع أنا إينتيرفيرونوباثيس في نوع التأسيسي الذي أنا المستحثة IFN مما يشير إلى النتائج في علم الأمراض3،،من45،،من67.
دراسة النوع الأول من البروتين إيفن المستويات في العينات البيولوجية منذ تحديا لها أولية لتحديد الهوية كوسيلة "التدخل في مضمون"1،2. حاليا، ساندويتش Enzyme-Linked المرتبط بالانزيم (ELISA) هو الأسلوب الأكثر استخداماً للكشف عن البروتين IFN-α. وعلى الرغم من كونها محددة وبسيطة وسريعة، النوع الأول الساس IFN هذه القيود الهامة، مثل حساسية محدودة. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب قياس جميع أنواع فرعية IFN-α استخدام فحوصات متعددة كل مع قدرات الكشف والحساسية الخاصة. في حين هناك اليساس التجارية التي تكشف عن أنواع فرعية مختلفة من IFN-α، حساسيتها يقتصر (1.95 بيكوغرام/مل، 12.5 بيكوغرام/مل، و 12.5 بيكوغرام/مل، على التوالي) وهو غالباً غير كافية للكشف عن البروتين IFN-α في العينات البيولوجية. للتغلب على هذا التحديد، الوكيل البيولوجية عدة وضعت فحوصات لتحديد النوع الأول IFN بقياس التعبير الجيني المستحث أو النشاط الوظيفي8،،من910،11، 12 , 13 , 14-ومع ذلك، لا توفر هذه الاختبارات قياس مباشر للبروتين IFN-α.
في هذه الدراسة، استخدمت جزيء واحد صفيف رقمي أليسا التكنولوجيا لتطوير فحص للكشف عن الجزيئات البروتينية IFN-α واحد. أليسا الرقمية تستخدم في الكيمياء الأساسية نفسها أليسا التقليدية، بيد أن رد فعل يحدث في صفائف تضم 50,000 الفردية 46 فيمتوليتير الحجم الآبار15،16. استولت عليها الخرز باراماجنيتيك المغلفة بالأجسام المضادة جزيئات البروتين وحيد والمسمى بجسم كشف بيوتينيلاتيد، تليها ملزمة إنزيم المتقارن، ستريبتافيدين-β-جالاكتوسيداسي (SBG). في وقت لاحق، يتم تعليق الخرز مع الركازة إنزيم فلوروجينيك، ريسوروفين-β-د-جالاكتوبيرانوسيدي (RGP)، إلى صفائف جزيء واحد. بتقليل الحجم رد فعل 2 مليار مرة17، ارتفاع تركيز محلية إشارة الفلورسنت ويتحقق والتهم جزيء واحد يصبح ممكناً، كما يولد كل جزيء إشارة بأن الآن يمكن أن تكون موثوق بها قياس18. في جوهرها صفائف جزيء واحد قادرة على عد إيمونوكومبليكسيس واحدة وتحديد عدد متوسط من الإنزيمات كل حبة (AEB). عد ميكروويلس التي تم الكشف عن إشارة تصاريح الكمي/ترقيم جزيئات البروتينية، كما أن هناك علاقة طردية بين تركيز البروتين والنسبة بين إيمونوكومبليكسيد-الخرز وعدد إجمالي من الخرز موجودة في الدوائر الحجم فيمتوليتير.
يونغ وآخرون. إجراء دراسة تقييمية عبر منصة واسعة النطاق باستخدام تكنولوجيات مختلفة تسعة وأربعة سيتوكين تحديدكم بهدف مقارنة الدقة المقايسة، وحساسية، وترابط البيانات عبر منصات مختلفة19. وكان من النتائج الرئيسية للدراسة أن تعرض صفائف جزيء واحد وجزيء واحد عد المناعة حساسية أعلى للكشف عن السيتوكينات في مصل الدم البشري ضمن نطاق التركيز sub-pg/mL. جزيء واحد صفيف رقمي أليسا سيتوكين فحوصات قد استخدمت لدراسة دور تنف-α، وايل-6 في كرون المرض20, IFN-α في إينتيرفيرونوباثي و 7من مرضى المناعة الذاتية، ومختلف بوستترانسلاتيونالي تعديل أشكال ج-س-ج تشيموكيني عزر 10 (CXCL10) في الالتهاب الكبدي المزمن والمانحين صحي تلقي سيتاجليبتين21،22. وتشمل التطبيقات الأخرى قياس رودوبسين في المرضى الذين يعانون من اعتلال الشبكية السكري23؛ دراسة أمراض المخ من خلال قياسات نيوروفيلامينت المصل/بلازما الضوء24 واميلويد-β 1-42 الببتيد25، في السياق من التصلب المتعدد، ومرض الزهايمر، على التوالي. يمكن أيضا استخدام فحوصات الصفيف جزيء واحد للكشف عن العوامل الممرضة تحسين مثل وصف ل خزان الفيروسية فيروس نقص المناعة البشرية26، وأيضا للكشف عن الحمض النووي27 والصغرى الكشف28. ميزة رئيسية لهذه التكنولوجيا صفيف جزيء واحد هو هذا التنوع عالية، كما يمكن تطويرها مقايسة ضد أي أكثر من الفائدة إذا كان زوج جسم محدد متوفراً. وباﻹضافة إلى ذلك، البيرة المقايسة مجموعات متاحة تجارياً، مما يتيح تطوير فحوصات جديدة، البروتوكول الذي مفصل في شكل معدل أدناه.
هنا، يقدم وصفاً مفصلاً للخطوات الإنمائية والتحقق من الصحة مقايسة صفيف جزيء واحد تلك النتائج في زيادة حساسية للكشف عن البروتين IFN-α. ينبغي أن تكون الأجسام المضادة لجزيء واحد الصفيف فحوصات محددة للغاية، تجنب عبر التفاعل مع البروتينات ذات الصلة (مع خصوصية الأنواع النظر إذا كان ذات الصلة). ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تختار الأجسام المضادة مع كد أصغر من 10-9 م؛ ويضمن عالية تقارب ملزمة قوية، مع إنتاج إشارة أعلى. حركية جسم مضاد-مستضد ملزمة أيضا هامة وسريعة كعلى وك بطءقبالة سوف يفضلون الجمعية ضد مستضد المعقدة. بدءاً زوج جسم يحتوي على أداء جيد في أليسا الكلاسيكية، مع حد من الكشف عن (اللد) من 1-100 بيكوغرام/مل، يزيد من فرص الحصول على مقايسة صفيف جزيء واحد حساسة للغاية. تشانغ والزملاء إجراء دراسات تفصيلية الحركية التفاعلات الجزيئية البيولوجية التي تحدث في كل خطوة، تقترح مجموعة من المعادلات للتنبؤ بالحساسية التحليلية18. أنها أظهرت أن الصفيف جزيء واحد يبدو أن أليسا الرقمية فعالة ضمن طائفة واسعة من الانتماءات جسم (دينار كويتي ~ 10−11 -109 م)، فضلا عن توليد إشارة أن أكثر اعتماداً على معدل هذه الأجسام المضادة.
للاستفادة من تقارب عالية نوع الأجسام المضادة ونحن استغل الأجسام المعزولة من المرضى الذين يعانون من متلازمة المناعة الذاتية بولييندوكرينوباثي ضمور 1/المناعة الذاتية بولييندوكرينوباثي-داء المبيضات-الأدمة (APS1/أبيسيد)29. ولأسباب غير مفهومة بعد، الغالبية العظمى من الأفراد إير التي تفتقر إلى وضع مجموعة أساسية عالية-اللذة الأجسام المضادة ضد جميع أنواع فرعية IFN-α29، واخترنا استنساخ الأجسام المضادة-إيفن-α اثنين من الانتماءات الملزمة التكميلية لمختلف المخططات IFN-α، حسب تقديرات القيم50 IC. المزيج من هذه الأجسام المضادة عالية تقارب فريدة من نوعها مع التكنولوجيا صفيف جزيء واحد تمكين التحديد الكمي المباشر ل IFN-α في تركيزات أتومولار (جي/mL). مثل الكشف عن البروتين IFN-α أولتراسينسيتيفي سوف تسهم في فهم أفضل لطبيعة وتنظيم والأثر البيولوجي استجابة المستحثة IFN في إعدادات مختلفة من المرض.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody A (8H1 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody B (12H5 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody EBI-1 clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody BMS216BK clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216BK</td>
			<td>Not an ELISA kit but bulk abs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2c</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS305</td>
			<td>OK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;I (17)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2b</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;1</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11175-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4a (M1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4b (a4)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11180-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;B2 (a8)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11115-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;C (a10)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;D (a1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11125-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;G (a5)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11135-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;F (a21)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11130-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;H2 (a14)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;J1 (a7)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11160-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;K (a6)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11165-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;WA (a16)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11190-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#969;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#946;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; ELISA</td>
			<td>PBL</td>
			<td>41115.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISRE-Reporter</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>CCS-008L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fu-GENE HD Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Mediuem</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40 Substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer NanoDrop 1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtres</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC505096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Conjugation Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Encoded Paramagnetic Beads</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Wash Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11844071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Blocking Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Diluent Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector and Sample Diluent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylation Reaction Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11891195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>MS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa) reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBG, Bead and Detector Barcode Labels</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Reagent Bottles</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa specimen 96-well plates</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Discs</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa 2.0 conductive Tips</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Cuvettes</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa SBG Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa RGP Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 1</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 2</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing Oil</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa HD-1 Analyzer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa)</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems</td>
			<td>Singluex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;

والهدف الرئيسي من هذا البروتوكول وصف التنمية والتحقق من انترفيرون (IFN)--الصفيف بجزيء واحد α الرقمية الإنزيم Enzyme-Linked المرتبط بالانزيم (ELISA). هذا النظام يتيح التحديد الكمي للبشرية IFN-α البروتين مع حساسية لم يسبق لها مثيل، ومع لا ه للأنواع الأخرى من إيفن.
الخطوة الرئيسية الأولى للبروتوكول هو اختيار الزوج جسم، تليها تصريف جسم التقاط الخرز باراماجنيتيك، وبيوتينيليشن الكشف عن الأجسام المضادة. وبعد هذه الخطوة، يمكن تعديل معلمات مختلفة مثل تكوين المقايسة وتركيز الأجسام المضادة للكشف عن تكوين المخزن المؤقت حتى يتم تحقيق أمثل حساسية. وأخيراً، يتم تقييم خصوصيتها وإمكانية تكرار نتائج أسلوب لضمان الثقة في النتائج. وهنا، وضعنا مقايسة صفيف جزيء واحد IFN-α مع حد من الكشف عن مليلتر fg 0.69 استخدام الأجسام المضادة عالية تقارب المعزولة من المرضى مع الطفرات بياليليك في البروتين منظم المناعة الذاتية (إير) مما تسبب في بولييندوكرينوباثي الذاتية متلازمة نوع 1/المناعة الذاتية بولييندوكرينوباثي-داء المبيضات-الأدمة الضمور (APS1/أبيسيد). الأهم من ذلك، أن هذه الأجسام المضادة تمكين الكشف عن جميع الأنواع الفرعية IFN-α 13.
هذه المنهجية الجديدة تسمح بالكشف والتحديد الكمي للبروتين IFN-α في العينات البيولوجية البشرية في تركيزات أتومولار للمرة الأولى. هذه أداة سوف تكون مفيدة للغاية في رصد مستويات هذا سيتوكين في صحة الإنسان والمرض الدول، معظم خاصة العدوى والمناعة الذاتية، وأوتوينفلاميشن.

وباختصار، المغلفة مقايسة صفيف عموم-إيفن-α جزيء واحد مع حد كشف 0.69 fg/مل، استخدام تكوين 2-خطوة بالتقاط حبات مع 0.3 ملغ/مل من مكافحة-إيفن-α الأجسام المضادة ومكافحة-إيفن-α ب الكشف عن الأجسام المضادة بيوتينيلاتيد بنسبة بيوتين: جسم وقد وضعت 30. وكانت التركيزات المستخدمة في بيوتينيلاتيد الكشف عن الأجسام المضادة و SBG 0.3 ميكروغرام/ملليلتر و 150 م، على التوالي. قادر على كشف جميع المخططات IFN-α 13 هذه المقايسة محددة للغاية ولا عبر التفاعل مع نوع آخر من ايفنس. وهكذا، حين أنه ليس من الممكن تحديد وقياس كل الأنواع الفردية من IFN-α، كل منهم يمكن اكتشاف وقياس معا إعطاء قيمة تركيز الكلي ل IFN-α، التي تضم مختلف الفئات الفرعية 13.
لاستكشاف القيمة التشخيصية المحتملة لهذا التحليل وضعت حديثا، IFN-α البروتين في البلازما والمصل من الأشخاص الأصحاء قياس ومقارنة مع عينات من المرضى الذين يعانون من مرض الذئبة الحمراء و JDM. كما هو موضح في الشكل 7، تم اكتشاف مستويات عالية من البروتين IFN-α في كلا الأفواج المرض مقارنة بضوابط صحية. يشير الخط المنقط في اللد إليزا المتاحة تجارياً التقليدية، التي توضح كيفية هذا النهج سوف لا يكشف البروتين IFN-α في هذه المجموعات المريض على الرغم من الجمعيات المعروفة لهذا سيتوكين مع هذه تعمل. وعلاوة على ذلك، يمكن كمياً IFN-α على سجلات 5 من حجمها، وتوضح دينامية واسعة النطاق للمقايسة، مع مستويات ملحوظة بين 1-10 إف جي مليلتر يؤكد طبيعة حساسة للغاية المقايسة.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57421/57421fig7.jpg"> رقم 7: التقدير الكمي للبروتين IFN-α في البلازما والمصل من الأفواج المريض. وقد تم تعديل هذا الرقم من روديرو et al. 2017. البلازما من ضوابط صحية (n = 20)، والمرضى الذين يعانون من مرض الذئبة الحمراء (ن = 72) و JDM (ن = 43) تم اختباره مع المقايسة الصفيف جزيء واحد عموم--IFNα. تم إجراء تحليل استخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه (كروسكال-واليس) ودن لمقارنة عدة اختبار بين المجموعات. الوسيط هو مبين. خط منقط يشير إلى اللد أليسا المضادة-إيفن-α البشرية الإشارة (1.95 بيكوغرام/مل = 1950 جي/mL). <a href="/files/ftp_upload/57421/57421fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>الخطوة</td>
			<td>الاعتبارات</td>
			<td>مرجع</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1-جسم اختيار الزوج</td>
			<td>الهدف مختلفة [ابيتوبس]</td>
			<td rowspan="3">الجدول 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>تقارب عالية</td>
		</tr>
<tr>
<td>سريع كفي /"ك بطء"قبالة
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2-جسم الزوج التوجه</td>
			<td rowspan="3">اختر شروط مع حد أدنى "للكشف عن"</td>
			<td rowspan="3">الشكل 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3-التقاط تركيز الأجسام المضادة</td>
		</tr>
<tr>
<td>4-البيوتين: الكشف عن نسبة الأجسام المضادة</td>
		</tr>
<tr>
<td>5-2 مقابل التكوين الخطوة 3</td>
			<td>اختر الشرط مع أعلى نسبة إشارة: معلومات أساسية</td>
			<td>الشكل 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6-الكشف عن الأجسام المضادة تركيز</td>
			<td rowspan="2">اختر شروط مع حد أدنى "للكشف عن"</td>
			<td rowspan="2">الشكل 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>7. تركيز [سبغ]</td>
		</tr>
<tr>
<td>8-خصوصية</td>
			<td>تقييم ه</td>
			<td rowspan="2">الشكل 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9-الحساسية</td>
			<td>تقييم الاعتراف بالأنواع الفرعية (أن وجد)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10-إمكانية تكرار نتائج</td>
			<td>تقييم تقلب الإنزيم</td>
			<td>الشكل 5</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: موجز للخطوات الرامية إلى التنمية والاستغلال الأمثل للمقايسة الصفيف جزيء واحد- يلخص هذا الجدول مختلف الخطوات اللازمة لتطوير والتحسين مقايسة الصفيف جزيء واحد، من اختيار الزوج جسم حتى تقييم إمكانية تكرار نتائج أولية.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>مستضد</td>
			<td>8 ح 1 (A)</td>
			<td>12 ح 5 (ب)</td>
			<td>سيفاليموماب</td>
			<td>رونتاليزوماب</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ1</td>
			<td>28.3</td>
			<td>51.3</td>
			<td>460</td>
			<td>22.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ2</td>
			<td>2563</td>
			<td>10.7</td>
			<td>9.02</td>
			<td>2.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ4</td>
			<td>5.11</td>
			<td>2.99</td>
			<td>35.35</td>
			<td>325.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ5</td>
			<td>2.01</td>
			<td>19.6</td>
			<td>93.29</td>
			<td>2.49</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ6</td>
			<td>64.7</td>
			<td>3.03</td>
			<td>4.97</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ7</td>
			<td>0.9</td>
			<td>0.63</td>
			<td>233.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ8</td>
			<td>302</td>
			<td>0.83</td>
			<td>691</td>
			<td>10.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ10</td>
			<td>2.54</td>
			<td>0.71</td>
			<td>43.2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ14</td>
			<td>3224</td>
			<td>2.1</td>
			<td>14.52</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ16</td>
			<td>1.83</td>
			<td>32.99</td>
			<td>59.18</td>
			<td>28.65</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ17</td>
			<td>2.21</td>
			<td>0.77</td>
			<td>890.9</td>
			<td>23.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ21</td>
			<td>2.78</td>
			<td>12.87</td>
			<td>1769</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2: اختيار جسم عموم-ألفا- IC50 (نانوغرام/مل) تحدد استخدام عنصر الاستجابة تحفز الانترفيرون (أيسر)-لوسيفراس تحييد المقايسة. ويبين الجدول القيم IC50 من مابس المستخدمة في الفحص الصفيف جزيء واحد لجميع أنواع فرعية IFN-α. 10,000 HEK 293 MSR الخلايا المصنفة في لوحات 96-جيدا نصف مساحة بيضاء وعكس transfected مع 50 نانوغرام ممزوجة مسبقاً أيسر-اليراع لوسيفراس مراسل و بنيات لوسيفراس رينيلا استخدام الكواشف تعداء وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. بنية التعبير عن لوسيفراس بمثابة عنصر تطبيع داخلي. كانت الخلايا المحتضنة بين عشية وضحاها في "خفض المصل المتوسطة" وتستكمل مع الأحماض الأمينية غير الأساسية مم 0.1، 0.5% مصل بقرى الجنين عند 37 درجة مئوية 5% CO2 في جو هوميديفيد، بيروفات صوديوم 1 مم. بعد الاحتضان بين عشية وضحاها، حفز الخلايا على 24 ساعة مع المتوسطة التي تحتوي على خليط α IFN البشري المؤتلف مع أو بدون مكافحة-إيفن-α مابس أو مراقبة مفتش أنه قد تم بريينكوباتيد ح 1 في 37 درجة مئوية. بعد 24 ساعة تحفيز، أجريت فحوصات مراسل لوسيفراس المزدوج وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. «-» لم تحدد. سيفاليموماب هو الإنسان الكامل، الغلوبولين مناعي G1 κ جسم [مونوكلونل] أن يربط وتحييد معظم الأنواع الفرعية IFN-α؛ رونتاليزوماب جسم [مونوكلونل] أنسنة ضد IFN-α. مقتبس من ماير et al. عام 2016 وروديرو et al. 2017.
التكميلية الجدول 1: اختيار التوجه جسم، التقاط تركيز الأجسام المضادة في الخرز ونسبة بيوتينيليشن- تم اختبار التكوينات المختلفة الممكنة اثنين، استخدام أ المضادة-إيفن-α كجسم الالتقاط وب مكافحة-إيفن-α كالكشف عن الأجسام المضادة (A)، ونائب بالعكس (ب). IFNα-2 (ج) استخدمت مستضد. التقاط مختلف جسم تركيزات فضلا عن نسب البيوتين: جسم (B:A) خضعت أيضا لكل التكوينات. تشبع (السبت). اللون البرتقالي: AEB القيم التي تم استخدامها لحساب اللد؛ واعتبرت هذه التركيزات فارغة كقيم AEB بقيت ثابتة. حسبت اللد كما "يعني فارغة" + 3SD- <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_1.xlsx">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
التكميلية الجدول 2: اختبار لتكوين 3-الخطوة 2 مقابل. تم تقييم التكوينات الخطوة 2 و 3-استخدام مستضد IFNα-2 (ج). AEB كذلك كإشارة/خلفية حصص الإعاشة (S/B) يتم عرض القيم لكل الشروط. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_2.xlsx">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
التكميلية الجدول 3: تحسين تركيز الكاشف و SBG- ثلاثة تركيزات مختلفة من بيوتينيلاتيد للكشف عن الأجسام المضادة (0.1 و 0.3 و 0.6 ميكروغرام/مل) جنبا إلى جنب مع ثلاثة تركيزات مختلفة من SBG (50 و 150 و 250 م) قيمت. يتم عرض القيم AEB لشروط اختبار تسعة. اللون البرتقالي: AEB القيم التي تم استخدامها لحساب اللد؛ واعتبرت هذه التركيزات فارغة كقيم AEB بقيت ثابتة. حسبت اللد كما "يعني فارغة" + 3SD- <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_3.xlsx">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
التكميلية الجدول 4: خصوصية وحساسية للمقايسة صفيف واحد جزيء IFNα الأمثل. وترد إنزيم متوسط كل القيم الخرز عند اختبار IFN-β، IFN λ1، IFN-λ2، IFN-ω، و IFN-γ البروتينات المؤتلف (A)، جنبا إلى جنب مع الأنواع الفرعية 16 IFN-α (ب). «-» لم تحدد. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_4.xlsx">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
التكميلية الجدول 5: إمكانية تكرار نتائج للمقايسة صفيف واحد جزيء IFNα الأمثل. يتم عرض القيم AEB يعني لكافة المجريات المستقلة الثلاثة إلى تركز fg مليلتر 10.000. «-» لم تحدد. تشبع (السبت). <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_5.xlsx">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
التكميلية الجدول 6: تحليل المنافسة البروتين. متوسط إنزيم كل حبات تظهر القيم لكل شروط اختبارها. تم إجراء القياسات في مكررة. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_6.xlsx">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃŽÂ± at JoVE.com

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

نقدم هنا بروتوكولا لوصف التنمية والتحقق جزيء واحد الصفيف الرقمي أليسا المقايسة، الذي تمكن من كشف حساسية فائقة من جميع الأنواع الفرعية IFN-α في العينات البشرية.

التنمية والتحقق من جزيء واحد أولتراسينسيتيفي الصفيف الرقمي المرتبط بالانزيم مقايسة الممتز للبشرية انترفيرون-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

انزيم مرتبط Immunospot الفحص (ELISPOT) : القياس الكمي للردود TH - 1 المناعة الخلوية ضد مولدات المضادات الجرثومية

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Use of Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

استخدام مضاد للفيروسات، γ الإنزيم المرتبط الفحص Immunospot لوصف الرواية تي خلية الحواتم من فيروس الورم الحليمي البشري

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

الكمية عالي الإنتاجية الفحص السمسة وحيدة الخلية لخلايا T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

توصيف الاستجابات الالتهابية خلال الاستعمار داخل الشرج مع الالتهاب الرئوي العقدي

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

تصور التفاعلات الحمض النووي البروتين في الخلايا البكتيرية عن طريق لايف Photoactivated تتبع جزيء واحدة

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

تطبيق على المدى الطويل مثقف انترفيرون γ انزيم مرتبط Immunospot الفحص لتقييم المستجيب والذاكرة T الردود خلية في الماشية

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

التنمية والتحقق من طريقة PCR الكمي لEquid الفيروسة-2 التشخيص في الجهاز التنفسي السوائل

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

إنشاء إعداد إنتاجية عالية لفحص الجزيئات الصغيرة التي تعدل ج-دي-GMP في اشارة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

فحص من التصاق تحت إجهاد القص لدراسة تي اللمفاويات-التصاق جزيء التفاعلات

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

قياس الأنفلونزا النورامينيداز تثبيط الجسم المضاد التتر من قبل انزيم مرتبط كتين الفحص

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...