Name: development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;
Uploaded: 2018-06-14T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
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DD e YJC riconoscere sostegno da ANR (progetto IFNX, no. CE17001002) e ImmunoQure AG per la fornitura di anticorpi monoclonali. Ringraziamo Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki e Pierre Quartier per la fornitura di campioni clinici. YJC riconosce il Consiglio europeo della ricerca (GA 309449: Fellowship a YJC) e una sovvenzione di stato gestito dall'agenzia di ricerca nazionale (Francia) nell'ambito del programma "Investimenti per il futuro" recanti il riferimento ANR-10-IAHU-01.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, abbiamo descritto lo sviluppo e la convalida di una singola molecola altamente riproducibili, ultrasensibile matrice digitale ELISA per diretta quantificazione della proteina di IFN-α in campioni biologici umani (passaggi riepilogati nella tabella 1). Una delle fasi più critiche nello sviluppo del saggio è la scelta di coppia anticorpo16, con le caratteristiche in termini di cinetica ed epitopo essendo chiave per un'analisi di successo. È importante evitare l'uso di anticorpi monoclonali accoppiati che target l'epitopo stesso o che causano impedimento sterico. Anticorpi policlonali potrebbero essere utilizzati come anticorpi di rilevamento per superare tali limiti. Se in un determinato passaggio la sensibilità desiderata non viene raggiunta, ulteriori possibilità di ottimizzazione dovrebbe essere considerato. Questo può includere l'uso di coppie di anticorpo alternativi, cambiamenti nei parametri quali tipo di proteine (ad es. BSA < caseina), pH (6.0-8.5), forza ionica, capacità tampone (ad esempio le concentrazioni di NaCl e fosfato), perle di vettore e/o presenza di tensioattivi. Una vasta gamma di parametri con essere ottimizzato durante lo sviluppo di un'analisi di matrice singola molecola. Tuttavia, nel complesso, le condizioni che danno rapporti di alto segnale: priorità bassa e minima LODs sono quelli preferiti (Vedi Figura 1, Figura 2e Figura 3).
Per quanto riguarda la specificità, il dosaggio di IFN-α ha mostrato alcuna reattività crociata per qualsiasi altri IFNs non testato (β, γ, λ1, λ2, ω) (Figura 4a) ed era in grado di rilevare tutti i 13 sottotipi di IFN-α (Figura 4b). Tuttavia, l'analisi ha mostrato una minore affinità per il sottotipo di IFN-α2, (Figura 4b e complementare tabella 4). È interessante notare che, sensibilità diverse per le diverse classi di IFN-α2 (a, b, c) inoltre sono stati osservati, che può essere dovuto le procedure di fabbricazione distinti o sequenze di aminoacidi diversi, come i sottotipi di IFN-α2 sono stati ottenuti da commerciale differente fornitori. Con la sola eccezione, tutte le specie di IFN-α ha dato risposte molto simili. La specificità del dosaggio è stata ulteriormente dimostrata dal pre-trattamento dei campioni con l'anti-IFN-α un clone, che ha abrogato il segnale (Figura 6 e complementare tabella 6).
Uno dei principali vantaggi di questa tecnologia è che qualsiasi analita di interesse può potenzialmente essere mirati16. Inoltre, diversi campioni biologici possono essere testati, come siero, plasma, liquido cerebrospinale, lisati cellulari, cultura surnatanti31 e respiro anche32. Di solito, una diluizione di 1:3 di plasma viene eseguita per evitare potenziali intasamento dell'analizzatore matrice singola molecola. Tuttavia, l'analita di interesse potrebbe essere presente a concentrazioni molto basse nel campione biologico rilevante e le più alte concentrazioni del campione potrebbero essere necessario (a seconda della sensibilità del test)33. Anche se c'è potenziale per multiplexing pur mantenendo buona sensibilità34, è un processo più impegnativo e saggi per la misurazione maggiore di 6 proteine entro gli stessi esperimenti hanno ancora essere sviluppato35.
La capacità di rilevare e quantificare citochine e altre proteine biologiche pertinenti a tali concentrazioni basse si apre tutta una nuova serie di applicazioni33,36. È noto che numerose proteine esercitano i loro effetti anche a concentrazioni molto basse, che fino ad ora erano inferiori al limite di rilevazione delle migliori ELISAs37. Mentre altre tecnologie di immunoassay offrono vantaggi rispetto ai convenzionali ELISA19, dimostriamo qui che la singola molecola matrice digitale ELISA è una piattaforma robusta e riproducibile per la rilevazione ultrasensibile di bassa concentrazione di citochine in campioni umani. Come tale, questa tecnologia offre un enorme potenziale per la scoperta del biomarcatore e una migliore gestione del paziente di una vasta gamma di malattie.

Tipo I IFNs sono una famiglia di citochine che svolgono un ruolo centrale nell'orchestrare la risposta immunitaria antivirale. Essi sono stati scoperti da Isaacs e Lindenmann 60 anni fa1,2 e ora è conosciuto che questa famiglia eterogenea di polipeptidi comprende 14 diverse sottoclassi (13 sottotipi di IFN-α e IFN-1 beta). Tipo I IFNs sono essenziali per la liquidazione delle infezioni virali, ma inoltre sono stati implicati nella patologia di una varietà di Stati di malattia umana, compreso i disordini autoimmuni lupus eritematoso sistemico (Les), dermatomyositis giovanile (JDM), e il tipo Ho interferonopathies in quale tipo costitutivo ho indotta da IFN segnalazione provoca patologia3,4,5,6,7.
Studiare proteine IFN di tipo I livelli nei campioni biologici è stato impegnativo dal suo iniziale identificazione come una "sostanza di interferire"1,2. Attualmente, sandwich Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) è il metodo più utilizzato per il rilevamento della proteina di IFN-α. Pur essendo specifico, semplice e rapida, tipo I presenti limitazioni importanti IFN ELISAs, quali sensibilità limitata. Inoltre, la misurazione di tutti i sottotipi di IFN-α richiede l'uso di saggi multipli ogni con la propria sensibilità e capacità di rilevamento. Mentre ci sono ELISAs commerciale che rilevano diversi sottotipi di IFN-α, la loro sensibilità è limitata (1,95 pg/mL, 12,5 pg/mL e 12,5 pg/mL, rispettivamente) che spesso non è sufficiente per rilevare la proteina di IFN-α in campioni biologici. Per ovviare a questa limitazione, proxy biologici diversi saggi sono stati sviluppati per quantificare tipo I IFN misurando l'espressione genica indotta o attività funzionale8,9,10,11, 12 , 13 , 14. ciò nonostante, questi test non forniscono una misura diretta della proteina IFN-α.
In questo studio, tecnologia di singola molecola matrice digitale ELISA è stata utilizzata per sviluppare un test per l'identificazione delle singole molecole di proteina di IFN-α. ELISA digitale utilizza la stessa chimica di base come ELISA convenzionale, tuttavia, la reazione avviene nelle matrici composto da 50.000 individuale 46 femtoliter dimensioni pozzi15,16. Singole molecole proteiche sono catturati dai branelli paramagnetiche rivestite con anticorpo ed etichettati con un anticorpo di rilevazione biotinilato, seguito dall'associazione di un coniugato enzimatico, streptavidina-β-galattosidasi (SBG). Successivamente, le perle sono sospesi con un enzima-substrato fluorogenic, Resorufina-β-D-galattopiranoside (RGP), in matrici di singola molecola. Diminuendo il volume reazione 2 miliardi di volte17, un'alta concentrazione locale di segnale fluorescente è raggiunto e conteggi di singola molecola diventati fattibili, come ogni molecola genera un segnale che ora può essere attendibilmente misurato18. In sostanza singola molecola matrici sono in grado di conteggio singoli immunocomplessi e determinare un numero medio di enzimi al tallone (AEB). Contando i micropozzetti in cui viene rilevato un segnale permette la quantificazione/digitalizzazione delle molecole proteiche, come c'è una correlazione diretta tra la concentrazione nella proteina e il rapporto tra immunocomplexed-perline e un numero totale di perline presenti nel Le camere di dimensioni femtoliter.
Yeung et al. effettuato uno studio di vasta valutazione multi-piattaforma utilizzando nove diverse tecnologie e quattro test immunologici di citochina con l'obiettivo di comparare dosaggio precisione, sensibilità e correlazione dei dati tra le diverse piattaforme19. Uno dei risultati chiavi dello studio era che matrici di singola molecola e singola molecola contando immunoassay ha presentato la più alta sensibilità per il rilevamento delle citochine nel siero umano all'interno della gamma di concentrazione di sub-pg/mL. I dosaggi di singola molecola matrice digitali ELISA citochina sono stati usati per studiare il ruolo di TNF-α e IL-6 in Crohn malattia20, IFN-α in interferonopathy e auto-immuni pazienti 7, e le diverse modificate traduzionalmente forme di C-X-C Motif chemokine 10 (CXCL10) nell'epatite cronica e donatori in buona salute che ricevono sitagliptin21,22. Altre applicazioni includono la misura della rodopsina in pazienti con retinopatia diabetica23; lo studio delle patologie cerebrali attraverso misure di siero/plasma del neurofilamento luce24 e β-amiloide 1-42 peptide25, nel contesto della sclerosi multipla e morbo di Alzheimer, rispettivamente. Saggi di matrice singola molecola possono essere utilizzati anche per il rilevamento del patogeno migliorata come caratterizzazione del serbatoio virale HIV26e anche per la rilevazione di DNA27 e micro RNAs28. Dei principali vantaggi della tecnologia matrice singola molecola è questa elevata versatilità, in quanto un'analisi contro qualsiasi analita di interesse può essere sviluppata se una coppia di anticorpo specifico è disponibile. Inoltre, i corredi di analisi homebrew sono commercialmente disponibili, permettendo lo sviluppo di nuovi test, il protocollo di cui è dettagliato in una forma modificata qui sotto.
Qui, una descrizione dettagliata dei passaggi lo sviluppo e la convalida per un dosaggio di matrice singola molecola è presentata che risulta in una maggiore sensibilità per il rilevamento di proteine IFN-α. Anticorpi per singola molecola matrice analisi dovrebbero essere altamente specifici, evitando la cross-reattività con le proteine correlate (con specificità di specie considerate se pertinenti). Idealmente, dovrebbero essere scelti gli anticorpi con KD inferiore a 10-9 M; alta affinità assicura forte legame, con la produzione di un segnale più alto. La cinetica del legame dell'anticorpo-antigene sono anche importanti e veloce Ksu e lento Koff favorirà assiemi complessi antigene-anticorpo. A partire con un paio di anticorpo che ha una buona prestazione in ELISA classica, con un limite di rilevabilità (LOD) di 1-100 pg/mL, aumenta le possibilità di ottenere un'analisi di matrice singola molecola altamente sensibili. Chang e colleghi effettuati dettagliati studi cinetici delle interazioni biomolecolari che accade ad ogni singolo passo, proponendo una serie di equazioni per predire la sensibilità analitica18. Hanno mostrato tale matrice di singola molecola ELISA digitale sembra essere efficace all'interno di una vasta gamma di affinità dell'anticorpo (KD ~ 1011 - 10− 9 M), come pure quella generazione di segnale dipende più il tasso di anticorpi.
Per utilizzare ad alta affinità anticorpi che abbiamo approfittato degli anticorpi isolati da pazienti con la sindrome di poliendocrinopatia autoimmune tipo 1/autoimmuni distrofia polyendocrinopathy-candidosi-ectodermica (APS1/APECED)29. Per ragioni che non sono ancora chiari, la grande maggioranza degli individui AIRE-carenti sviluppa un set di base di alta-avidità degli anticorpi contro tutti i sottotipi di IFN-α29, e abbiamo selezionato due cloni di anticorpo anti-IFN-α di affinità obbligatorie complementari per i diversi sottotipi di IFN-α, come valutato dai valori di IC50 . La combinazione di questi anticorpi ad alta affinità unici con la tecnologia array di singola molecola ha permesso la quantificazione diretta di IFN-α a concentrazioni di attomolar (fg/mL). Tale rilevazione di proteine IFN-α ultrasensibile contribuirà ad una migliore comprensione della natura, regolamento e impatto biologico della risposta indotta da IFN in impostazioni differenti di malattia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody A (8H1 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody B (12H5 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody EBI-1 clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody BMS216BK clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216BK</td>
			<td>Not an ELISA kit but bulk abs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2c</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS305</td>
			<td>OK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;I (17)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2b</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;1</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11175-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4a (M1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4b (a4)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11180-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;B2 (a8)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11115-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;C (a10)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;D (a1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11125-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;G (a5)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11135-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;F (a21)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11130-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;H2 (a14)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;J1 (a7)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11160-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;K (a6)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11165-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;WA (a16)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11190-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#969;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#946;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; ELISA</td>
			<td>PBL</td>
			<td>41115.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISRE-Reporter</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>CCS-008L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fu-GENE HD Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Mediuem</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40 Substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer NanoDrop 1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtres</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC505096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Conjugation Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Encoded Paramagnetic Beads</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Wash Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11844071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Blocking Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Diluent Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector and Sample Diluent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylation Reaction Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11891195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>MS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa) reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBG, Bead and Detector Barcode Labels</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Reagent Bottles</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa specimen 96-well plates</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Discs</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa 2.0 conductive Tips</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Cuvettes</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa SBG Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa RGP Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 1</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 2</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing Oil</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa HD-1 Analyzer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa)</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems</td>
			<td>Singluex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;

L'obiettivo principale di questo protocollo è di descrivere lo sviluppo e la convalida di un interferone (IFN)-saggio α singola molecola matrice digitale Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA). Questo sistema consente la quantificazione della proteina umana di IFN-α con sensibilità senza precedenti e con nessuna reattività crociata per altre specie di IFN.
Il primo passo fondamentale del protocollo è la scelta della coppia di anticorpo, seguita dalla coniugazione dell'anticorpo di cattura a paramagnetici perline e biotinylation l'anticorpo di rilevazione. A seguito di questo passaggio, diversi parametri quali la configurazione di test, concentrazione di anticorpi del rivelatore e la composizione di buffer possono essere modificati finché sensibilità ottimale è raggiunto. Infine, specificità e riproducibilità del metodo sono valutati per garantire la fiducia nei risultati. Qui, abbiamo sviluppato un test di matrice singola molecola di IFN-α con un limite di rilevazione di 0,69 fg/mL utilizzando ad alta affinità autoanticorpi isolati da pazienti con mutazioni bialleliche nella proteina del regolatore autoimmune (AIRE) causando poliendocrinopatia autoimmune sindrome tipo 1/autoimmuni distrofia polyendocrinopathy-candidosi-ectodermica (APS1/APECED). D'importanza, questi anticorpi abilitato il rilevamento di tutti i 13 sottotipi di IFN-α.
Questa nuova metodologia permette la rilevazione e la quantificazione della proteina di IFN-α in campioni biologici umani alle concentrazioni di attomolar per la prima volta. Tale strumento sarà molto utile nel monitorare i livelli di questa citochina nella salute umana e Stati di malattia, la maggior parte in particolare infezione, autoimmunità e autoinflammation.

In sintesi, un'analisi della matrice pan-IFN-α singola molecola con un limite di rilevazione di 0,69 fg/mL, utilizzando una configurazione di 2-step con cattura perline rivestite con 0,3 mg/mL di anti-IFN-α un anticorpo e anti-IFN-α B rilevazione dell'anticorpo biotinilato ad un rapporto di biotina: anticorpo di 30 è stato sviluppato. Le concentrazioni utilizzate per l'anticorpo di rilevazione biotinilato e SBG erano 0,3 µ g/mL e 150 pM, rispettivamente. Questo test altamente specifico è in grado di rilevare tutti i sottotipi di IFN-α 13 e non reazione crociata con altri tipi di IFN. Così, anche se non è possibile identificare e quantificare ogni singola specie di IFN-α, tutti possono essere rilevati e misurati insieme dando un valore di concentrazione totale per IFN-α, che comprende 13 diverse sottoclassi.
Per esplorare il potenziale valore diagnostico di questa analisi di recente sviluppato, IFN-α proteina in plasma e siero da individui sani erano misurati e confrontati con campioni provenienti da pazienti affetti da SLE e JDM. Come illustrato nella Figura 7, alti livelli di IFN-α proteina sono stati rilevati nelle due coorti di malattia rispetto ai controlli sani. La linea tratteggiata indica il livello di dettaglio di una convenzionale ELISA disponibile in commercio, che illustra come questo approccio potrebbe non rilevare la proteina di IFN-α in questi gruppi di pazienti nonostante le associazioni note di questa citochina con questi fenotipi. Inoltre, IFN-α può essere quantificata sopra 5 registri di grandezza, che illustra l'ampia gamma dinamica del dosaggio, con livelli rilevabili tra 1-10. fg/mL, confermando la natura altamente sensibile del dosaggio.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57421/57421fig7.jpg"> Figura 7: quantificazione della proteina di IFN-α in plasma e siero dalle coorti di pazienti. Questa figura è stata modificata da Rodero et al. 2017. plasma da controlli sani (n = 20) e pazienti affetti da SLE (n = 72) e JDM (n = 43) sono stati testati con il test di matrice singola molecola pan-IFNα. Analisi è stata eseguita utilizzando il test ANOVA unidirezionale (Kruskal-Wallis) e di Dunn più confronto test tra gruppi. Mediana è raffigurato. Linea tratteggiata indica LOD di una riferimento umano anti-IFN-α ELISA (1,95 pg/mL = 1950 fg/mL). <a href="/files/ftp_upload/57421/57421fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Passo</td>
			<td>Considerazioni</td>
			<td>Riferimento</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1. scelta di coppia anticorpo</td>
			<td>Epitopi diversi target</td>
			<td rowspan="3">Tabella 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alta affinità</td>
		</tr>
<tr>
<td>Veloce Ksu / lento Kfuori
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2. orientamento di coppia anticorpo</td>
			<td rowspan="3">Scegliere le condizioni con il più basso limite di rilevabilità</td>
			<td rowspan="3">Figura 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3. acquisire la concentrazione di anticorpi</td>
		</tr>
<tr>
<td>4. rapporto di anticorpo biotina: rivelatore</td>
		</tr>
<tr>
<td>5. 2 vs 3-passo configurazione</td>
			<td>Scegli la condizione con il più alto rapporto di segnale: sfondo</td>
			<td>Figura 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6. concentrazione di anticorpi rivelatore</td>
			<td rowspan="2">Scegliere le condizioni con il più basso limite di rilevabilità</td>
			<td rowspan="2">Figura 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>7. concentrazione di SBG</td>
		</tr>
<tr>
<td>8. specificità</td>
			<td>Valutare la reattività crociata</td>
			<td rowspan="2">Figura 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9. sensibilità</td>
			<td>Valutare il riconoscimento dei sottotipi (se applicabile)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10. riproducibilità</td>
			<td>Valutare la variabilità di analisi</td>
			<td>Figura 5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: riepilogo dei passaggi per lo sviluppo e l'ottimizzazione di un dosaggio di matrice singola molecola. Questa tabella riassume i diversi passaggi necessari per lo sviluppo e l'ottimizzazione di un dosaggio di matrice singola molecola, dalla scelta iniziale di coppia anticorpo fino alla valutazione della riproducibilità.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antigene</td>
			<td>8H 1 (A)</td>
			<td>12H 5 (B)</td>
			<td>Sifalimumab</td>
			<td>Rontalizumab</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ1</td>
			<td>28.3</td>
			<td>51,3</td>
			<td>460</td>
			<td>22,63</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ2</td>
			<td>2563</td>
			<td>10.7</td>
			<td>9,02</td>
			<td>2.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ4</td>
			<td>5.11</td>
			<td>2,99</td>
			<td>35.35</td>
			<td>325.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ5</td>
			<td>2.01</td>
			<td>19,6</td>
			<td>93.29</td>
			<td>2.49</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ6</td>
			<td>64,7</td>
			<td>3,03</td>
			<td>4,97</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ7</td>
			<td>0.9</td>
			<td>0,63</td>
			<td>233.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ8</td>
			<td>302</td>
			<td>0,83</td>
			<td>691</td>
			<td>10.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ10</td>
			<td>2.54</td>
			<td>0,71</td>
			<td>43,2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ14</td>
			<td>3224</td>
			<td>2.1</td>
			<td>14,52</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ16</td>
			<td>1.83</td>
			<td>32.99</td>
			<td>59.18</td>
			<td>28,65</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ17</td>
			<td>2.21</td>
			<td>0,77</td>
			<td>890,9</td>
			<td>23,86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ21</td>
			<td>2,78</td>
			<td>12,87</td>
			<td>1769</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: selezione dell'anticorpo Pan-alfa. IC50 (ng/mL) determinato utilizzando l'elemento di risposta dell'interferone-stimolata (ISRE)-analisi di Luciferase neutralizzazione. Tabella mostra i valori di IC50 di mAbs utilizzato nell'analisi di singola molecola matrice per tutti i sottotipi di IFN-α. 10.000 cellule HEK 293 MSR sono state seminate in piastre da 96 pozzetti metà-zona bianche e reverse-transfected con 50 ng premiscelato ISRE-Firefly luciferase reporter e costrutti di luciferasi Renilla utilizzando reagenti di transfezione secondo le istruzioni del produttore. Il costrutto che esprimono luciferasi servito come un controllo di normalizzazione interna. Le cellule sono state incubate durante la notte nel ridotto del siero supplementato con aminoacidi non essenziali di 0,1 mM, piruvato di sodio di 1 mM, 0,5% di siero bovino fetale a 37 ° C, 5% CO2 in atmosfera umidificata. Dopo una notte di incubazione, le cellule sono state stimolate per 24 h con medie contenenti miscele di IFN-α ricombinante umano con o senza anticorpi monoclonali anti-IFN-α o controllo IgG che erano stati preincubati per 1h a 37 ° C. Dopo 24 h di stimolazione, dual luciferasi reporter analisi sono state eseguite secondo le istruzioni del produttore. «-» Non determinato. Sifalimumab è un pienamente umana, immunoglobulina G1 κ anticorpo monoclonale che si lega a e neutralizza la maggior parte dei sottotipi di IFN-α; Rontalizumab è un anticorpo monoclonale umanizzato contro IFN-α. Adattato da Meyer et al 2016 e Rodero et al. 2017.
Complementare tabella 1: selezione dell'orientamento dell'anticorpo, catturare concentrazione di anticorpi perline e rapporto di biotinilazione. Le due possibili configurazioni differenti sono state provate, usando la A anti-IFN-α come anticorpo di cattura e anti-IFN-α B come rilevazione dell'anticorpo (A) e vice versa (B). IFNα - 2C è stato usato come antigene. Le concentrazioni nell'anticorpo di cattura differenti così come i rapporti di biotina: anticorpo (B:A) inoltre sono stati provati per entrambe le configurazioni. Saturazione (sab). Orange: Valori AEB che sono stati utilizzati per il calcolo di LOD. Queste concentrazioni sono state considerate vuote come i valori AEB è rimasti stabile. LOD è stato calcolato come dire vuoto + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_1.xlsx">per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare tabella 2: Test di configurazione 3-passaggio 2 vs. Le configurazioni di passaggio 2 e 3 - sono state valutate usando IFNα - 2C come antigene. AEB valori anche come segnale/rumore (S/B) di razioni sono indicati per entrambe le condizioni. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_2.xlsx">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare tabella 3: ottimizzazione di concentrazione di rivelatore e SBG. Tre differenti concentrazioni di anticorpo biotinilato di rivelatore (0,1 e 0,3 0,6 µ g/mL) insieme a tre diverse concentrazioni di SBG (50, 150 e 250 pM) sono stati valutati. AEB valori sono indicati per le nove condizioni testate. Orange: Valori AEB che sono stati utilizzati per il calcolo di LOD. Queste concentrazioni sono state considerate vuote come i valori AEB è rimasti stabile. LOD è stato calcolato come dire vuoto + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_3.xlsx">per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare tabella 4: specificità e sensibilità del dosaggio di matrice di singola molecola IFNα ottimizzato. Enzima medio per valori di perline sono mostrati quando IFN-β, IFN-λ1, λ2 IFN, IFN-ω e IFN-γ proteine ricombinanti sono stati testati (A), insieme con i 16 sottotipi di IFN-α (B). «-» Non determinato. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_4.xlsx">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare tabella 5: riproducibilità ottimizzata IFNα singola molecola matrice. I valori medi di AEB per tutte le tre esecuzioni indipendenti sono mostrati fino alla concentrazione di 10.000 fg/mL. «-» Non determinato. Saturazione (sab). <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_5.xlsx">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare tabella 6: analisi della proteina di concorrenza. Enzima medio per perline valori sono indicati per tutte le condizioni testate. Misure sono state fatte in duplice copia. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_6.xlsx">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Qui presentiamo un protocollo per descrivere lo sviluppo e la convalida di una singola molecola matrice digitale analisi di ELISA, che consente la rilevazione ultra-sensibile di tutti i sottotipi di IFN-α in campioni umani.

Sviluppo e validazione di una singola molecola ultrasensibile di matrice digitale analisi enzima-collegata dell'immunosorbente per umana dell'interferone-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Ricerca

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Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

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