Name: development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;
Uploaded: 2018-06-14T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃŽÂ± at JoVE.com

DD et CJJ souligner le soutien de l’ANR (projet IFNX, aucun. CE17001002) et ImmunoQure AG pour la fourniture des anticorps monoclonaux. Nous remercions Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki et Pierre Quartier de fournir des échantillons cliniques. CJJ reconnaît l’European Research Council (GA 309449 : bourse pour CJJ) et une subvention d’Etat géré par l’Agence nationale de la recherche (France) en vertu du programme « Investissements pour l’avenir », portant la référence ANR-10-IAHU-01.

<ol>
	<li>Isaacs, A., Lindenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classics+in+Oncology+Virus+Interference:+I.+The+Interferon.">Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).</li><li>Isaacs, A., Lindenmann, J., Valentine, R. C., Alerts, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pillars+Article:+Virus+Interference.+II.+Some+Properties+of+Interferon.">Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).</li><li>Hunt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombotic+Microangiopathy+Associated+with+Interferon+Beta.">Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta.</a> N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).</li><li>Hooks, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Interferon+in+the+Circulation+of+Patients+with+Autoimmune+Disease.">Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease.</a> N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).</li><li>Greenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-alpha/beta+Mediated+Innate+Immune+Mechanisms+in+Dermatomyositis.">Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis.</a> Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).</li><li>Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+interferonopathies+a+novel+set+of+inborn+errors+of+immunity.">Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).</li><li>Rodero, M. P., Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+interferon+-+mediated+monogenic+autoinflammation:+The+type+I+interferonopathies,+a+conceptual+overview.">Type I interferon - mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview.</a> J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).</li><li>Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+biological+assay+for+interferons.">A sensitive biological assay for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).</li><li>Meager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+assays+for+interferons.">Biological assays for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).</li><li>Hua, J., Kirou, K., Lee, C., Crow, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Assay+of+Type+I+Interferon+in+Systemic+Lupus+Erythematosus+Plasma+and+Association+With+Anti+-+RNA+Binding+Protein+Autoantibodies.">Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti - RNA Binding Protein Autoantibodies.</a> Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).</li><li>Niewold, T. B., Kariuki, S. N., Morgan, G. A., Shrestha, S., Pachman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+serum+interferon-alpha+activity+in+juvenile+dermatomyositis:+associations+with+disease+activity+at+diagnosis+and+after+thirty-six+months+of+therapy.">Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy.</a> Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).</li><li>Seo, Y., Kim, G., Kwak, H., Nam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+HeLa+Mx2+/+Luc+Reporter+Cell+Line+for+the+Quantification+of+Human+Type+I+Interferons.">Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons.</a> Pharmacology. 84, 135-144 (2009).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+surface+expression+of+Fc&#947;+receptor+RI+(+CD64+),+a+biomarker+reflecting+type-I+interferon+levels+in+systemic+lupus+erythematosus.">Monocyte surface expression of Fc&#947; receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).</li><li>Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Vesicular+Stomatitis+Virus+Replicon-Based+Bioassay+for+the+Rapid+and+Sensitive+Determination+of+Multi-Species+Type+I+Interferon.">A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon.</a> PLoS One. 6, e25858 (2011).</li><li>Rissin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assay+detects+serum+proteins+at+subfemtomolar+concentrations.">Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations.</a> Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).</li><li>Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+array+(Simoa)+assay+with+optimal+antibody+pairs+for+cytokine+detection+in+human+serum+samples.">Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples.</a> R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).</li><li>Simoa. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+Principle+of+SimoaTM+(Single+Molecule+Array)+Technology.">Scientific Principle of SimoaTM (Single Molecule Array) Technology.</a> Whitepaper 1.0. , 1-2 (2013).</li><li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assays+Theoretical+considerations.">Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations.</a> J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).</li><li>Yeung, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+highly+sensitive+immunoassay+technologies+for+quantitative+measurements+of+sub-pg+/+mL+levels+of+cytokines+in+human+serum.">Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum.</a> J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+measurements+of+tumor+necrosis+factor+&#945;+and+interleukin-6+in+the+plasma+of+patients+with+Crohn's+disease.">Single molecule measurements of tumor necrosis factor &#945; and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease.</a> J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).</li><li>Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Changes+of+Post-Translationally+Modified+Forms+of+CXCL10+and+Soluble+DPP4+in+HCV+Subjects+Receiving+Interferon-Free+Therapy.">Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy.</a> PLoS One. 10, e0133236 (2015).</li><li>Decalf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+DPP4+activity+in+humans+establishes+its+in+vivo+role+in+CXCL10+post-translational+modification:+prospective+placebo-controlled+clinical+studies.">Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies.</a> EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).</li><li>Rabing Brix Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+in+plasma+from+patients+with+diabetic+retinopathy+-+development+and+validation+of+digital+ELISA+by+Single+Molecule+Array+(Simoa)+technology.">Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy - development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology.</a> J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).</li><li>Disanto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+Neurofilament+Light:+A+Biomarker+of+Neuronal+Damage+in+Multiple+Sclerosis.">Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis.</a> Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+ultrasensitive+measurement+of+amyloid-+&#946;+1+-+42+peptide+in+human+plasma+with+utility+for+studies+of+Alzheimer's+disease+therapeutics.">A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- &#946; 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics.</a> Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).</li><li>Passaes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+HIV-1+p24+Assay+Detects+Single+Infected+Cells+and+Differences+in+Reservoir+Induction+by+Latency+Reversal+Agents.">Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents.</a> J. Virol. 91, e02296 (2017).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Detection+of+Bacterial+Genomic+DNA+at+Sub-Femtomolar+Concentrations+Using+Single+Molecule+Arrays.">Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays.</a> Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).</li><li>Cohen, L., Hartman, M. R., Amardey-wellington, A., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+direct+detection+of+microRNAs+using+single+molecule+arrays.">Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays.</a> Nucleic Acids Res. 45, e137 (2017).</li><li>Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AIRE-Deficient+Patients+Harbor+Unique+High-Affinity+Disease-Ameliorating+Autoantibodies.">AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies.</a> Cell. 166, 582-595 (2016).</li><li>Simoa. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homebrew+Assay+Development+Guide.">Homebrew Assay Development Guide.</a> Simoa HD-1 Analyzer &amp; Quanterix SR-X. User-0021 08. , (2017).</li><li>Rodero, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+interferon+alpha+protein+reveals+differential+levels+and+cellular+sources+in+disease.">Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease.</a> J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).</li><li>Pleil, J., Angrish, M., Madden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemistry+for+high-throughput+screening+of+human+exhaled+breath+condensate+(EBC)+media+implementation+of+automated+Quanterix+SIMOA+instrumentation.">Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation.</a> J. Breath Res. 9, 047108 (2015).</li><li>Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Proteomic+Strategy+for+Clinical+Biomarker+Discovery.">Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery.</a> Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).</li><li>Wilson, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Simoa+HD-1+Analyzer:+A+Novel+Fully+Automated+Digital+Immunoassay+Analyzer+with+Single-Molecule+Sensitivity+and+Multiplexing.">The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing.</a> J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).</li><li>Rivnak, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully-automated,+six-plex+single+molecule+immunoassay+for+measuring+cytokines+in+blood.">A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood.</a> J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).</li><li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Plasma+Proteome.+History,+character,+and+diagnostic+prospects.">The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).</li><li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISA+in+the+multiplex+era:+Potentials+and+pitfalls.">ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls.</a> Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons décrit dans les présentes, le développement et la validation d’une molécule hautement reproductible, ultrasensible tableau numérique ELISA pour la quantification directe de protéine IFN-α dans des échantillons humains (étapes résumées dans le tableau 1). Une des étapes plus critiques dans le développement du dosage est le choix de la paire anticorps16, avec les caractéristiques en termes de cinétique et épitope liaison clé à un essai réussi. Il est important d’éviter l’utilisation d’anticorps monoclonaux appariés qui ciblent le même épitope ou qui cause empêchement stérique. Des anticorps polyclonaux pourraient servir d’anticorps de détection pour surmonter ces limitations. Si à une étape donnée la sensibilité souhaitée n’est pas atteint, possibilités d’optimisation doivent être examinées. Ceci peut inclure l’utilisation de paires de rechange anticorps, modifications des paramètres comme le type de protéine (p. ex. BSA < caséine), pH (6,0-8,5), force ionique, capacité tampon (p. ex. les concentrations de NaCl et de phosphate), perles de transporteur ou présence d’agents tensio-actifs. Une large gamme de paramètres con optimisée lors du développement d’un test de tableau seule molécule. Toutefois, dans l’ensemble, les conditions qui donnent aux ratios signal : ambiants et LODs minimes sont ceux préféré (voir la Figure 1, Figure 2et Figure 3).
Au sujet de la spécificité, le dosage de l’IFN-α a montré aucune réactivité croisée pour n’importe quel autres interférons ne testé (β, γ, λ1, λ2, ω) (Figure 4 a) et a été capable de détecter tous les sous-types d’IFN-α 13 (Figure 4 b). Toutefois, l’analyse a montré une affinité plus faible pour le sous-type de l’IFN-α2, (Figure 4 b et 4 de Table supplémentaire). Fait intéressant, des sensibilités différentes pour les différentes catégories d’IFN-α2 (a, b, c) ont aussi été observées, qui peut être due à des procédés de fabrication distinctes ou des séquences d’acides aminés différents, comme les sous-types d’IFN-α2 proviennent de différents utilitaires fournisseurs. À cette seule exception, toutes les espèces de l’IFN-α a donné des réponses très similaires. La spécificité de l’essai a été davantage démontrée par prétraitement des échantillons avec un anti-IFN-α un clone, qui a abrogé le signal (Figure 6 et supplémentaires Tableau 6).
L’un des principaux avantages de cette technologie est que toute substance d’intérêt peut être potentiellement ciblées16. En outre, différents spécimens biologiques peuvent être testés, comme le sérum, plasma, liquide céphalorachidien, lysats cellulaires, les surnageants de culture31 et même souffle32. Habituellement, une dilution de 1:3 de plasma est effectuée pour éviter l’obstruction des potentiels de l’analyseur de tableau seule molécule. Toutefois, l’analyte d’intérêt pourrait être présent en très faibles concentrations dans l’échantillon biologique pertinente et des concentrations plus élevées de l’échantillon peuvent être nécessaire (selon la sensibilité de l’éssai)33. Bien qu’il y a potentiel pour le multiplexage tout en conservant la bonne sensibilité34, c’est un processus plus difficile et des essais pour mesurer plus de 6 protéines à l’intérieur les mêmes expériences ont encore d’être mis au point35.
La capacité de détecter et de quantifier des cytokines et autres protéines biologiques pertinentes à ces faibles concentrations ouvre une toute nouvelle gamme d’applications33,,36. Il est bien connu que les nombreuses protéines exercent leurs effets même à très faibles concentrations, qui jusqu'à présent étaient inférieures au seuil de détection de la meilleure des tests ELISA37. Alors que les autres technologies d’immunoessai offrent des avantages sur les classiques ELISA19, nous démontrons ici que seule molécule tableau numérique ELISA est une plate-forme fiable et reproductible pour la détection ultrasensible des cytokines de faible concentration en échantillons humains. Par conséquent, cette technologie offre un énorme potentiel pour la découverte de biomarqueurs et une meilleure gestion de patients d’un large éventail de maladies.

Type j’ai interférons sont une famille de cytokines qui jouent un rôle central dans l’orchestration des réponses immunitaires antivirales. Ils ont été découverts par Isaacs et Lindenmann 60 ans il y a1,2 et il sait maintenant que cette famille hétérogène de polypeptides comprend 14 différentes sous-classes (13 sous-types d’IFN-α et 1 IFN-β). Type I IFNs sont essentiels à l’apurement des infections virales, mais ont également été impliqués dans la pathologie des divers États de la maladie humaine, y compris les maladies auto-immunes lupus érythémateux systémique (les), dermatomyosite juvénile (JDM), et le type J’ai interferonopathies dans quel type de comportement j’induite par l’IFN signalisation résulte en pathologie3,4,5,6,7.
Étudier la protéine IFN de type I dans les échantillons biologiques a été difficile depuis son identification initiale comme une « ingérence substance »1,2. Actuellement, "sandwich" Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) est la méthode la plus largement utilisée pour la détection de la protéine de l’IFN-α. En dépit d’être précis, simple et rapide, j’ai taper présentes limitations importantes IFN ELISA, comme la sensibilité limitée. En outre, la mesure de tous les sous-types de l’IFN-α nécessite l’utilisation de multiples essais chaque avec leur propre capacité de détection et de la sensibilité. Bien qu’il existe des tests ELISA commerciales détectant les différents sous-types de l’IFN-α, leur sensibilité est limitée (1,95 pg/mL, 12,5 pg/mL et 12,5 pg/mL, respectivement) qui est souvent insuffisant pour détecter les protéines de l’IFN-α dans des échantillons biologiques. Pour contourner cette limitation, les proxy biologique plusieurs épreuves ont été développées pour quantifier de type I NIA en mesurant l’expression des gènes induits ou activité fonctionnelle8,9,10,11, 12 , 13 , 14. Néanmoins, ces tests ne fournissent pas une mesure directe de la protéine de l’IFN-α.
Dans cette étude, seule molécule tableau numérique ELISA technologie a été utilisée pour développer un test permettant la détection de molécules de protéines uniques IFN-α. ELISA numérique utilise la même base en chimie comme ELISA classique, cependant, la réaction a lieu dans des tableaux comprenant 50 000 individuels 46 femtoliter taille puits15,16. Molécules protéiques unique sont capturés par des billes paramagnétiques revêtus d’anticorps et étiquetés avec un anticorps de détection biotinylé, suivi par la liaison d’un conjugué d’enzyme, streptavidine-β-galactosidase (SBG). Par la suite, les perles sont suspendues avec un substrat de l’enzyme fluorogène, résorufine-β-D-galactopyranoside (RGP), dans les tableaux de simple-molécule. En diminuant le volume réaction 2 milliards de fois17, une forte concentration locale de signal fluorescent est atteint et comtes de molécules simples devenus possibles, car chaque molécule génère un signal qui peut maintenant être fiable mesuré18. Essentiellement les tableaux seule molécule sont capables de compter immunocomplexes unique et de déterminer un nombre moyen d’enzymes par perle (AEB). Compter les micropuits où un signal est détecté permet de quantification/numérisation des molécules de protéines, tel qu’il existe une corrélation directe entre la concentration de protéines et le rapport entre immunocomplexed-perles et un nombre total de perles présentes dans les chambres de taille femtoliter.
Yeung et al. effectué une étude d’évaluation de multi-plateforme étendue à l’aide de neuf différentes technologies et quatre cytokine immuno-essais avec le but de comparer la précision du dosage, la sensibilité et la corrélation des données à travers les différentes plateformes19. Une des principales conclusions de l’étude était que les baies de la molécule unique et seule molécule comptage immuno-essai présenté la sensibilité la plus élevée pour la détection des cytokines dans le sérum humain dans le secteur de concentration sub-pg/mL. Tests de cytokine seule molécule tableau numériques ELISA ont été utilisés pour étudier le rôle de TNF-α et IL-6 dans la maladie de Crohn maladie20, IFN-α en interferonopathy et auto-immunes patients 7, et les différents modifiées post-traductionnellement formes de C-X-C motif chemokine 10 (CXCL10) hépatite chronique et de donneurs sains recevant la sitagliptine21,22. Autres applications incluent la mesure de la rhodopsine chez les patients atteints de rétinopathie diabétique23; l’étude des pathologies du cerveau par le biais de mesures de sérum/plasma des neurofilaments light24 et β-amyloïde 1-42 peptide25, dans le cadre de la sclérose en plaques et la maladie d’Alzheimer, respectivement. Molécule unique tableau dosages permet également meilleure détection de pathogènes tels que la caractérisation du réservoir viral du VIH26, ainsi que pour la détection d’ADN27 et micro RNAs28. Un avantage majeur de la technologie seule molécule est cette grande polyvalence, comme un test contre les analytes d’intérêt peut être développé si une paire de l’anticorps spécifique est disponible. En outre, homebrew test kits sont disponibles dans le commerce, permettant le développement de nouveaux tests, le protocole qui est détaillé dans une forme modifiée ci-dessous.
Ici, une description détaillée des étapes de développement et de validation pour un dosage de tableau seule molécule est présentée qui résulte en une sensibilité accrue pour la détection de protéines d’IFN-α. Pour seule molécule tableau des dosages des anticorps doivent être très précis, évitant une réactivité croisée avec les protéines apparentées (avec la spécificité d’espèce a examiné le cas échéant). Idéalement, les anticorps avec un plus petit que 10-9 M KD devraient être choisis ; affinité élevée assure une liaison forte, avec la production d’un signal plus élevé. La cinétique de la liaison anticorps-antigène sont également importantes et rapides Ksur et lent Klarge privilégiera assemblage complexe antigène-anticorps. Commençant par une paire d’anticorps ayant une bonne performance dans ELISA classique, avec une limite de détection (LD) de 1 à 100 pg/mL, augmente les chances d’obtenir un dosage de tableau très sensible seule molécule. Chang et ses collègues effectué des études détaillées de cinétiques des interactions biomoléculaires qui se produisent à chaque étape, proposant un ensemble d’équations pour prédire la sensibilité analytique18. Ils ont montré ce tableau unique molécule ELISA numérique semble être efficace dans un large éventail des affinités d’anticorps (KD ~ 10−11 - 10−9 M), ainsi que cette génération de signal dépend davantage de la sur-taux de ces anticorps.
Pour utiliser une affinité élevée anticorps que nous avons profité des anticorps isolées de patients atteints du syndrome de la polyendocrinopathie auto-immune de type 1/autoimmun dystrophie Polyendocrinopathie-candidose-ectodermique (APS1/APECED)29. Pour des raisons qui ne sont pas encore compris, la grande majorité des personnes déficientes en AIRE développer un ensemble de haut-avidité des anticorps contre sous-types29de l’IFN-α tous, et nous avons choisi deux clones d’anticorps anti-IFN-α des affinités de liaison complémentaire pour les différents sous-types de IFN-α, selon les estimations de valeurs50 IC. L’Association de ces anticorps de haute affinité uniques avec la technologie seule molécule à permis la quantification directe de l’IFN-α à des concentrations d’attomolar (µg/mL). Une détection ultrasensible de protéine IFN-α contribuera à une meilleure compréhension de la nature, la réglementation et l’impact biologique de la réponse induite par l’IFN dans les paramètres de différentes maladies.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody A (8H1 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody B (12H5 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody EBI-1 clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody BMS216BK clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216BK</td>
			<td>Not an ELISA kit but bulk abs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2c</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS305</td>
			<td>OK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;I (17)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2b</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;1</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11175-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4a (M1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4b (a4)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11180-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;B2 (a8)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11115-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;C (a10)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;D (a1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11125-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;G (a5)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11135-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;F (a21)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11130-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;H2 (a14)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;J1 (a7)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11160-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;K (a6)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11165-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;WA (a16)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11190-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#969;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#946;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; ELISA</td>
			<td>PBL</td>
			<td>41115.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISRE-Reporter</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>CCS-008L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fu-GENE HD Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Mediuem</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40 Substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer NanoDrop 1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtres</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC505096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Conjugation Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Encoded Paramagnetic Beads</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Wash Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11844071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Blocking Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Diluent Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector and Sample Diluent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylation Reaction Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11891195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>MS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa) reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBG, Bead and Detector Barcode Labels</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Reagent Bottles</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa specimen 96-well plates</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Discs</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa 2.0 conductive Tips</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Cuvettes</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa SBG Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa RGP Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 1</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 2</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing Oil</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa HD-1 Analyzer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa)</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems</td>
			<td>Singluex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;

Le principal objectif du présent protocole est de décrire le développement et la validation d’un interféron (IFN)-essai de α seule molécule tableau numérique Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA). Ce système permet la quantification de la protéine humaine IFN-α avec une sensibilité sans précédent et aucune réaction croisée pour d’autres espèces de l’IFN.
La première étape clée du protocole est le choix de la paire d’anticorps, suivie par la conjugaison de l’anticorps de capture à billes paramagnétiques et biotinylation de l’anticorps de détection. Après cette étape, les différents paramètres tels que la configuration de l’épreuve, la concentration d’anticorps détecteur et composition du tampon peuvent être modifiés jusqu'à l’obtention d’une sensibilité optimale. Enfin, la spécificité et la reproductibilité de la méthode sont évalués afin d’assurer la confiance dans les résultats. Ici, nous avons développé un test de tableau IFN-α seule molécule avec une limite de détection de 0,69 µg/mL à l’aide d’auto-anticorps de grande affinité isolées de patients présentant des mutations bialléliques dans la protéine auto-immune regulator (AIRE) causant polyendocrinopathie auto-immune le syndrome type 1/autoimmun Polyendocrinopathie-candidose-ectodermique dystrophie (APS1/APECED). Ce qui est important, ces anticorps a permis la détection de tous les sous-types d’IFN-α 13.
Cette nouvelle méthode permet la détection et la quantification des protéines de l’IFN-α dans des échantillons biologiques humains à des concentrations d’attomolar pour la première fois. Un tel outil sera très utile dans la surveillance des niveaux de cette cytokine dans la santé humaine et les États de la maladie, plus particulièrement l’infection, l’auto-immunité et autoinflammation.

En résumé, un essai de tableau de pan-IFN-α seule molécule avec une limite de détection de 0,69 µg/mL, en utilisant une configuration 2-étape avec des perles de capture enduit 0,3 mg/ml d’anti-IFN-α un anti-IFN-α et l’anticorps B détection anticorps biotinylé, à un taux de biotine : anticorps de 30 a été développé. Les concentrations utilisées pour les anticorps de détection biotinylé et SBG étaient 0,3 µg/mL et 150 h, respectivement. Ce test très spécifique est capable de détecter tous les sous-types d’IFN-α 13 et ne réagit pas croisées avec d’autres type d’interférons. Ainsi, s’il n’est pas possible d’identifier et de quantifier chaque espèce individuelle d’IFN-α, chacun d’eux peut être détectée et mesurées ensemble en donnant une valeur de la concentration totale d’IFN-α, qui comprend les 13 différentes sous-classes.
Pour explorer la valeur diagnostique potentielle de ce nouveau test, protéine IFN-α dans le plasma et le sérum d’individus sains ont été mesurées et comparées avec des échantillons provenant de patients atteints de SLE et JDM. Tel qu’illustré à la Figure 7, niveaux élevés de protéine de l’IFN-α ont été détectés dans les deux cohortes de la maladie comparativement aux groupes témoins sains. La ligne pointillée indique la limite de détection d’un ELISA disponible dans le commerce classique, illustrant comment cette approche ne détecterait pas protéine IFN-α dans ces groupes de patients malgré l’association connue de cette cytokine avec ces phénotypes. En outre, IFN-α quantifiables sur 5 journaux de magnitude, illustrant la gamme dynamique de l’essai, avec des niveaux détectables entre 1 à 10 µg/mL, confirmant le caractère hautement sensible du dosage.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57421/57421fig7.jpg"> Figure 7 : Quantification des protéines d’IFN-α dans le plasma et le sérum de cohortes de patients. Ce chiffre a été modifié par Rodero et al. 2017. plasma de sujets témoins sains (n = 20) et les patients souffrant de SLE (n = 72) et JDM (n = 43) ont été testés avec le test de tableau de molécule unique pan-IFNα. L’analyse a effectué un test ANOVA monodirectionnelle (Kruskal-Wallis) et Dunn comparaison plusieurs tests entre les groupes. Médiane est représentée. Ligne pointillée indique LOD d’un référence humaine anti-IFN-α ELISA (1,95 pg/mL = 1950 µg/mL). <a href="/files/ftp_upload/57421/57421fig7large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Étape</td>
			<td>Considérations</td>
			<td>Référence</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1. choix de paire anticorps</td>
			<td>Différents épitopes cibles</td>
			<td rowspan="3">Tableau 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Haute affinité</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rapide Ksur / lent Koff
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2. orientation de paire anticorps</td>
			<td rowspan="3">Choisir des conditions à la limite de détection le plus bas</td>
			<td rowspan="3">Figure 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3. concentration d’anticorps de capture</td>
		</tr>
<tr>
<td>4. rapport biotine : détecteur</td>
		</tr>
<tr>
<td>5. 2 vs 3 étapes configuration</td>
			<td>Choisissez condition avec le plus haut ratio Signal : fond</td>
			<td>Figure 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6. concentration en anticorps détecteur</td>
			<td rowspan="2">Choisir des conditions à la limite de détection le plus bas</td>
			<td rowspan="2">Figure 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>7. concentration de SBG</td>
		</tr>
<tr>
<td>8. spécificité</td>
			<td>Évaluer la réactivité croisée</td>
			<td rowspan="2">Figure 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9. sensibilité</td>
			<td>Évaluer la reconnaissance des sous-types (si applicable)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10. reproductibilité</td>
			<td>Évaluer la variabilité du dosage</td>
			<td>La figure 5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Résumé des étapes de développement et l’optimisation d’un test de tableau unique molécule. Ce tableau résume les différentes étapes nécessaires à l’élaboration et l’optimisation d’un test de tableau molécule unique, depuis le choix initial de paire d’anticorps jusqu'à l’évaluation de la reproductibilité.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antigène</td>
			<td>8H 1 (A)</td>
			<td>12H 5 (B)</td>
			<td>Sifalimumab</td>
			<td>Rontalizumab</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ1</td>
			<td>28,3</td>
			<td>51.3</td>
			<td>460</td>
			<td>22.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ2</td>
			<td>2563</td>
			<td>10.7</td>
			<td>9.02</td>
			<td>2.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ4</td>
			<td>5.11</td>
			<td>2.99</td>
			<td>35,35</td>
			<td>325,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ5</td>
			<td>2.01</td>
			<td>19.6</td>
			<td>93,29</td>
			<td>2.49</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ6</td>
			<td>64,7</td>
			<td>3.03</td>
			<td>4.97</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ7</td>
			<td>0,9</td>
			<td>0,63</td>
			<td>233.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ8</td>
			<td>302</td>
			<td>0,83</td>
			<td>691</td>
			<td>10,86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ10</td>
			<td>2.54</td>
			<td>0,71</td>
			<td>43,2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ14</td>
			<td>3224</td>
			<td>2.1</td>
			<td>14,52</td>
			<td>0,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ16</td>
			<td>1.83</td>
			<td>32.99</td>
			<td>59,18</td>
			<td>28,65</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ17</td>
			<td>2.21</td>
			<td>0,77</td>
			<td>890,9</td>
			<td>23,86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ21</td>
			<td>2.78</td>
			<td>12.87</td>
			<td>1769</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : sélection d’anticorps Pan-alpha. IC50 (ng/mL) déterminée à l’aide de l’élément de réponse stimulée par l’interféron (sier)-analyse de Luciferase neutralisation. Tableau des valeurs d’IC50 du mAbs utilisé dans essai de tableau de molécule unique pour tous les sous-types de l’IFN-α. 10 000 cellules HEK 293 MSR ont été ensemencées en plaques à 96 puits moitié-zone blanches et inverse-transfectées avec 50 ng prémélangée sier-Firefly luciferase reporter et constructions de luciférase Renilla utilisant des réactifs de transfection selon les instructions du fabricant. La construction de la luciférase exprimant a servi un contrôle interne normalisation. Cellules ont été incubées pendant la nuit dans un milieu sérum réduit additionné de 0,1 mM des acides aminés non essentiels, pyruvate de sodium 1 mM, sérum de veau fœtal de 0,5 % à 37 ° C, 5 % de CO2 dans une atmosphère humidifiée. Après une nuit d’incubation, les cellules sont stimulées pendant 24 h avec un milieu contenant des mélanges de humaine recombinante IFN-α avec ou sans anti-IFN-α mAbs ou contrôle IgG qui avait été préincubé pendant 1 h à 37 ° C. Après 24 h de stimulation, dual luciferase reporter analyses ont été effectuées selon les instructions du fabricant. «- » Non déterminé. Sifalimumab est un entièrement humain, immunoglobuline G1 κ anticorps monoclonal qui se lie à et neutralise la plupart des sous-types de l’IFN-α ; Rontalizumab est un anticorps monoclonal humanisé contre IFN-α. Adapté de Meyer et coll. 2016 et Rodero et al. 2017.
Supplémentaire tableau 1 : sélection de l’orientation de l’anticorps, capturer la concentration d’anticorps sur les perles et ratio biotinylation. Les deux configurations différentes possibles ont été testées, en utilisant l’anti-IFN-α A comme anticorps de capture et anti-IFN-α B comme détection anticorps (A) et vice versa (B). IFNα - 2C a été utilisé comme antigène. Concentrations d’anticorps de capture différents ainsi que les ratios de biotine : anticorps (B:A) ont aussi été testés pour les deux configurations. Saturation (Sat). Orange : Valeurs d’AEB qui ont été utilisés pour le calcul de LOD ; ces concentrations étaient considérées comme vierges comme valeurs AEB est demeurés stables. LOD est calculé comme le signifie vide + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_1.xlsx">s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Supplémentaires Tableau 2 : Test de configuration 3-étape 2 vs. Les configurations d’étape 2 et 3 - ont été évaluées à IFNα - 2C comme antigène. AEB valeurs aussi bien comme signal/fond des rations (S/B) sont indiquées pour les deux conditions. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_2.xlsx">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Supplémentaires Tableau 3 : optimisation de concentration détecteur et SBG. Trois concentrations différentes de biotinylé de détecteur (0,1, 0,3 et 0,6 µg/mL) avec trois concentrations différentes de SBG (50, 150 et 250 pM) ont été évaluées. AEB valeurs sont indiquées pour les neuf conditions testées. Orange : Valeurs d’AEB qui ont été utilisés pour le calcul de LOD ; ces concentrations étaient considérées comme vierges comme valeurs AEB est demeurés stables. LOD est calculé comme le signifie vide + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_3.xlsx">s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Supplémentaires Tableau 4 : spécificité et la sensibilité du dosage optimisé IFNα seule molécule tableau. Enzyme moyenne par valeurs de perles sont indiqués lorsque les IFN-β, IFN-λ1, λ2-IFN, IFN-ω et IFN-γ protéines recombinantes ont été testés (A), ainsi que les 16 sous-types d’IFN-α (B). «- » Non déterminé. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_4.xlsx">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Complémentaires tableau 5 : reproductibilité du dosage optimisé IFNα seule molécule tableau. Les valeurs moyennes de la DGVE pour tous trois essais indépendants figurent vers le haut à une concentration de 10.000 µg/mL. «- » Non déterminé. Saturation (Sat). <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_5.xlsx">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Supplémentaires Tableau 6 : test de concurrence protéine. Enzyme moyen par les perles, les valeurs sont indiquées pour toutes les conditions testées. Des mesures ont été effectuées en double. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_6.xlsx">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃŽÂ± at JoVE.com

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Nous présentons ici un protocole visant à décrire le développement et la validation d’une seule molécule tableau numérique analyse d’ELISA, qui permet la détection ultrasensible de tous les sous-types d’IFN-α dans des échantillons humains.

Développement et Validation d’une seule molécule ultrasensible de tableau numérique Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human interféron-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

ELISA immunospot (ELISPOT): Quantification des Th-1 réponses immunitaires cellulaires contre des antigènes microbiens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Recherche

Immunologie et infection

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Use of Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Utilisation de l&#39;interféron γ-enzymatique de dosage immunoenzymatique pour caractériser les nouveaux épitopes de lymphocytes T de virus du papillome humain

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Caractérisation des réponses inflammatoires au cours de la colonisation intranasale avec Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Visualiser les interactions protéine-ADN dans des cellules bactériennes vivantes en utilisant photoactivés suivi unique molécule

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application de long terme de culture interféron-γ-enzymatique immunospot Essai d&#39;évaluation de mémoires et effectrices réponses des cellules T chez les bovins

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Développement et validation d&#39;une méthode de PCR quantitative pour équidé herpèsvirus-2 Diagnostics dans respiratoires Fluides

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Mise en place d&#39;un programme d&#39;installation à haut débit pour le criblage de petites molécules qui modulent c-di-GMP Signalisation dans<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Dosage de Adhérence Sous contrainte de cisaillement pour l&#39;étude des lymphocytes T-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Mesure de la grippe neuraminidase Inhibition Titres d&#39;anticorps par-enzymatique lectine Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...