Name: development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;
Uploaded: 2018-06-14T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃŽÂ± at JoVE.com

DD og YJC anerkender støtte fra ANR (projekt IFNX, ingen. CE17001002) og ImmunoQure AG til at give monoklonale antistoffer. Vi takker Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki og Pierre Quartier for at levere kliniske prøver. YJC anerkender det Europæiske Forskningsråd (GA 309449: stipendium til YJC), og statslige subsidier forvaltes af nationale forskning agentur (Frankrig) under programmet "Investeringer for the Future" forsynet med henvisning ANR-10-IAHU-01.

<ol>
	<li>Isaacs, A., Lindenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classics+in+Oncology+Virus+Interference:+I.+The+Interferon.">Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).</li><li>Isaacs, A., Lindenmann, J., Valentine, R. C., Alerts, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pillars+Article:+Virus+Interference.+II.+Some+Properties+of+Interferon.">Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).</li><li>Hunt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombotic+Microangiopathy+Associated+with+Interferon+Beta.">Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta.</a> N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).</li><li>Hooks, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Interferon+in+the+Circulation+of+Patients+with+Autoimmune+Disease.">Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease.</a> N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).</li><li>Greenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-alpha/beta+Mediated+Innate+Immune+Mechanisms+in+Dermatomyositis.">Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis.</a> Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).</li><li>Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+interferonopathies+a+novel+set+of+inborn+errors+of+immunity.">Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).</li><li>Rodero, M. P., Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+interferon+-+mediated+monogenic+autoinflammation:+The+type+I+interferonopathies,+a+conceptual+overview.">Type I interferon - mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview.</a> J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).</li><li>Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+biological+assay+for+interferons.">A sensitive biological assay for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).</li><li>Meager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+assays+for+interferons.">Biological assays for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).</li><li>Hua, J., Kirou, K., Lee, C., Crow, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Assay+of+Type+I+Interferon+in+Systemic+Lupus+Erythematosus+Plasma+and+Association+With+Anti+-+RNA+Binding+Protein+Autoantibodies.">Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti - RNA Binding Protein Autoantibodies.</a> Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).</li><li>Niewold, T. B., Kariuki, S. N., Morgan, G. A., Shrestha, S., Pachman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+serum+interferon-alpha+activity+in+juvenile+dermatomyositis:+associations+with+disease+activity+at+diagnosis+and+after+thirty-six+months+of+therapy.">Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy.</a> Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).</li><li>Seo, Y., Kim, G., Kwak, H., Nam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+HeLa+Mx2+/+Luc+Reporter+Cell+Line+for+the+Quantification+of+Human+Type+I+Interferons.">Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons.</a> Pharmacology. 84, 135-144 (2009).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+surface+expression+of+Fc&#947;+receptor+RI+(+CD64+),+a+biomarker+reflecting+type-I+interferon+levels+in+systemic+lupus+erythematosus.">Monocyte surface expression of Fc&#947; receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).</li><li>Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Vesicular+Stomatitis+Virus+Replicon-Based+Bioassay+for+the+Rapid+and+Sensitive+Determination+of+Multi-Species+Type+I+Interferon.">A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon.</a> PLoS One. 6, e25858 (2011).</li><li>Rissin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assay+detects+serum+proteins+at+subfemtomolar+concentrations.">Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations.</a> Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).</li><li>Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+array+(Simoa)+assay+with+optimal+antibody+pairs+for+cytokine+detection+in+human+serum+samples.">Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples.</a> R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).</li><li>Simoa. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+Principle+of+SimoaTM+(Single+Molecule+Array)+Technology.">Scientific Principle of SimoaTM (Single Molecule Array) Technology.</a> Whitepaper 1.0. , 1-2 (2013).</li><li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assays+Theoretical+considerations.">Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations.</a> J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).</li><li>Yeung, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+highly+sensitive+immunoassay+technologies+for+quantitative+measurements+of+sub-pg+/+mL+levels+of+cytokines+in+human+serum.">Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum.</a> J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+measurements+of+tumor+necrosis+factor+&#945;+and+interleukin-6+in+the+plasma+of+patients+with+Crohn's+disease.">Single molecule measurements of tumor necrosis factor &#945; and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease.</a> J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).</li><li>Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Changes+of+Post-Translationally+Modified+Forms+of+CXCL10+and+Soluble+DPP4+in+HCV+Subjects+Receiving+Interferon-Free+Therapy.">Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy.</a> PLoS One. 10, e0133236 (2015).</li><li>Decalf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+DPP4+activity+in+humans+establishes+its+in+vivo+role+in+CXCL10+post-translational+modification:+prospective+placebo-controlled+clinical+studies.">Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies.</a> EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).</li><li>Rabing Brix Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+in+plasma+from+patients+with+diabetic+retinopathy+-+development+and+validation+of+digital+ELISA+by+Single+Molecule+Array+(Simoa)+technology.">Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy - development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology.</a> J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).</li><li>Disanto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+Neurofilament+Light:+A+Biomarker+of+Neuronal+Damage+in+Multiple+Sclerosis.">Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis.</a> Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+ultrasensitive+measurement+of+amyloid-+&#946;+1+-+42+peptide+in+human+plasma+with+utility+for+studies+of+Alzheimer's+disease+therapeutics.">A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- &#946; 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics.</a> Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).</li><li>Passaes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+HIV-1+p24+Assay+Detects+Single+Infected+Cells+and+Differences+in+Reservoir+Induction+by+Latency+Reversal+Agents.">Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents.</a> J. Virol. 91, e02296 (2017).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Detection+of+Bacterial+Genomic+DNA+at+Sub-Femtomolar+Concentrations+Using+Single+Molecule+Arrays.">Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays.</a> Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).</li><li>Cohen, L., Hartman, M. R., Amardey-wellington, A., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+direct+detection+of+microRNAs+using+single+molecule+arrays.">Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays.</a> Nucleic Acids Res. 45, e137 (2017).</li><li>Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AIRE-Deficient+Patients+Harbor+Unique+High-Affinity+Disease-Ameliorating+Autoantibodies.">AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies.</a> Cell. 166, 582-595 (2016).</li><li>Simoa. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homebrew+Assay+Development+Guide.">Homebrew Assay Development Guide.</a> Simoa HD-1 Analyzer &amp; Quanterix SR-X. User-0021 08. , (2017).</li><li>Rodero, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+interferon+alpha+protein+reveals+differential+levels+and+cellular+sources+in+disease.">Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease.</a> J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).</li><li>Pleil, J., Angrish, M., Madden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemistry+for+high-throughput+screening+of+human+exhaled+breath+condensate+(EBC)+media+implementation+of+automated+Quanterix+SIMOA+instrumentation.">Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation.</a> J. Breath Res. 9, 047108 (2015).</li><li>Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Proteomic+Strategy+for+Clinical+Biomarker+Discovery.">Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery.</a> Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).</li><li>Wilson, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Simoa+HD-1+Analyzer:+A+Novel+Fully+Automated+Digital+Immunoassay+Analyzer+with+Single-Molecule+Sensitivity+and+Multiplexing.">The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing.</a> J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).</li><li>Rivnak, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully-automated,+six-plex+single+molecule+immunoassay+for+measuring+cytokines+in+blood.">A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood.</a> J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).</li><li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Plasma+Proteome.+History,+character,+and+diagnostic+prospects.">The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).</li><li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISA+in+the+multiplex+era:+Potentials+and+pitfalls.">ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls.</a> Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Vi beskrevet heri, udvikling og validering af et stærkt reproducerbar, ultrasensitive enkelt molekyle array digital ELISA til direkte kvantificering af IFN-α protein i menneskelige prøver (trin opsummeret i tabel 1). Et af de mest afgørende skridt i udviklingen af analysen er valget af antistof par16, med kinetik og epitop bindende er nøglen til en vellykket assay. Det er vigtigt at undgå brug af parret monoklonale antistoffer at målrette den samme epitop eller at forårsage sterisk hindring. Polyklonale antistoffer kan bruges som påvisning antistoffer til at overvinde sådanne begrænsninger. Hvis den ønskede følsomhed ikke opnås ved enhver given skridt, bør yderligere optimering muligheder overvejes. Dette kan omfatte anvendelse af alternative antistof par, ændringer i parametre såsom protein type (f.eks. BSA < kasein), pH (6.0-8,5), ionisk styrke, stødpudeevne (fx NaCl og fosfat koncentrationer), carrier perler og/eller forekomsten af overfladeaktive stoffer. En lang række parametre optimeres con ved udvikling af et enkelt molekyle array assay. Dog samlet set betingelser, der giver høj signal: baggrund nøgletal og minimal bestemmelsesgrænseværdier er dem, foretrak (Se figur 1, figur 2og figur 3).
Vedrørende specificitet, IFN-α-Analysen viste ingen cross reaktivitet for eventuelle andre IFNs testet (β, γ, λ1, λ2, ω) (figur 4a) og var i stand til at afsløre alle 13 IFN-α undertyper (figur 4b). Analysen viste imidlertid en lavere affinitet for IFN-en2 subtype, (figur 4b og supplerende tabel 4). Interessant, blev forskellige følsomheder for de forskellige klasser af IFN-en2 (a, b, c) også observeret, hvilket kan skyldes forskellige fremstillings procedurer eller forskellige aminosyre-sekvenser, som IFN-en2 undertyper blev indhentet fra forskellige kommercielle leverandører. Med denne undtagelse gav alle IFN-α arter meget lignende svar. Specificiteten af analysen blev finpudset af forbehandling af prøver med anti-IFN-α en klon, som ophævet signal (figur 6 og supplerende tabel 6).
En af de vigtigste fordele ved denne teknologi er, at enhver analysand af interesse potentielt kan være målrettet16. Derudover kan forskellige biologiske prøver testes, serum, plasma, cerebrospinalvæske, cellulære lysates, kultur analysere31 og selv ånde32. Normalt, er en 1:3 fortynding af plasma udført for at undgå potentielle tilstopning af enkelt molekyle array analyzer. Men analysand af interesse kunne være til stede ved meget lave koncentrationer i de relevante biologiske prøve og højere koncentrationer af prøven kan være nødvendig (afhængigt af assay følsomhed)33. Selv om der er potentiale for multiplexing samtidig opretholde god følsomhed34, er det en mere udfordrende proces og assays til måling af større end 6 proteiner inden for de samme eksperimenter har endnu at være udviklet35.
Evne til at detektere og kvantificere cytokiner og andre biologiske relevante proteiner ved sådanne lave koncentrationer åbner op for en helt ny vifte af applikationer33,36. Det er velkendt, at mange proteiner udøve deres virkninger selv i meget lave koncentrationer, som indtil nu lå under detektionsgrænsen for den bedste ringprøver37. Mens andre immunoassay teknologi tilbyder fordele i forhold til konventionelle ELISA19, viser vi her, enkelt molekyle array digital ELISA er reproducerbare og robust platform for den ultrasensitive påvisning af lav koncentration cytokiner i menneskelige prøver. Som sådan, tilbyder denne teknologi enorme potentiale for biomarkør opdagelse og forbedret patient forvaltning af en lang række sygdomme.

Type jeg IFNs er en familie af cytokiner, som spiller en central rolle i iscenesætte antivirale immunrespons. De blev først opdaget af Isaacs og Lindenmann 60 år siden1,2 , og det er nu kendt, at denne heterogene familie af polypeptider består af 14 forskellige underklasser (13 IFN-α undertyper og 1 IFN-β). Jeg IFNs er afgørende for regnskabsafslutningen for virale infektioner, men har også været impliceret i patologi af en række menneskelige sygdomstilstande, herunder autoimmune sygdomme systemisk lupus erythematosus (SLE), juvenil dermatomyositis (JDM), og typen Jeg interferonopathies i hvilke konstitutive type I IFN-induceret signalering-resultaterne i patologi3,4,5,6,7.
At studere type I-IFN protein niveauer i biologiske prøver har været udfordrende siden dets oprindelige identifikation som et "blande stof"1,2. I øjeblikket, er sandwich Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) den mest udbredte metode til påvisning af IFN-α protein. På trods af at være specifik, enkle og hurtige, type jeg IFN ringprøver præsentere vigtige begrænsninger, såsom begrænset følsomhed. Derudover kræver måling af alle IFN-α undertyper brug af flere assays hver med deres egen afsløring kapacitet og følsomhed. Mens der er kommercielle ringprøver, der registrerer forskellige undertyper af IFN-α, deres følsomhed er begrænset (1,95 pg/mL, 12,5 pg/mL og 12,5 pg/mL, henholdsvis) som er ofte utilstrækkelige til at opdage IFN-α protein i biologiske prøver. For at overvinde denne begrænsning, type flere biologiske proxy assays er blevet udviklet for at kvantificere I IFN-ved at måle induceret genekspression eller funktionelle aktivitet8,9,10,11, 12 , 13 , 14. alligevel disse assays giver ikke en direkte måling af IFN-α protein.
I denne undersøgelse, blev enkelt molekyle array digital ELISA teknologi brugt til at udvikle en analyse til påvisning af enkelt IFN-α proteinmolekyler. Digital ELISA udnytter det samme grundlæggende kemi som konventionelle ELISA, men reaktionen foregår i arrays bestående af 50.000 individuelle 46 femtoliter størrelse wells15,16. Enkelt proteinmolekyler er fanget af antistof-Paramagnetiske perler og markeret med en biotinylated detektor-antistof, efterfulgt af bindingen af et enzymkonjugat, streptavidin-β-galactosidase (SBG). Efterfølgende er perlerne suspenderet med et fluorogenic enzym-substrat, resorufin-β-D-galactopyranoside (RGP), til enkelt-molekyle arrays. Ved faldende volumen reaktion 2 milliarder gange17, en høj lokal koncentration af fluorescerende signal er opnået og enkelt molekyle tæller blive muligt, som hvert molekyle skaber et signal, som kan være pålideligt målt18. I det væsentlige er enkelt molekyle arrays i stand til at tælle enkelt immunocomplexes og fastlæggelse af et gennemsnitligt antal enzymer pr. perle (AEB). Tælle microwells som et signal detekteres tillader kvantificering/digitalisering af proteinmolekyler, som der er en direkte sammenhæng mellem proteinkoncentration og forholdet mellem immunocomplexed-perler og et samlet antal perler findes i femtoliter-store kamre.
Yeung mfl. udført en omfattende cross-platform evalueringsundersøgelse med ni forskellige teknologier og fire cytokin immunassays med formålet at sammenligne assay præcision, følsomhed og data sammenhæng på tværs af forskellige platforme19. Et af hovedresultaterne af undersøgelsen var, at enkelt molekyle arrays og enkelt molekyle tælle immunassay præsenteret den højeste følsomhed for påvisning af cytokiner i humant serum inden for sub-pg/mL koncentrationsområde. Enkelt molekyle array digital ELISA cytokin assays er blevet brugt til at studere rollen af TNF-α og IL-6 i Crohns sygdom20, IFN-α i interferonopathy og auto-immune patienter 7, og de forskellige post-translationally ændrede former for C-X-C motiv chemokine 10 (CXCL10) i kronisk hepatitis og raske donorer modtager sitagliptin21,22. Andre anvendelser omfatter måling af rhodopsin hos patienter med diabetisk retinopati23; undersøgelse af hjernen patologier gennem serum/plasma målinger af neurofilament lys24 og amyloid-β 1-42 peptid25, i forbindelse med multipel sklerose og Alzheimers sygdom, henholdsvis. Enkelt molekyle array assays kan også bruges til forbedret patogen detektion såsom karakterisering af HIV virus reservoir26, og også til påvisning af DNA27 og micro RNA'er28. En stor fordel ved enkelt molekyle array teknologi er denne høje alsidighed, som en assay mod enhver analysand af interesse kan udvikles, hvis en bestemt antistof par er tilgængelig. Derudover er homebrew assay kits kommercielt tilgængelig, så udviklingen af nye assays, protokol som er detaljeret beskrevet i en modificeret form nedenfor.
Her, præsenteres en detaljeret beskrivelse af trinene udvikling og validering for et enkelt molekyle array assay der resulterer i øget følsomhed for IFN-α protein påvisning. Antistoffer for enkelt molekyle array assays bør være meget specifikke, undgå cross reaktivitet med relaterede proteiner (med arter specificitet i betragtning, hvis relevant). Ideelt set bør være valgt antistoffer med en KD mindre end 10-9 M; høj affinitet sikrer stærke binding, med produktion af en højere signal. Kinetik af antigen-antistof-bindingen er også vigtig, og hurtig Kpå og langsom Koff vil favorisere antigen-antistof kompleks samling. Start med et antistof-par, der har en god præstation i klassisk ELISA, med en grænse detektionsgrænsen (LOD) af 1-100 pg/mL, øger chancerne for at opnå en meget følsomme enkelt molekyle array assay. Chang og kolleger udført detaljerede kinetiske studier af Biomolekylær interaktioner forekommer ved hvert enkelt skridt, foreslår en række ligninger til at forudsige analytiske følsomhed18. De viste at enkelt molekyle array digital ELISA synes at være effektiv inden for en bred vifte af antistof tilhørsforhold (KD ~ 10−11 - 10−9 M), samt at signal generation er mere afhængige af på sats af sådanne antistoffer.
For at udnytte høj affinitet type antistoffer tog vi fordel af antistoffer isoleret fra patienter med autoimmune polyendocrinopathy syndrom 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrofi (APS1/APECED)29. Af grunde, der endnu ikke er forstået, det store flertal af AIRE-mangel enkeltpersoner udvikle et kernesæt af høj-aviditet antistoffer mod alle IFN-α undertyper29og vi valgt to anti-IFN-α antistof kloner af supplerende bindende tilhørsforhold for de forskellige IFN-α undertyper, som anslået af IC50 værdier. Kombinationen af disse unikke høj-affinitet antistoffer med enkelt molekyle array teknologi aktiveret direkte kvantificering af IFN-α på attomolar (fg/mL) koncentrationer. Sådanne ultrasensitive IFN-α protein registrering vil bidrage til en bedre forståelse af naturen, regulering og biologiske effekt af IFN-induceret response i forskellige sygdom indstillinger.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody A (8H1 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody B (12H5 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody EBI-1 clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody BMS216BK clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216BK</td>
			<td>Not an ELISA kit but bulk abs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2c</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS305</td>
			<td>OK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;I (17)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2b</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;1</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11175-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4a (M1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4b (a4)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11180-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;B2 (a8)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11115-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;C (a10)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;D (a1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11125-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;G (a5)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11135-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;F (a21)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11130-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;H2 (a14)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;J1 (a7)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11160-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;K (a6)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11165-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;WA (a16)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11190-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#969;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#946;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; ELISA</td>
			<td>PBL</td>
			<td>41115.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISRE-Reporter</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>CCS-008L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fu-GENE HD Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Mediuem</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40 Substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer NanoDrop 1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtres</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC505096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Conjugation Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Encoded Paramagnetic Beads</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Wash Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11844071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Blocking Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Diluent Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector and Sample Diluent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylation Reaction Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11891195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>MS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa) reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBG, Bead and Detector Barcode Labels</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Reagent Bottles</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa specimen 96-well plates</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Discs</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa 2.0 conductive Tips</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Cuvettes</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa SBG Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa RGP Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 1</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 2</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing Oil</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa HD-1 Analyzer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa)</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems</td>
			<td>Singluex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;

Hovedformålet med denne protokol er at beskrive udviklingen og valideringen af et interferon (IFN)-α enkelt molekyle array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. Dette giver mulighed for kvantificering af menneskelige IFN-α protein med hidtil uset følsomhed, og ingen krydsreaktivitet for andre arter af IFN.
Det første vigtige skridt i protokollen er valget af antistof parret, efterfulgt af konjugation af capture antistof til Paramagnetiske perler, og biotinylation af detektor-antistof. Efter dette trin, kan forskellige parametre såsom assay konfiguration, detektor-antistof koncentration og buffer sammensætning ændres, indtil den optimale følsomhed er opnået. Endelig vurderes specificitet og reproducerbarhed af metoden for at sikre tillid til resultaterne. Her, udviklede vi en IFN-α enkelt molekyle array assay med en grænse på påvisning af 0.69 fg/mL ved hjælp af høj-affinitet autoantistoffer isoleret fra patienter med biallelic mutationer i den autoimmune regulator (AIRE) protein forårsager autoimmune polyendocrinopathy syndrom type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrofi (APS1/APECED). Vigtigere, aktiveret disse antistoffer registrering af alle 13 IFN-α undertyper.
Denne nye metode giver mulighed for påvisning og kvantificering af IFN-α protein i menneskelige biologiske prøver på attomolar koncentrationer for første gang. Et sådant værktøj vil være meget nyttig i kontrol af niveauerne for denne cytokin i menneskers sundhed og sygdomstilstande, de fleste især infektion, autoimmunitet og autoinflammation.

I Resumé belagt en pan-IFN-α enkelt molekyle array assay med en grænse på påvisning af 0.69 fg/mL, med en 2-trins konfiguration med capture perler med 0,3 mg/mL af anti-IFN-α et antistof, og anti-IFN-α B påvisning antistof biotinylated i biotin: antistof forholdet 30 blev udviklet. Koncentrationerne anvendes til biotinylated påvisning antistof og SBG var 0,3 µg/mL og 150 pM, henholdsvis. Denne meget specifikke assay er i stand til at afsløre alle 13 IFN-α undertyper og reagerer ikke krydser med andre slags IFNs. Således, mens det ikke er muligt at identificere og kvantificere hver enkelte arter af IFN-α, alle af dem kan påvises og målt sammen giver en samlet koncentration værdi for IFN-α, der består af 13 forskellige underklasser.
For at udforske den potentielle diagnostiske værdi af denne nyudviklede assay, IFN-α protein i plasma og serum fra raske personer blev målt og sammenlignet med prøver fra patienter med SLE og JDM. Som illustreret i figur 7, blev høje niveauer af IFN-α protein opdaget i begge sygdom kohorter i forhold til raske kontrolpersoner. Den stiplede linje angiver LOD af en konventionel kommercielt tilgængelige ELISA, illustrerer, hvordan denne fremgangsmåde ville ikke afsløre IFN-α protein i disse patientgrupper trods de kendte sammenslutninger af dette cytokine med disse fænotyper. IFN-α kan desuden kvantificeres over 5 logs af størrelsesorden, illustrerer den bredt dynamikområde assay med påviselige mængder mellem 1-10 fg/mL bekræfter den meget følsomme karakter af analysen.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57421/57421fig7.jpg"> Figur 7: kvantificering af IFN-α protein i plasma og serum fra patient kohorter. Dette tal er blevet ændret fra Rodero mfl. 2017. plasma fra raske kontrolpersoner (n = 20) og patienter med SLE (n = 72) og JDM (n = 43) blev testet med pan-IFNα enkelt molekyle array assay. Analyse blev udført ved hjælp af en-vejs ANOVA test (Kruskal-Wallis) og Dunns flere sammenligning test mellem grupper. Medianen er afbildet. Stiplede linje angiver LOD af en reference menneskelige anti-IFN-α ELISA (1,95 pg/mL = 1950 fg/mL). <a href="/files/ftp_upload/57421/57421fig7large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Trin</td>
			<td>Overvejelser</td>
			<td>Reference</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1. antistof par valg</td>
			<td>Mål forskellige epitoper</td>
			<td rowspan="3">Tabel 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Høj affinitet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hurtigt Kpå / langsom Kud
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2. antistof par orientering</td>
			<td rowspan="3">Vælg betingelser med den laveste grænse påvisning</td>
			<td rowspan="3">Figur 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3. fange antistof koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>4. biotin: detektor antistof forholdet</td>
		</tr>
<tr>
<td>5. 2 vs 3-trins konfiguration</td>
			<td>Vælg betingelse med højeste Signal: baggrund forholdet</td>
			<td>Figur 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6. detektor-antistof koncentration</td>
			<td rowspan="2">Vælg betingelser med den laveste grænse påvisning</td>
			<td rowspan="2">Figur 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>7. SBG koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>8. specificitet</td>
			<td>Vurdere krydsreaktivitet</td>
			<td rowspan="2">Figur 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9. følsomhed</td>
			<td>Vurdere anerkendelse af undertyper (hvis relevant)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10. reproducerbarhed</td>
			<td>Vurdere assay variation</td>
			<td>Figur 5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: oversigt over trin til udvikling og optimering af et enkelt molekyle array assay. Denne tabel er en oversigt over de forskellige trin, der kræves til udvikling og optimering af et enkelt molekyle array assay, fra de første valg af antistof par indtil vurderingen af reproducerbarhed.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antigen</td>
			<td>8H 1 (A)</td>
			<td>12H 5 (B)</td>
			<td>Sifalimumab</td>
			<td>Rontalizumab</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ1</td>
			<td>28.3</td>
			<td>51,3</td>
			<td>460</td>
			<td>22,63</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ2</td>
			<td>2563</td>
			<td>10.7</td>
			<td>9.02</td>
			<td>2.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ4</td>
			<td>5.11</td>
			<td>2,99</td>
			<td>35.35</td>
			<td>325.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ5</td>
			<td>2,01</td>
			<td>19,6</td>
			<td>93.29</td>
			<td>2,49</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ6</td>
			<td>64.7</td>
			<td>3,03</td>
			<td>4,97</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ7</td>
			<td>0,9</td>
			<td>0,63</td>
			<td>233.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ8</td>
			<td>302</td>
			<td>0,83</td>
			<td>691</td>
			<td>10.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ10</td>
			<td>2,54</td>
			<td>0,71</td>
			<td>43.2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ14</td>
			<td>3224</td>
			<td>2.1</td>
			<td>14.52</td>
			<td>0,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ16</td>
			<td>1.83</td>
			<td>32,99</td>
			<td>59.18</td>
			<td>28.65</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ17</td>
			<td>2.21</td>
			<td>0,77</td>
			<td>890.9</td>
			<td>23.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ21</td>
			<td>2.78</td>
			<td>12.87</td>
			<td>1769</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Pan-alfa antistof udvalg. IC50 (ng/mL) bestemmes ved hjælp af interferon-stimuleret svar element (ISRE)-Luciferase neutralisering assay. Tabellen viser IC50 værdier af mAbs bruges i enkelt molekyle array assay for alle IFN-α undertyper. 10.000 HEK 293 MSR celler var seedede i hvid halv-området 96-brønd plader og omvendt-transfekteret med 50 ng forblandet ISRE-Firefly luciferase reporter og Renilla luciferase konstruktioner Transfektion reagenser ifølge producentens anvisninger. Den luciferase-udtrykker konstruktion fungerede som en indre normalisering kontrol. Celler blev inkuberet natten over i reduceret Serum Medium suppleret med 0,1 mM uvÃ¦sentlige aminosyrer, 1 mM natrium pyruvat, 0,5% føtal bovint serum ved 37 ° C, 5% CO2 i en fugtig atmosfære. Efter natten inkubation, blev celler stimuleret i 24 timer med medium, der indeholder blandinger af rekombinant humant IFN-α med eller uden anti-IFN-α mAbs eller kontrol IgG, der havde været forinkubereret i 1 timer ved 37 ° C. Efter 24 timer af stimulation, blev dobbelt luciferase reporter assays udført ifølge producentens anvisninger. «-» Ikke bestemmes. Sifalimumab er en fuldt humant, immunoglobulin G1 κ monoklonalt antistof, der bindes til og neutraliserer fleste af IFN-α undertyper; Rontalizumab er en humaniseret monoklonalt antistof mod IFN-α. Tilpasset fra Meyer et al. 2016 og Rodero et al. 2017.
Supplerende tabel 1: udvælgelse af antistof orientering, fange antistof koncentration på perler og biotinylation ratio. De to forskellige konfigurationer blev testet, ved hjælp af anti-IFN-α A som fange antistof, og anti-IFN-α B som påvisning antistof (A), og vice versa (B). IFNα - 2c blev brugt som antigen. Forskellige capture antistof koncentrationer samt biotin: antistof (B:A) nøgletal blev også testet for både konfigurationer. Mætning (lør). Orange: AEB værdier, der blev brugt til beregning af LOD; disse koncentrationer blev anset for Tom som AEB værdier forblev stabil. LOD blev beregnet som betyder tomme + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_1.xlsx">venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende tabel 2: Test af 2 vs 3-trins konfigurationen. De 2- og 3 - trin konfigurationer blev vurderet ved hjælp af IFNα - 2c som antigen. AEB værdier er såvel som signal/baggrund rationer (S/B) vist for begge betingelser. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_2.xlsx">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende tabel 3: detektor og SBG koncentration optimering. Tre forskellige koncentrationer af biotinylated detektor antistof (0,1, 0,3 og 0,6 µg/mL) sammen med tre forskellige koncentrationer af SBG (50, 150 og 250 pM) blev vurderet. AEB værdier er vist for de ni testede betingelser. Orange: AEB værdier, der blev brugt til beregning af LOD; disse koncentrationer blev anset for Tom som AEB værdier forblev stabil. LOD blev beregnet som betyder tomme + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_3.xlsx">venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende tabel 4: specificiteten og følsomheden af optimeret IFNα enkelt molekyle array assay. Gennemsnitlige enzym pr. perler værdier vises når IFN-β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω og IFN-γ rekombinante proteiner var testet (A), sammen med de 16 undertyper af IFN-α (B). «-» Ikke bestemmes. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_4.xlsx">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende tabel 5: reproducerbarhed af optimeret IFNα enkelt molekyle array analysen. AEB middelværdier for alle tre uafhængige kører er vist til en koncentration på 10.000 fg/mL. «-» Ikke bestemmes. Mætning (lør). <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_5.xlsx">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende tabel 6: Protein konkurrence assay. Gennemsnitlige enzym pr. perler værdier er vist for alle betingelser testet. Målinger blev udfærdiget i to eksemplarer. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_6.xlsx">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃŽÂ± at JoVE.com

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Her præsenterer vi en protokol til at beskrive udviklingen og valideringen af et enkelt molekyle array digital ELISA assay, som gør det ultra-følsomme påvisning af alle IFN-α undertyper i menneskelige prøver.

Udvikling og validering af et Ultrasensitive enkelt molekyle Array Digital enzym-forbundet Immunosorbent Assay for menneskelige Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Use of Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Anvendelse af interferon-γ Enzymbundet immunospot Assay til karakterisering hidtil ukendte T-celle epitoper af human papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ Højkapacitetsforskning encellede cytotoksicitetsassay for T-celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Karakterisering af inflammatoriske reaktioner under intranasal kolonisering med Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Visualisering Protein-DNA Interaktioner Live bakterieceller Brug Fotoaktiveret Single-molekyle Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Anvendelse af Langsigtet kulturperler Interferon-γ Enzyme-linked immunospot Assay til Vurdering Effektorceller og Memory T celle responser i Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Udvikling og validering af en kvantitativ PCR Metode til hovdyrets herpesvirus-2 Diagnose i Respiratory Væsker

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Etablering af en High-throughput Opsætning til screening små molekyler, der modulerer c-di-GMP Signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Analyse af Vedhæftning Under Shear Stress for Studiet af T-lymfocyt-adhæsionsmolekyle Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Måling Influenza neuraminidase Inhibering Antistoftitere af Enzyme-linked lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...