Name: development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;
Uploaded: 2018-06-14T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃŽÂ± at JoVE.com

DD en YJC erkentelijk voor steun van de ANR (Project IFNX, geen. CE17001002) en ImmunoQure AG voor het verstrekken van monoklonale antilichamen. Wij danken Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki en Pierre Quartier voor het verstrekken van klinische monsters. YJC erkent de Europese Onderzoeksraad (GA 309449: Fellowship aan YJC), en een overheidssubsidie beheerd door de National Research Agency (Frankrijk) onder de "Investeringen voor de toekomst" programma, rekening houdend met de verwijzing ANR-10-IAHU-01.

<ol>
	<li>Isaacs, A., Lindenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classics+in+Oncology+Virus+Interference:+I.+The+Interferon.">Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).</li><li>Isaacs, A., Lindenmann, J., Valentine, R. C., Alerts, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pillars+Article:+Virus+Interference.+II.+Some+Properties+of+Interferon.">Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).</li><li>Hunt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombotic+Microangiopathy+Associated+with+Interferon+Beta.">Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta.</a> N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).</li><li>Hooks, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Interferon+in+the+Circulation+of+Patients+with+Autoimmune+Disease.">Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease.</a> N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).</li><li>Greenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-alpha/beta+Mediated+Innate+Immune+Mechanisms+in+Dermatomyositis.">Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis.</a> Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).</li><li>Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+interferonopathies+a+novel+set+of+inborn+errors+of+immunity.">Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).</li><li>Rodero, M. P., Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+interferon+-+mediated+monogenic+autoinflammation:+The+type+I+interferonopathies,+a+conceptual+overview.">Type I interferon - mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview.</a> J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).</li><li>Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+biological+assay+for+interferons.">A sensitive biological assay for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).</li><li>Meager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+assays+for+interferons.">Biological assays for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).</li><li>Hua, J., Kirou, K., Lee, C., Crow, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Assay+of+Type+I+Interferon+in+Systemic+Lupus+Erythematosus+Plasma+and+Association+With+Anti+-+RNA+Binding+Protein+Autoantibodies.">Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti - RNA Binding Protein Autoantibodies.</a> Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).</li><li>Niewold, T. B., Kariuki, S. N., Morgan, G. A., Shrestha, S., Pachman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+serum+interferon-alpha+activity+in+juvenile+dermatomyositis:+associations+with+disease+activity+at+diagnosis+and+after+thirty-six+months+of+therapy.">Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy.</a> Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).</li><li>Seo, Y., Kim, G., Kwak, H., Nam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+HeLa+Mx2+/+Luc+Reporter+Cell+Line+for+the+Quantification+of+Human+Type+I+Interferons.">Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons.</a> Pharmacology. 84, 135-144 (2009).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+surface+expression+of+Fc&#947;+receptor+RI+(+CD64+),+a+biomarker+reflecting+type-I+interferon+levels+in+systemic+lupus+erythematosus.">Monocyte surface expression of Fc&#947; receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).</li><li>Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Vesicular+Stomatitis+Virus+Replicon-Based+Bioassay+for+the+Rapid+and+Sensitive+Determination+of+Multi-Species+Type+I+Interferon.">A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon.</a> PLoS One. 6, e25858 (2011).</li><li>Rissin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assay+detects+serum+proteins+at+subfemtomolar+concentrations.">Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations.</a> Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).</li><li>Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+array+(Simoa)+assay+with+optimal+antibody+pairs+for+cytokine+detection+in+human+serum+samples.">Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples.</a> R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).</li><li>Simoa. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+Principle+of+SimoaTM+(Single+Molecule+Array)+Technology.">Scientific Principle of SimoaTM (Single Molecule Array) Technology.</a> Whitepaper 1.0. , 1-2 (2013).</li><li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assays+Theoretical+considerations.">Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations.</a> J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).</li><li>Yeung, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+highly+sensitive+immunoassay+technologies+for+quantitative+measurements+of+sub-pg+/+mL+levels+of+cytokines+in+human+serum.">Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum.</a> J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+measurements+of+tumor+necrosis+factor+&#945;+and+interleukin-6+in+the+plasma+of+patients+with+Crohn's+disease.">Single molecule measurements of tumor necrosis factor &#945; and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease.</a> J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).</li><li>Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Changes+of+Post-Translationally+Modified+Forms+of+CXCL10+and+Soluble+DPP4+in+HCV+Subjects+Receiving+Interferon-Free+Therapy.">Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy.</a> PLoS One. 10, e0133236 (2015).</li><li>Decalf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+DPP4+activity+in+humans+establishes+its+in+vivo+role+in+CXCL10+post-translational+modification:+prospective+placebo-controlled+clinical+studies.">Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies.</a> EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).</li><li>Rabing Brix Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+in+plasma+from+patients+with+diabetic+retinopathy+-+development+and+validation+of+digital+ELISA+by+Single+Molecule+Array+(Simoa)+technology.">Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy - development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology.</a> J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).</li><li>Disanto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+Neurofilament+Light:+A+Biomarker+of+Neuronal+Damage+in+Multiple+Sclerosis.">Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis.</a> Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+ultrasensitive+measurement+of+amyloid-+&#946;+1+-+42+peptide+in+human+plasma+with+utility+for+studies+of+Alzheimer's+disease+therapeutics.">A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- &#946; 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics.</a> Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).</li><li>Passaes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+HIV-1+p24+Assay+Detects+Single+Infected+Cells+and+Differences+in+Reservoir+Induction+by+Latency+Reversal+Agents.">Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents.</a> J. Virol. 91, e02296 (2017).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Detection+of+Bacterial+Genomic+DNA+at+Sub-Femtomolar+Concentrations+Using+Single+Molecule+Arrays.">Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays.</a> Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).</li><li>Cohen, L., Hartman, M. R., Amardey-wellington, A., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+direct+detection+of+microRNAs+using+single+molecule+arrays.">Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays.</a> Nucleic Acids Res. 45, e137 (2017).</li><li>Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AIRE-Deficient+Patients+Harbor+Unique+High-Affinity+Disease-Ameliorating+Autoantibodies.">AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies.</a> Cell. 166, 582-595 (2016).</li><li>Simoa. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homebrew+Assay+Development+Guide.">Homebrew Assay Development Guide.</a> Simoa HD-1 Analyzer &amp; Quanterix SR-X. User-0021 08. , (2017).</li><li>Rodero, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+interferon+alpha+protein+reveals+differential+levels+and+cellular+sources+in+disease.">Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease.</a> J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).</li><li>Pleil, J., Angrish, M., Madden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemistry+for+high-throughput+screening+of+human+exhaled+breath+condensate+(EBC)+media+implementation+of+automated+Quanterix+SIMOA+instrumentation.">Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation.</a> J. Breath Res. 9, 047108 (2015).</li><li>Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Proteomic+Strategy+for+Clinical+Biomarker+Discovery.">Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery.</a> Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).</li><li>Wilson, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Simoa+HD-1+Analyzer:+A+Novel+Fully+Automated+Digital+Immunoassay+Analyzer+with+Single-Molecule+Sensitivity+and+Multiplexing.">The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing.</a> J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).</li><li>Rivnak, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully-automated,+six-plex+single+molecule+immunoassay+for+measuring+cytokines+in+blood.">A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood.</a> J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).</li><li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Plasma+Proteome.+History,+character,+and+diagnostic+prospects.">The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).</li><li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISA+in+the+multiplex+era:+Potentials+and+pitfalls.">ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls.</a> Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hierin, beschreven we de ontwikkeling en validatie van een zeer reproduceerbaar, ultrasensitive enkel molecuul matrix digitale ELISA voor directe kwantificering van IFN-α eiwit in menselijke specimens (stappen samengevat in tabel 1). Een van de belangrijkste stappen in de ontwikkeling van de bepaling is de keuze van antilichaam paar16, met de kenmerken in termen van kinetiek en epitoop bindende sleutel tot een succesvolle test. Het is belangrijk om te voorkomen dat het gebruik van gekoppelde monoclonal antilichamen die gericht het dezelfde epitoop of daardoor sterische belemmering. Polyclonal antilichamen kunnen worden gebruikt als detectie antilichamen te overwinnen dergelijke beperkingen. Als bij een bepaalde stap de gewenste gevoeligheid niet is bereikt, moeten verdere optimalisatie mogelijkheden worden overwogen. Hierbij kan het gebruik van alternatieve antilichaam paren, veranderingen in de parameters zoals eiwit type (bijvoorbeeld BSA < caseïne), pH (6.0-8,5), Ionische sterkte, buffercapaciteit (bijvoorbeeld NaCl en fosfaat concentraties), vervoerder kralen en/of aanwezigheid van oppervlakteactieve stoffen. Een groot aantal parameters worden con geoptimaliseerd bij het ontwikkelen van een enkel molecuul matrix assay. Echter over het algemeen voorwaarden die hoge signaal: achtergrond ratio's en minimale LODs geven zijn de voorkeur (Zie Figuur 1en Figuur 2 Figuur 3).
Met betrekking tot de specificiteit, de IFN-α-test toonde geen kruis reactiviteit voor elke andere IFNs getest (β, γ, λ1, λ2, ω) (figuur 4a) en was voor het opsporen van alle 13 IFN-α subtypen (figuur 4b) van. De test toonde echter een lagere affiniteit voor het subtype van IFN-alpha2, (figuur 4b en aanvullende tabel 4). Interessant is dat werden verschillende gevoeligheden voor de verschillende klassen van IFN-alpha2 (a, b, c) ook waargenomen, die veroorzaakt door verschillende productieprocessen of verschillende aminozuur sequenties worden kan, zoals de IFN-alpha2-subtypen zijn verkregen van verschillende commerciële leveranciers. Met deze uitzondering gaf alle soorten van de IFN-α zeer soortgelijke reacties. De specificiteit van de test werd verder aangetoond door de voorbehandeling van de monsters met de anti-IFN-α een kloon, die het signaal (Figuur 6 en aanvullende tabel 6) afgeschaft.
Een van de belangrijkste voordelen van deze technologie is dat elke analyt van belang gerichte16potentieel kan zijn. Bovendien kunnen verschillende biologische monsters worden getest, zoals serum, plasma, cerebrospinale vloeistof, cellulaire lysates, cultuur supernatant31 en zelfs adem32. Een verdunning 1:3 plasma wordt meestal uitgevoerd om te voorkomen dat potentiële verstopping van de Analysator van de matrix één molecuul. Echter de analyt van belang aanwezig kon zijn bij zeer lage concentraties in de relevante biologische steekproef en hogere concentraties van monster wellicht vereist (afhankelijk van de gevoeligheid van de test)33. Hoewel er potentieel is voor multiplexing met behoud van goede vingergevoeligheid34, is het een meer uitdagende proces en testen voor het meten van meer dan 6 eiwitten binnen de dezelfde experimenten hebben nog worden ontwikkeld35.
De mogelijkheid om te detecteren en kwantificeren van cytokines en andere biologische relevante eiwitten bij dergelijke lage concentraties opent een hele nieuwe reeks van toepassingen33,36. Het is algemeen bekend dat talrijke proteïnen oefenen hun effecten zelfs bij zeer lage concentraties, die tot nu toe onder de limiet van de opsporing van de beste ELISAs-37 waren. Terwijl andere immunoassay technologieën voordelen ten opzichte van conventionele ELISA19 bieden, wij laten zien hier dat enkel molecuul matrix digitale ELISA een reproduceerbare en robuust platform voor de ultrasensitive detectie van lage concentratie cytokines in menselijke specimens. Als zodanig is deze technologie biedt enorme mogelijkheden voor de ontdekking van biomarker en verbeterde patiëntenbeheer van een breed scala van ziekten.

Type ik IFNs zijn een familie van cytokines die een centrale rol spelen in het orkestreren van antivirale immuunrespons. Ze werden voor het eerst ontdekt door Isaacs en Lindenmann 60 jaar geleden1,2 en het is nu bekend dat deze heterogene familie van polypeptiden bestaat uit 14 verschillende subklassen (13 IFN-α-subtypen en 1 IFN-β). Type ik IFNs essentieel zijn voor de goedkeuring van virale infecties, maar zijn ook betrokken bij de pathologie van een verscheidenheid van ziekten bij de mens Staten, met inbegrip van de auto-immune aandoeningen systemische lupus erythematosus (SLE), jonge dermatomyositis (JDM), en het type Ik interferonopathies in welk constitutieve type resultaten ik IFN-geïnduceerde signalering in pathologie3,4,5,6,7.
Studeren ik typ IFN proteïne niveaus in biologische monsters sinds de initiële identificatie uitdagende is als een "inmenging stof"1,2. Broodje Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) is momenteel de meest gebruikte methode voor de detectie van IFN-α eiwit. Ondanks het feit dat specifieke, eenvoudige en snelle, typ ik IFN ELISAs huidige belangrijke beperkingen, zoals beperkte gevoeligheid. Daarnaast vereist het meten van alle IFN-α-subtypen het gebruik van meerdere tests elk met hun eigen detectiecapaciteit en gevoeligheid. Hoewel er commerciële ELISAs die verschillende subtypen van IFN-α detecteren, de gevoeligheid is beperkt (1.95 pg/mL, 12,5 pg/mL en 12,5 pg/mL, respectievelijk) die is vaak onvoldoende IFN-α om proteÃ¯ne te ontdekken in biologische monsters. Om deze beperking ondervangen verschillende biologische proxy testen zijn ontwikkeld om te kwantificeren typ ik IFN door het meten van de geïnduceerde genexpressie of functionele activiteit8,9,10,11, 12 , 13 , 14. deze testen bieden echter niet een directe meting van het IFN-α-eiwit.
In deze studie was enkel molecuul matrix digitale ELISA technologie gebruikt om een assay voor het opsporen van één IFN-α eiwitmolecules. Digitale ELISA maakt gebruik van de dezelfde basischemie als conventionele ELISA, echter de reactie vindt plaats in matrices bestaat uit 50.000 individuele 46 femtoliter formaat wells15,16. Één eiwitmolecules zijn gevangen door antilichaam beklede paramagnetisch kralen en gemarkeerd met een biotinyleerd detectieantilichaam, gevolgd door de binding van een enzym-conjugaat, daar-β-galactosidase (SBG). Daarna worden de parels opgeschort met een fluorogenic enzym substraat, resorufin-β-D-galactopyranoside (RGP), in één-molecuul arrays. Reactie 2 miljard keer17, een hoge plaatselijke concentratie van fluorescent signaal wordt bereikt door het verlagen van het volume en enkel molecuul tellingen worden haalbaar is, zoals elke molecuul genereert een signaal dat kan nu betrouwbaar worden gemeten18. In wezen zijn enkel molecuul arrays geschikt voor het tellen van één immunocomplexes en bepaling van een gemiddeld aantal enzymen per kraal (AEB). Tellen van de microwells waarin een signaal wordt gedetecteerd toelaat kwantificering/digitalisering van eiwitmolecules, aangezien er een direct verband tussen eiwitconcentratie en de verhouding tussen immunocomplexed-kralen en parels aanwezig zijn in in totaal de femtoliter middelgrote kamers.
Yeung et al. een studie van de uitgebreide platformonafhankelijke evaluatie met behulp van negen verschillende technologieën en vier cytokine-immunoassay met als doel assay precisie, gevoeligheid en gegevens correlatie te vergelijken tussen de verschillende platformen19uitgevoerd. Een van de belangrijkste bevindingen van de studie was dat enkel molecuul arrays en enkel molecuul immunoassay tellen de hoogste gevoeligheid voor detectie van cytokines in menselijk serum binnen het concentratiebereik van sub-pg/mL gepresenteerd. Enkel molecuul matrix digitale ELISA cytokine testen zijn gebruikt voor het bestuderen van de rol van TNF-α en IL-6 bij ziekte van Crohn ziekte20, IFN-α in interferonopathy en auto-immuunziekten patiënten 7, en de verschillende post-translationally gewijzigd vormen van C-X-C motief chemokine 10 (CXCL10) in chronische hepatitis en gezonde donoren ontvangen sitagliptin21,22. Andere toepassingen omvatten meting van rodopsine bij patiënten met diabetische retinopathie23; de studie van de hersenen pathologieën via metingen van de serum/plasma van neurofilament licht24 en amyloid-β 1-42 peptide25, in het kader van multiple sclerose en de ziekte van Alzheimer, respectievelijk. Enkel molecuul matrix testen kunnen ook worden gebruikt voor detectie van de verbeterde pathogenen zoals karakterisering van de HIV viral reservoir26, en ook voor detectie van DNA27 en micro RNAs28. Een groot voordeel van de technologie van de matrix één molecuul is deze hoge veelzijdigheid, zoals een bepaling tegen elke analyt van belang kan worden ontwikkeld als een paar specifieke antilichaam beschikbaar is. Daarnaast zijn homebrew assay kits commercieel verkrijgbaar, waardoor de ontwikkeling van nieuwe testen, het protocol waarvan gedetailleerd in een gewijzigde vorm hieronder beschreven wordt.
Hier is een gedetailleerde beschrijving van de ontwikkelings- en valideringsfase stappen voor een enkel molecuul matrix assay dat resultaten gepresenteerd in verbeterde gevoeligheid voor IFN-α eiwit detectie. Antilichamen voor enkel molecuul matrix testen moet zeer specifieke, het vermijden van kruis-reactiviteit met de verwante proteïnen (met soorten specificiteit beschouwd indien van toepassing). In het ideale geval moeten antilichamen met een KD kleiner dan 10-9 M worden gekozen; hoge affiniteit zorgt voor een sterke binding met de productie van een hogere signaal. De kinetiek van de antilichaam-antigeen-bindend zijn ook belangrijk, en snel Kop en langzame Kaf zal gunst antigeen-antilichaam complexe vergadering. Beginnen met een paar van antilichaam dat een goede prestatie in klassieke ELISA, met een limiet aantoonbaarheidsgrens (LOD) van 1-100 pg/mL heeft, verhoogt de kans voor het verkrijgen van een hooggevoelige enkel molecuul matrix assay. Chang en collega's uitgevoerd gedetailleerde kinetische studies van de Biomoleculaire interacties bij elke stap, stelt een geheel van vergelijkingen te voorspellen van analytische gevoeligheid18. Zij toonden aan dat enkel molecuul matrix digitale ELISA lijkt effectief binnen een brede waaier van antilichaam affiniteiten (KD ~ 10−11 - 109 M), evenals die signaal-generatie is meer afhankelijk van de op-rate van dergelijke antistoffen.
Voor het gebruik van hoge affiniteit Typ antilichamen die we van antilichamen geïsoleerd van patiënten met het syndroom van auto-immune polyendocrinopathy profiteerde 1/auto-immune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermale dystrofie (APS1/APECED)29. Om redenen die nog niet zijn begrepen, de grote meerderheid van de AIRE-deficiënte personen ontwikkelen een kernset van hoge-avidity antilichamen tegen alle IFN-α subtypen29en we kozen twee anti-IFN-α antilichaam klonen van complementaire bindende affiniteiten voor de verschillende IFN-α subtypes, zoals geraamd door IC50 waarden. De combinatie van deze unieke antilichamen van hoge-affiniteit met enkel molecuul matrix technologie ingeschakeld de directe kwantificering van IFN-α bij concentraties van attomolar (fg/mL). Dergelijke ultrasensitive IFN-α eiwit detectie zal bijdragen tot een beter begrip van de aard, de verordening en de biologische gevolgen van de reactie van IFN-geïnduceerde in andere ziekte instellingen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody A (8H1 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody B (12H5 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody EBI-1 clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody BMS216BK clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216BK</td>
			<td>Not an ELISA kit but bulk abs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2c</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS305</td>
			<td>OK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;I (17)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2b</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;1</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11175-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4a (M1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4b (a4)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11180-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;B2 (a8)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11115-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;C (a10)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;D (a1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11125-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;G (a5)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11135-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;F (a21)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11130-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;H2 (a14)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;J1 (a7)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11160-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;K (a6)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11165-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;WA (a16)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11190-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#969;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#946;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; ELISA</td>
			<td>PBL</td>
			<td>41115.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISRE-Reporter</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>CCS-008L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fu-GENE HD Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Mediuem</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40 Substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer NanoDrop 1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtres</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC505096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Conjugation Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Encoded Paramagnetic Beads</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Wash Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11844071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Blocking Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Diluent Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector and Sample Diluent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylation Reaction Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11891195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>MS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa) reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBG, Bead and Detector Barcode Labels</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Reagent Bottles</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa specimen 96-well plates</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Discs</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa 2.0 conductive Tips</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Cuvettes</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa SBG Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa RGP Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 1</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 2</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing Oil</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa HD-1 Analyzer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa)</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems</td>
			<td>Singluex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;

Het hoofddoel van dit protocol is voor het beschrijven van de ontwikkeling en validatie van een interferon (IFN)-α enkel molecuul matrix digitale Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. Dit systeem maakt het kwantificeren van menselijke IFN-α eiwit met ongekende gevoeligheid, en met geen Kruisallergie voor andere soorten van IFN.
De eerste belangrijke stap van het protocol is de keuze van het antilichaam-paar, gevolgd door de vervoeging van het antilichaam van opname naar paramagnetisch kralen en biotinylation van de detectieantilichaam. Na deze stap, kunnen verschillende parameters zoals assay configuratie, detector antilichaam concentratie en samenstelling van de buffer worden gewijzigd tot optimale gevoeligheid is bereikt. Ten slotte, specificiteit en reproduceerbaarheid van de methode worden beoordeeld om te zorgen voor vertrouwen in de resultaten. Hier, ontwikkelden we een IFN-α enkel molecuul matrix assay met een limiet van detectie van 0,69 fg/mL met behulp van hoge-affiniteit autoantilichamen geïsoleerd van patiënten met biallelic mutaties in het auto-immune regulator (AIRE) eiwit veroorzaakt auto-immune polyendocrinopathy syndroom type 1/auto-immune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermale dystrofie (APS1/APECED). Bovenal ingeschakeld deze antilichamen detectie van alle 13 IFN-α-subtypen.
Deze nieuwe methode kan de detectie en kwantificering van IFN-α eiwit in menselijke biologische monsters bij attomolar concentraties voor de eerste keer. Een dergelijk instrument zullen zeer nuttig zijn bij het toezicht op de niveaus van deze cytokine in gezondheid en ziekte staten, de meeste met name infectie autoimmuniteit en autoinflammation.

Kortom bekleed een pan-IFN-α enkel molecuul matrix assay met een limiet van detectie van 0,69 fg/mL, met behulp van een 2-stap configuratie met capture kralen met 0,3 mg/mL anti-IFN-α een biotinyleerd antilichaam en anti-IFN-α B detectie antilichaam in een verhouding van biotine: antilichaam van 30 werd ontwikkeld. De gebruikte voor biotinyleerd detectieantilichaam en SBG concentraties waren 0,3 µg/mL en 150 uur, respectievelijk. Deze zeer specifieke assay voor het opsporen van alle 13 IFN-α-subtypen van is en kruis niet reageert met andere soort IFNs. Dus, terwijl het is niet mogelijk om te identificeren en kwantificeren van elke afzonderlijke soort IFN-α, alle van hen kan worden gedetecteerd en gemeten geven samen een waarde van de totale concentratie voor IFN-α, die bestaat uit de 13 verschillende subklassen.
Verkennen van de potentiële diagnostische waarde van deze nieuw ontwikkelde assay, IFN-α eiwitten in plasma en serum van gezonde individuen werden gemeten en vergeleken met monsters van patiënten met SLE en JDM. Zoals geïllustreerd in Figuur 7, werden hoge niveaus van IFN-α proteïne ontdekt in beide cohorten van de ziekte in vergelijking met gezonde controles. De stippellijn geeft de LOD voor een conventionele verkrijgbare ELISA, ter illustratie van hoe deze aanpak zou niet detecteren IFN-α eiwit in deze patiëntengroepen ondanks de bekende verenigingen van deze cytokine met deze fenotypen. Bovendien, IFN-α kan worden gekwantificeerd over 5 logs van omvang, ter illustratie van het brede dynamische bereik van de bepaling, met detecteerbare niveaus tussen 1-10 fg/mL bevestiging van de gevoelige aard van de test.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57421/57421fig7.jpg"> Figuur 7: kwantificering van IFN-α eiwitten in plasma en serum van patiënten cohorten. Dit cijfer is gewijzigd van Rodero et al. 2017. de plasma van gezonde controles (n = 20) en patiënten met SLE (n = 72) en JDM (n = 43) werden getest met de pan-IFNα enkel molecuul matrix assay. Analyse werd uitgevoerd met behulp van one-way ANOVA-test (Kruskal-Wallis) en Dunns meerdere vergelijking tussen groepen te testen. Mediaan wordt afgebeeld. Stippellijn geeft LOD voor een verwijzing menselijke anti-IFN-α ELISA (1.95 pg/mL = 1950 fg/mL). <a href="/files/ftp_upload/57421/57421fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Stap</td>
			<td>Overwegingen</td>
			<td>Referentie</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1. antilichaam paar keuze</td>
			<td>Doel verschillende epitopen</td>
			<td rowspan="3">Tabel 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hoge affiniteit</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kop snel / traag Kaf
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2. antilichaam paar oriëntatie</td>
			<td rowspan="3">Kies voorwaarden met de laagste limiet van detectie</td>
			<td rowspan="3">Figuur 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3. het vastleggen van antilichaam concentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>4. biotine: Detector antilichaam verhouding</td>
		</tr>
<tr>
<td>5. 2 vs. 3-stap configuratie</td>
			<td>Kies voorwaarde met de hoogste verhouding van signaal: achtergrond</td>
			<td>Figuur 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6. detector antilichaam concentratie</td>
			<td rowspan="2">Kies voorwaarden met de laagste limiet van detectie</td>
			<td rowspan="2">Figuur 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>7. SBG concentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>8. specificiteit</td>
			<td>Kruisallergie beoordelen</td>
			<td rowspan="2">Figuur 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9. gevoeligheid</td>
			<td>Erkenning van subtypen beoordelen (indien van toepassing)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10. reproduceerbaarheid</td>
			<td>Beoordelen assay variabiliteit</td>
			<td>Figuur 5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: overzicht van stappen voor ontwikkeling en optimalisatie van een enkel molecuul matrix assay. Deze tabel bevat een overzicht van de verschillende stappen die nodig zijn voor de ontwikkeling en de optimalisatie van een enkel molecuul matrix assay, vanaf de eerste keuze van antilichaam paar tot de beoordeling van de reproduceerbaarheid.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antigeen</td>
			<td>8H 1 (A)</td>
			<td>12H 5 (B)</td>
			<td>Sifalimumab</td>
			<td>Rontalizumab</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ1</td>
			<td>28.3</td>
			<td>51,3</td>
			<td>460</td>
			<td>22.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ2</td>
			<td>2563</td>
			<td>10,7</td>
			<td>9.02</td>
			<td>2.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ4</td>
			<td>5.11</td>
			<td>2.99</td>
			<td>35.35</td>
			<td>325.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ5</td>
			<td>2.01</td>
			<td>19.6</td>
			<td>93,29</td>
			<td>2.49</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ6</td>
			<td>64,7</td>
			<td>3.03</td>
			<td>4,97</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ7</td>
			<td>0.9</td>
			<td>0.63</td>
			<td>233,1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ8</td>
			<td>302</td>
			<td>0.83</td>
			<td>691</td>
			<td>10.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ10</td>
			<td>2,54</td>
			<td>0.71</td>
			<td>43.2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ14</td>
			<td>3224</td>
			<td>2.1</td>
			<td>14,52</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ16</td>
			<td>1,83</td>
			<td>32.99</td>
			<td>59.18</td>
			<td>28.65</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ17</td>
			<td>2.21</td>
			<td>0.77</td>
			<td>890.9</td>
			<td>23,86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ21</td>
			<td>2,78</td>
			<td>12.87</td>
			<td>1769</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Pan-alpha antilichaam selectie. IC50 (ng/mL) bepaald met behulp van de interferon-gestimuleerd respons-element (ISRE)-Luciferase neutralisatie assay. Tabel wordt IC50 waarden voor mAbs gebruikt in één molecuul matrix assay voor alle IFN-α subtypen. 10.000 HEK 293 MSR cellen waren geplaatst in witte helft-gebied 96-wells-platen en omgekeerde-transfected met 50 ng vooraf gemengd ISRE-Firefly luciferase verslaggever en Renilla luciferase constructies met behulp van transfectie reagentia volgens de instructies van de fabrikant. De constructie luciferase-uiten diende als een interne normalisatie-besturingselement. Cellen werden 's nachts geïncubeerd in verminderd Serum Medium aangevuld met niet-essentiële aminozuren van 0,1 mM, 1 mM natrium pyruvaat, 0,5% foetale runderserum bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde sfeer. Na een incubatieperiode van overnachting, werden cellen gestimuleerd gedurende 24 uur met medium dat mengsels van recombinante menselijke IFN-α met of zonder anti-IFN-α mAbs of besturingselement IgG, die had zijn gepreïncubeerd gedurende 1 uur bij 37 ° C. Na 24u van stimulatie, werden dubbele luciferase verslaggever testen uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. «-» Niet bepaald. Sifalimumab is een volledig mens, immunoglobulin G1 κ monoklonaal antilichaam dat bindt en neutraliseert de meerderheid van IFN-α subtypen; Rontalizumab is een Latijnse monoclonal antilichaam tegen IFN-α. Aangepast van Meyer et al. 2016 en Rodero et al. 2017.
Aanvullende tabel 1: selectie van antilichaam oriëntatie, capture antilichaam concentratie op kralen en biotinylation verhouding. De twee verschillende mogelijke configuraties werden getest, met behulp van de anti-IFN-α-A als vangen antilichaam en anti-IFN-α B als detectie antilichaam (A), en vice versa (B). IFNα - 2c werd gebruikt als antigeen. Verschillende vangen antilichaam concentraties evenals biotine: antilichaam (B:A) ratio's werden ook voor beide configuraties getest. Verzadiging (Sat). Oranje: AEB waarden die werden gebruikt voor de berekening van de LOD; deze concentraties werden gezien als blanco als de waarden van de AEB bleef stabiel. LOD werd berekend als lege bedoel + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_1.xlsx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 2: Test van 2 vs 3-stap configuratie. De 2 en 3 - stap configuraties werden beoordeeld met behulp van IFNα - 2c als antigeen. AEB worden ook als signaal/achtergrond rantsoenen (S/B) waarden weergegeven voor beide voorwaarden. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_2.xlsx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 3: Detector en SBG concentratie optimalisatie. Drie verschillende concentraties van biotinyleerd detector antilichaam (0.1, 0.3 en 0.6 µg/mL) samen met drie verschillende concentraties van SBG (50, 150 en 250 uur) werden beoordeeld. AEB waarden weergegeven voor de negen geteste voorwaarden. Oranje: AEB waarden die werden gebruikt voor de berekening van de LOD; deze concentraties werden gezien als blanco als de waarden van de AEB bleef stabiel. LOD werd berekend als lege bedoel + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_3.xlsx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 4: specificiteit en de gevoeligheid van de geoptimaliseerde IFNα enkel molecuul matrix assay. Gemiddelde enzym per kralen waarden worden weergegeven wanneer IFN-β, IFN-λ1 IFN-λ2, IFN-ω en IFN-γ recombinante eiwitten werden getest (A), samen met de 16 subtypen van IFN-α (B). «-» Niet bepaald. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_4.xlsx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 5: reproduceerbaarheid van de geoptimaliseerde IFNα enkel molecuul matrix assay. De gemiddelde waarden van het AEB voor alle onafhankelijke driemaal zijn komen opdagen bij een concentratie van 10.000 fg/mL. «-» Niet bepaald. Verzadiging (Sat). <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_5.xlsx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 6: eiwit competitie assay. Gemiddelde enzym per kralen waarden voor alle omstandigheden getest weergegeven worden. Metingen werden gedaan in tweevoud. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_6.xlsx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃŽÂ± at JoVE.com

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Hier presenteren we een protocol om te beschrijven van de ontwikkeling en validatie van een enkel molecuul matrix digitale Analyse ELISA, waarmee de ultra gevoelige detectie van alle IFN-α subtypen in menselijke specimens.

Ontwikkeling en validatie van een Ultrasensitive enkel molecuul Array digitale Enzyme-linked Immunosorbent Assay voor menselijk Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Kwantificering van de Th-1 cellulaire immuunreacties tegen microbiële antigenen

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Use of Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Het gebruik van interferon-γ Enzyme-linked immunospot Assay om nieuwe T-cel epitopen van het humaan papillomavirus karakteriseren

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Karakterisering van inflammatoire reacties tijdens intranasale kolonisatie met Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Visualiseren eiwit-DNA-interacties in levende bacteriële cellen met behulp Photoactivated Enkelmolecuul Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Toepassing van Lange-termijn gekweekte interferon-γ Enzyme-linked immunospot Assay voor het beoordelen van effector en geheugen T cel responsen in Vee

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Ontwikkeling en validatie van een kwantitatieve PCR-methode voor equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Oprichting van een High-throughput Setup voor het screenen van kleine moleculen die Moduleer c-di-GMP Signalering in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Assay van Adhesie Under Shear Stress voor de Studie van T-lymfocyten-Adhesie Molecule Interacties

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Meten Influenza neuraminidase Remming antilichaamtiters door Enzyme-linked lectine Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...