Name: development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;
Uploaded: 2018-06-14T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
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DD와 안산 지원은 ANR에서 인정 (프로젝트 IFNX, 아니. CE17001002)와 단일 클론 항 체를 제공 하기 위한 ImmunoQure AG. 우리 감사 브리 짓 베이더 Meunier, 나탈리 아 Bellon, 크리스틴 Bodemer, 알렉스 Belot, 이자벨 Melki, 그리고 피에르 Quartier 임상 샘플 제공. 유럽 연구 위원회를 인정 하는 안산 (GA 309449: 안산 교제), 베어링 참고 ANR-10-IAHU-01 "미래 위한 투자" 프로그램 국가 연구 기관 (프랑스)에 의해 관리 되는 국가 보조금.

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저자는 공개 없다.

여기, 우리 개발 및 인간의 샘플 ( 표 1에 요약 된 단계)에서 IFN-α 단백질의 직접 정량화에 대 한 높은 재현성, 磁 단일 분자 배열 디지털 ELISA의 유효성 검사를 설명 합니다. 분석 결과의 개발에서 가장 중요 한 단계 중 하나는 항 체 쌍16, 속도 론 및 성공적인 분석 결과 핵심 되는 epitope 바인딩 특성의 선택입니다. 대상으로 동일한 epitope 또는 그 입체 장애를 일으킬 짝된 단일 클론 항 체의 사용을 피하기 위해 중요 하다. Polyclonal 항 체는 이러한 한계를 극복 하기 위해 탐지 항 체로 사용 될 수 있습니다. 어떤 주어진된 단계에서 원하는 감도 달성 되지 않은, 경우 추가 최적화 가능성 고려 되어야 한다. 이 대체 항 체 쌍, 매개 단백질 종류에에서 변화를 사용 하 여 포함 될 수 있습니다 (예: BSA < 카 제인), pH (6.0-8.5), 이온 강도, 버퍼링 용량 (예: NaCl 및 인산 염 농도), 캐리어 구슬, 또는 계면의 존재. 다양 한 매개 변수 절약 최적화 된 단일 분자 배열 분석 결과 개발할 때. 그러나, 전반적으로, 높은 신호: 배경 비율 및 최소한의 Lod를 주는 조건이 선호 하는 것 ( 그림 1, 그림 2및 그림 3참조).
특이성에 관한 IFN-α 분석 결과 다른 IFNs에 대 한 교차 반응 없음 테스트 (β, γ, λ1, λ2, ω) 보였다 (그림 4a)와 모든 13 IFN-α 하위 (그림 4b) 탐지 가능 했다. 그러나, 분석 결과 IFN-α2 하위 형식, (그림 4b 및 보충 표 4)에 대 한 낮은 선호도 보였다. 흥미롭게도, IFN-α2 (a, b의 c)의 다른 클래스에 대 한 서로 다른 감도 또한 관찰 되었다, 고유 제조 절차 또는 다른 아미노산 시퀀스를 수 있는 IFN-α2 하위 했다 다른 상업적으로 공급 업체입니다. 이 유일한 예외와 함께 모든 IFN-α 종 매우 비슷한 응답 했다. 분석 결과의 특이성은 안티-IFN-α (그림 6 및 보충 표 6) 신호를 폐지 한 복제와 샘플의 전처리에 의해 입증 되었습니다.
이 기술의 주요 장점 중 하나입니다 관심의 모든 분석 대상된16수 잠재적으로. 또한, 다른 생물 표본 테스트할 수 있습니다, 혈 청, 플라스마, 중추 신 경계, 세포 lysates, 문화 supernatants31 심지어 숨을32등. 일반적으로, 플라즈마의 1:3 희석 잠재적인 단일 분자 배열 분석기의 막힘을 피하기 위해 수행 됩니다. 그러나, 관심의 분석 관련 생물학 견본에서 매우 낮은 농도에서 존재 될 수 있고 샘플의 높은 농도 (분석 감도)에 따라 필요한33수 있습니다. 좋은 감도34유지 하면서 멀티플렉싱 가능성이 있지만, 그것은 더 많은 도전 과정 6 단백질 같은 실험에서 아직 수35개발 보다 큰 측정 분석 실험.
감지 하 여 cytokines와 같은 낮은 농도에 다른 생물학 관련 단백질 계량 능력 응용 프로그램33,36의 완전히 새로운 범위를 연다. 그것은 잘 알려진 수많은 단백질 인 지금까지 최고의 ELISAs37의 검출 한계 이하로 매우 낮은 농도 에서도 그들의 효과 발휘. 다른 immunoassay 기술을 기존의 ELISA19이점을 제공, 제시 여기 단일 분자 배열 디지털 ELISA는 낮은 농도에서 cytokines의 磁 탐지에 대 한 재현 가능 하 고 강력한 플랫폼 인간의 샘플입니다. 따라서,이 기술은 바이오 마커 발견과 다양 한 질병의 향상 된 환자 관리에 대 한 엄청난 잠재력을 제공합니다.

유형 I IFNs는 항 바이러스 면역 응답을 꾸미고 있는 중앙 역할 cytokines의 가족. 그들은 처음 발견 되었다이 삭과 Lindenmann 60 여 년 전1,2 , 그것은 지금 polypeptides의이 다른 유형의 가족 14 다른 서브 클래스 (13 IFN-α 하위 및 1 IFN-β) 구성 알려져. 유형과 유형 I IFNs는 바이러스 성 감염의 허가에 필수적인 하지만 또한 다양 한 인간의 질병 상태, 자가 면역 질환 반성 루 푸 스 (SLE), 청소년 dermatomyositis (JDM)를 포함 하 여의 병 리에 연루 되어 내가 interferonopathies 구성 유형에서 IFN 유도 신호 나 병 리3,,45,,67에 결과.
공부 유형 I IFN 단백질 수준의 생물 학적 샘플에 도전 하고있다 그것의 초기 식별 이후는 "방해 물질"1,2. 현재, 샌드위치 Enzyme-Linked ImmunoSorbent 분석 결과 (ELISA) IFN-α 단백질의 검출에 대 한 가장 널리 사용 되는 방법 이다. 불구 하 고 특정, 간단 하 고 빠른, 종류와 같은 중요 한 한계를 제시 나 IFN ELISAs 감도 제한. 또한, 모든 IFN-α의 측정 자신의 감지 능력 및 감도 여러 분석 실험의 사용을 해야합니다. 상업적인 ELISAs IFN-α의 다른 하위를 검색 하는 동안, 그들의 감도 제한 됩니다 (1.95 pg/mL, 12.5 pg/mL, 및 12.5 pg/mL, 각각)는 종종 생물학 견본에서 IFN-α 단백질을 검출 하기 충분 하지 않습니다. 이 제한을 극복 하기 위해 분석 척도 개발 되었습니다 몇 가지 생물 학적 프록시 유형 I IFN 유도 유전자 발현 또는 기능 활동8,,910,11, 를 측정 하 여 12 , 13 , 14. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 분석 IFN-α 단백질의 직접 측정을 제공 하지 않습니다.
본이 연구에서는 단일 분자 배열 디지털 ELISA 기술은 단일 IFN-α 단백질 분자의 검출에 대 한 분석 결과 개발에 사용 되었다. 그러나 디지털 ELISA 기존의 ELISA로 동일한 기본적인 화학, 반응 50000 개별 46 femtoliter 크기의 웰 스15,16으로 구성 된 배열에서 일어난다. 단일 단백질 분자는 항 체-코팅 된 상자성 구슬에 의해 점령 하 고는 biotinylated 탐지 항 체, 효소 공액, streptavidin-β-galactosidase (SBG)의 바인딩 다음으로 표시. 그 후, 구슬 fluorogenic 효소 기질, resorufin-β-D-galactopyranoside (까지), 단일 분자 배열에 함께 일시 중단 됩니다. 볼륨을 줄여 반응 2 십억 번17, 형광 신호의 높은 현지 농도 달성 하 고 단일 분자 수로 각 분자는 이제 안정적으로 될 수 있는 신호를 생성 가능 하 고, 될 측정18. 본질적으로 단일 분자 배열은 단일 immunocomplexes를 계산 하 고 구슬 (AEB) 당 효소의 평균 수를 결정 할 수 있다. 단백질 농도 immunocomplexed 구슬과 구슬에의 총 수 사이의 비율 사이 직접적인 상관으로 단백질 분자의 정량화/디지털화 허용 신호를 감지 하는 microwells를 계산 femtoliter 크기의 약 실입니다.
양 외. 9 다른 기술 및 4 개의 cytokine immunoassays19다른 플랫폼 걸쳐 분석 결과 정밀도, 감도, 그리고 데이터 상관 관계를 비교 하는 것을 목적으로 사용 하는 광범위 한 크로스-플랫폼 평가 연구를 수행 합니다. 연구의 주요 조사 결과 중 하나는 단일 분자 배열 및 단일 분자 immunoassay 계산 하위-pg/mL 농도 범위 내 인간의 혈 청에서 cytokines의 검출에 대 한 높은 감도 제시 했다. 단일 분자 배열 디지털 ELISA cytokine 분석 실험 Crohn의 질병20, IFN-α interferonopathy 및 자동-면역 환자 7, 일리노이-6와 TNF-α의 역할을 연구 하기 사용 되 고 다른 post-translationally C-X-C의 형태 수정 만성 간염 및 건강 한 기증자 sitagliptin21,22수신 모티브 chemokine 10 (CXCL10) 당뇨병 성 망막 증23; 환자에 rhodopsin의 측정을 포함 하는 다른 응용 프로그램 neurofilament의 혈 청/플라즈마 측정을 통해 뇌 병 리의 연구에 빛 다 발성 경화 증 및 알 츠 하이 머 병의 맥락에서24 및 아 밀 로이드 β 1-42 펩 티 드25, 각각. HIV 바이러스 성 저수지26의 특성 등 향상 된 병원 체 감지 하 고 또한 DNA27 마이크로 RNAs28의 검출에 대 한 단일 분자 배열 분석 실험도 사용할 수 있습니다. 특정 항 체 쌍을 사용할 수 경우 관심의 어떤 분석에 대 한 분석 결과 개발 될 수 있는 단일 분자 배열 기술의 주요 이점은이 다용도입니다. 또한, 사제 시험 장비는 상업적으로 사용할 수 있는 프로토콜 아래의 수정 된 형태로 상세한 새로운 분석의 개발을 허용.
여기, 단 하나 분자 배열 분석 결과 대 한 개발 및 유효성 검사 단계에 대 한 자세한 설명은 IFN-α 단백질 검출에 대 한 향상 된 감도에 그 결과 제공 됩니다. 단일 분자 배열 분석 실험에 대 한 항 체는 매우 구체적인, (와 함께 종 특이성 경우 관련) 관련 단백질 교차 반응성을 피하 해야 합니다. 이상적으로, KD 10-9 M 보다 작은 항 체는 선택 되어야 한다; 높은 선호도 높은 신호 생산 강한 바인딩을 확인합니다. 항 체-항 원 바인딩의 활동 또한 중요 하 고, 빠른 K에에 있으며 느린 K에서 항 원-항 체 복잡 한 어셈블리를 부탁 합니다. 항 체 쌍을 1-100 pg/ml, 탐지 (LOD)의 고전 ELISA에 좋은 성능을 시작 매우 민감한 단일 분자 배열 분석 결과 얻기의 가능성이 높아집니다. 장 및 동료 분석 감도18를 예측 하는 방정식의 세트를 제안 하 고 모든 단일 단계에서 발생 하는 바이오 상호 작용의 상세한 운동 연구 수행. 그들은 그 단일 분자 배열 디지털 ELISA 항 체 친 화력의 광범위 한 범위 내에서 효과적인 것 처럼 보였다 (KD ~ 10−11 -10−9 M), 뿐만 아니라 그 신호 발생은 더 많은 같은 항 체의에 속도에 의존.
높은 선호도 활용 하려면 우리 면역 polyendocrinopathy 증후군을 가진 환자에서 항 체 분리의 이용을 했다 항 체 1/면역 polyendocrinopathy-칸디 다 증-ectodermal 영양 (APS1/APECED)29를 입력 합니다. 이유로 아직 이해 되지 않는다, 아이 불충분 한 개인의 대다수는 모든 IFN-α 하위29에 대 한 높은 갈망 항 체의 코어 세트를 개발 하 고 우리는 상호 보완적인 바인딩 선호도의 두 안티-IFN-α 항 체 클론을 선택 다른 IFN-α 하위 유형에 대 한, IC50 값에 의해 추산 되. 단일 분자 배열 기술로 이러한 독특한 높은 친 화력 항 체의 조합 attomolar (fg/mL) 농도에서 IFN-α의 직접 정량화를 사용할 수 있습니다. 이러한 磁 IFN-α 단백질 검출 자연, 규칙 및 다른 질병에서 IFN 유도 응답의 생물 학적 영향의 더 나은 이해에 기여할 것입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody A (8H1 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody B (12H5 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody EBI-1 clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody BMS216BK clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216BK</td>
			<td>Not an ELISA kit but bulk abs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2c</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS305</td>
			<td>OK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;I (17)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2b</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;1</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11175-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4a (M1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4b (a4)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11180-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;B2 (a8)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11115-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;C (a10)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;D (a1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11125-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;G (a5)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11135-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;F (a21)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11130-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;H2 (a14)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;J1 (a7)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11160-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;K (a6)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11165-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;WA (a16)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11190-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#969;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#946;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; ELISA</td>
			<td>PBL</td>
			<td>41115.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISRE-Reporter</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>CCS-008L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fu-GENE HD Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Mediuem</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40 Substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer NanoDrop 1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtres</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC505096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Conjugation Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Encoded Paramagnetic Beads</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Wash Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11844071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Blocking Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Diluent Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector and Sample Diluent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylation Reaction Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11891195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>MS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa) reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBG, Bead and Detector Barcode Labels</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Reagent Bottles</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa specimen 96-well plates</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Discs</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa 2.0 conductive Tips</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Cuvettes</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa SBG Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa RGP Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 1</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 2</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing Oil</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa HD-1 Analyzer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa)</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems</td>
			<td>Singluex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;

이 프로토콜의 주요 목표는 개발 및 유효성 검사는 인터페론 (IFN)의 설명-α 단일 분자 배열 디지털 Enzyme-Linked ImmunoSorbent 분석 결과 (ELISA) 분석 결과. 이 시스템 수 있습니다 인간의 IFN-α 단백질의 정량화를 전례 없이 높은 감도, 그리고 아무 분 IFN의 다른 종족에 대 한.
프로토콜의 첫 번째 주요 단계 다음에 캡처 항 체의 활용 상자성 구슬과 biotinylation 탐지 항 체의 항 체 쌍의 선택입니다. 이 단계에 따라 최적의 감도 얻을 때까지 분석 결과 구성, 검출기 항 체 농도, 버퍼 구성 등의 다른 매개 변수를 수정할 수 있습니다. 마지막으로, 특이성, 재현성 메서드의 결과에 신뢰를 보장 하기 위해 평가 됩니다. 여기, 우리는 0.69 fg/mL 높은 선호도 자가 면역 polyendocrinopathy를 일으키는 면역 레 귤 레이 터 (아이) 단백질 biallelic 돌연변이 가진 환자에서 격리를 사용 하 여의 검출도 IFN-α 단일 분자 배열 분석 결과 개발 증후군 종류 1/면역 polyendocrinopathy-칸디 다 증-ectodermal 영양 (APS1/APECED). 중요 한 것은, 이러한 항 체는 모든 13 IFN-α의 감지를 사용할 수 있습니다.
이 새로운 방법론 수 있습니다 검출 및 정량화 IFN-α 단백질의 attomolar 농도에서 인간의 생물 학적 샘플에서 처음으로. 이러한 도구는 매우 인간의 건강 및 질병 상태,이 사이토카인의 수준을 모니터링 하는 데 유용 있을 것입니다 대부분 특히 감염, 자가 면역, 그리고 autoinflammation.

요약 하자면, 0.69 fg/mL, 2 단계 구성을 사용 하 여 캡처 구슬의 검출 한계는 팬-IFN-α 단일 분자 배열 분석 결과와 코팅 0.3 mg/mL의 안티-IFN-α는 항 체 및 안티-IFN-α B 탐지 항 체 biotinylated의 비타민 b 복합체: 항 체 비에 30 개발 되었다. Biotinylated 탐지 항 체 및 SBG 사용 농도 했다 0.3 µ g/mL 및 150 오후, 각각. 이 매우 구체적인 분석 결과 모든 13 IFN-α 하위 감지 수 이며 IFNs의 다른 유형으로 교차 반응 하지 않습니다. 따라서, 그것은 식별 하 고 IFN-α의 각 개별 종 계량 가능, 모두 검출 될 수 있다 고 함께 13 다른 서브 클래스를 구성 하는 IFN-α에 대 한 총 농도 값을 주는 측정.
이 새로 개발된 된 분석 결과의 잠재적인 진단 가치 탐험, 플라즈마와 건강 한 개인에서 혈 청 IFN-α 단백질 측정 하 고 SLE와 JDM 고통 받아 환자에서 샘플과 비교 했다. 그림 7에서 볼 수 있듯이 건강 한 통제에 비교 하 여 두 질환 동료에 IFN-α 단백질의 높은 수준은 발견 했다. 점선은 어떻게이 이렇게 것 이다 감지 하지 IFN-α 단백질이이 고기가이 cytokine의 알려진된 연결에도 불구 하 고 이러한 환자 그룹을 보여주는 기존의 상용 ELISA의 LOD를 나타냅니다. 또한, IFN-α는 분석 결과, 분석 결과의 매우 민감한 성격을 확인 1-10 fg/mL 사이 감지 레벨의 넓은 동적 범위를 보여주는 5 로그의 크기를 통해 측정할 수 수 있습니다.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57421/57421fig7.jpg"> 그림 7: 플라즈마와 동료 환자에서 혈 청 IFN-α 단백질의 정량화. 이 그림은 Rodero 외에서 수정 되었습니다. 2017. 건강 한 컨트롤에서 플라즈마 (n = 20)와 SLE 고통 받는 환자 (n = 72) 및 JDM (n = 43) 팬 IFNα 단일 분자 배열 분석 결과 함께 테스트 했다. 분석 비교 사용 하 여 단방향 ANOVA 테스트 (Kruskal-월리스)와 던의 여러 그룹 간의 테스트를 수행 했습니다. 중간값은 그려져 있습니다. 점선 참조 인간의 안티-IFN-α ELISA의 LOD를 나타냅니다 (1.95 pg/mL = 1950 fg/mL). <a href="/files/ftp_upload/57421/57421fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>단계</td>
			<td>고려 사항</td>
			<td>참조</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1. 항 체 쌍 선택</td>
			<td>대상 다른 epitopes</td>
			<td rowspan="3">표 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>높은 선호도</td>
		</tr>
<tr>
<td>K에에 빠른 / 느린 K에서
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2. 항 체 쌍 방향</td>
			<td rowspan="3">검출의 최저 제한 조건을 선택합니다</td>
			<td rowspan="3">그림 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3. 항 체 농도 캡처</td>
		</tr>
<tr>
<td>4. biotin: 검출기 항 체 비율</td>
		</tr>
<tr>
<td>5입니다. 2 대 3 단계 구성</td>
			<td>높은 신호: 배경 비율 조건 선택</td>
			<td>그림 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6. 검출기 항 체 농도</td>
			<td rowspan="2">검출의 최저 제한 조건을 선택합니다</td>
			<td rowspan="2">그림 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>7. SBG 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>8입니다. 특이성</td>
			<td>분을 평가</td>
			<td rowspan="2">그림 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9입니다. 감도</td>
			<td>(있는 경우)의 인식 평가</td>
		</tr>
<tr>
<td>10입니다. 재현성</td>
			<td>분석 결과 변화를 평가</td>
			<td>그림 5</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 개발 및 단일 분자 배열 분석 결과의 최적화를 위한 단계의 요약. 이 표에서 개발 및 재현성 평가까지 항 체 쌍의 초기 선택에서 단일 분자 배열 분석 결과의 최적화에 필요한 여러 단계를 요약 합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>항 원</td>
			<td>8 H 1 (A)</td>
			<td>12 H 5 (B)</td>
			<td>Sifalimumab</td>
			<td>Rontalizumab</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ1</td>
			<td>28.3</td>
			<td>51.3</td>
			<td>460</td>
			<td>22.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ2</td>
			<td>2563</td>
			<td>10.7</td>
			<td>9.02</td>
			<td>2.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ4</td>
			<td>5.11</td>
			<td>2.99</td>
			<td>35.35</td>
			<td>325.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ5</td>
			<td>2.01</td>
			<td>19.6</td>
			<td>93.29</td>
			<td>2.49</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ6</td>
			<td>64.7</td>
			<td>3.03</td>
			<td>4.97</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ7</td>
			<td>0.9</td>
			<td>0.63</td>
			<td>233.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ8</td>
			<td>302</td>
			<td>0.83</td>
			<td>691</td>
			<td>10.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ10</td>
			<td>2.54</td>
			<td>0.71</td>
			<td>43.2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ14</td>
			<td>3224</td>
			<td>2.1</td>
			<td>14.52</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ16</td>
			<td>1.83</td>
			<td>32.99</td>
			<td>59.18</td>
			<td>28.65</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ17</td>
			<td>2.21</td>
			<td>0.77</td>
			<td>890.9</td>
			<td>23.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ21</td>
			<td>2.78</td>
			<td>12.87</td>
			<td>1769</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 팬-알파 항 체 선택. IC50 (ng/mL) 인터페론 자극 응답 요소 (ISRE)를 사용 하 여 결정-Luciferase 중화 분석 결과. 테이블의 모든 IFN-α 하위에 대 한 단일 분자 배열 분석 결과에 사용 되는 mAbs IC50 값을 보여 줍니다. 10000 HEK 293 MSR 셀 흰색 반 지역 96 잘 접시에 시드 되었고 50 ng 혼합 ISRE-반딧불 luciferase 기자와 Renilla luciferase 구문을 사용 하 여 transfection 시 약 제조업체의 지침에 따라 리버스 페. Luciferase 표현 구문 내부 정규화 컨트롤로 제공 됩니다. 셀은 불필요 한 아미노산은 0.1 m m, 1mm 나트륨 pyruvate, 37 ° C에서 0.5% 태아 둔감 한 혈 청, 5% CO2 습도 분위기에서 보충 감소 혈 청 매체에 하룻밤 incubated 했다. 하룻밤 배양 한 후 세포 재조합 인간 IFN-α 또는 안티-IFN-α mAbs 또는 제어 1 h 37 ° c.에 대 한 preincubated 했다 IgG 없이 혼합물을 포함 하는 매체와 24 h에 대 한 자극 했다 자극의 24 h 후 듀얼 luciferase 기자 분석 실험은 제조업체의 지침에 따라 수행 했다. «-» 결정 되지. Sifalimumab는 완전히 인간 면역 글로불린 g 1 κ 단일 클론 항 체에 바인딩하고; IFN-α의 대부분을 중화 하는 Rontalizumab은 IFN-α에 대 한 인간 답게 단일 클론 항 체 이다. 메이어 연구진이 2016 및 Rodero 그 외 여러분 에서 적응 2017입니다.
보충 표 1: 다양 한 항 체 방향, 구슬 및 biotinylation 비율에 항 체 농도 캡처. 서로 다른 두 가능한 구성을 테스트, 탐지 항 체 (A), 그리고로 캡처 항 체 및 안티-IFN-α B 안티-IFN-α A를 사용 하 여 반대 (B). IFNα-2 c 항으로 사용 되었다. 다른 캡처 항 체 농도 뿐만 아니라 비타민 b 복합체: 항 체 (B:A) 비율 구성 모두에 대 한 테스트도 했다. 채도 (토). LOD 계산; 사용 된 주황색: 브라질 우주국 값 이 농도 꾸준히 남아 AEB 값으로 빈 간주 됐다. LOD 의미 빈 + 3SD.로 계산 되었다 <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_1.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 2: 2 vs 3 단계 구성의 테스트. 2, 3-단계 구성으로 항 원 c IFNα-2를 사용 하 여 평가 됐다. AEB 값 뿐만 아니라 신호/배경 식량 (S/B) 표시 됩니다 두 조건에 대 한. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_2.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 3: 검출기와 SBG 농도 최적화. SBG의 3 개의 다른 농도 함께 biotinylated 검출기 항 체 (0.1, 0.3, 0.6 µ g/mL)의 3 개의 다른 농도 (50, 150, 및 250 오후) 평가 했다. AEB 값 9 테스트 조건에 대 한 표시 됩니다. LOD 계산; 사용 된 주황색: 브라질 우주국 값 이 농도 꾸준히 남아 AEB 값으로 빈 간주 됐다. LOD 의미 빈 + 3SD.로 계산 되었다 <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_3.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 4: 최적화 된 IFNα 단일 분자 배열 분석 결과의 감도 및 특이성. 구슬 값 당 평균 효소 IFN β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω, 그리고 IFN-γ 재조합 단백질은 시험 때 (A)의 IFN-α (B) 16 하위 함께 표시 됩니다. «-» 결정 되지. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_4.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 5: 최적화 된 IFNα 단일 분자 배열 분석 결과의 재현성. 모든 3 개의 독립적인 실행에 대 한 평균값 AEB 10.000 fg/mL의 농도를 표시 됩니다. «-» 결정 되지. 채도 (토). <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_5.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 6: 단백질 경쟁 분석 결과. 구슬 값 당 평균 효소 테스트 하는 모든 조건에 대 한 표시 됩니다. 측정은 중복에서 수행 했다. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_6.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

여기 우리는 개발 및 유효성 검사는 단일 분자 배열 디지털 ELISA 분석 결과의 인간의 샘플에서 모든 IFN-α의 매우 민감한 탐지를 가능 하 게 설명 하는 프로토콜을 제시.

개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

효소 링크된 Immunospot 분석 (ELISPOT) : 미생물 항원 반대 예뻐 - 1 세포 면역 반응의 부량

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

연구

면역학 및 감염병학

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Use of Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

인간 Papillomavirus의 소설 T-세포 Epitopes를 특성화하기 위해 인터페론-γ 효소 연결된 Immunospot 분석의 이용

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

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Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

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Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

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Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

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Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

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변조 C 디 GMP가에서 시그널링 그건 작은 분자를 스크리닝하기위한 높은 처리량 설정 구축<em&gt; 녹농균</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

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Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...