Name: development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;
Uploaded: 2018-06-14T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃŽÂ± at JoVE.com

DD e YJC reconhece apoio da ANR (projeto IFNX, não. CE17001002) e ImmunoQure AG para fornecimento de anticorpos monoclonais. Agradecemos a Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki e Pierre Quartier para fornecer amostras clínicas. YJC reconhece o Conselho Europeu de investigação (GA 309449: Fellowship para YJC) e um subsídio de estado gerenciado pela Agência Nacional de pesquisa (França), no âmbito do programa "Os investimentos para o futuro", tendo a referência ANR-10-IAHU-01.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, descrevemos o desenvolvimento e validação de uma molécula altamente reprodutível, ultra-sensível matriz digital ELISA para quantificação directa da proteína IFN-α em amostras humanas (passos resumidos na tabela 1). Um dos passos mais importantes no desenvolvimento do ensaio é a escolha do par anticorpo16, com as características em termos de cinética e vinculação epítopo, sendo a chave para um ensaio bem sucedido. É importante evitar o uso de emparelhados anticorpos monoclonais que destino o mesmo epítopo ou que causam impedimento estérico. Anticorpos policlonais poderiam ser usados como anticorpos de deteção para superar tais limitações. Se em qualquer etapa dada a sensibilidade desejada não for atingida, mais possibilidades de otimização devem ser consideradas. Isto pode incluir o uso de pares de anticorpo alternativos, alterações em parâmetros como tipo de proteína (por exemplo, BSA < caseína), pH (6.0-8.5), força iônica, capacidade tampão (por exemplo, concentrações de NaCl e fosfato), grânulos de transportadora e/ou presença de surfactantes. Uma vasta gama de parâmetros con ser otimizado ao desenvolver um ensaio de matriz única molécula. No entanto, em geral, condições que dão sinal: fundo elevado rácios e mínimos LODs são os preferidos (veja a Figura 3, Figura 1e Figura 2).
Em relação a especificidade, o ensaio de IFN-α mostrou nenhuma reactividade cruzada para qualquer outros IFNs testado (β, γ, λ1, λ2, ω) (figura 4a) e foi capaz de detectar todos os 13 subtipos de IFN-α (figura 4b). No entanto, o ensaio mostrou uma menor afinidade para o subtipo de IFN-α2, (figura 4b e complementar a tabela 4). Curiosamente, sensibilidades diferentes para as diferentes classes de IFN-α2 (a, b, c) foram também observadas, que pode ser devido a processos de fabrico distintas ou sequências de aminoácidos diferentes, como os subtipos de IFN-α2 foram obtidos de diferente comercial fornecedores. Com esta única exceção, todas as espécies de IFN-α deram respostas muito semelhantes. A especificidade do ensaio demonstrou-se ainda mais pelo pré-tratamento das amostras com o anti-IFN-α um clone, que revogada o sinal (Figura 6 e complementar o quadro 6).
Uma das principais vantagens desta tecnologia é que qualquer analito de interesse pode ser potencialmente alvo16. Além disso, diferentes espécimes biológicos podem ser testados, tais como soro, plasma, líquido cefalorraquidiano, lisados celulares, cultura sobrenadantes31 e sequer respirar32. Normalmente, uma diluição de 1:3 do plasma é realizada para evitar entupimento potencial do analisador matriz única molécula. No entanto, o analito de interesse poderia estar presente em concentrações muito baixas na amostra biológica relevante e concentrações mais altas de amostra podem ser necessário (dependendo da sensibilidade do ensaio)33. Apesar de existir a possibilidade de multiplexação, mantendo boa sensibilidade34, é um processo desafiador e ensaios para medição superior a 6 proteínas dentro das mesmas experiências têm ainda de ser desenvolvido35.
A capacidade de detectar e quantificar a citocinas e outras proteínas biológicas relevantes em tão baixas concentrações abre uma nova gama de aplicações33,36. É sabido que inúmeras proteínas exercem seus efeitos mesmo em concentrações muito baixas, o que até agora estavam abaixo do limite de detecção da melhor ELISAs37. Enquanto outras tecnologias de imunoensaio oferecem vantagens sobre convencional ELISA19, demonstramos aqui que única molécula matriz digital ELISA é uma plataforma robusta e reprodutível para a detecção ultra-sensível de baixa concentração de citocinas em amostras humanas. Como tal, esta tecnologia oferece um enorme potencial para a descoberta de biomarker e melhor gestão paciente de uma vasta gama de doenças.

Tipo I IFNs são uma família de citocinas que desempenham um papel central em orquestrar antivirais respostas imunes. Eles foram descobertos por Isaacs e Lindenmann 60 anos há1,2 e agora é conhecido que esta família heterogênea de polipeptídeos compreende 14 diferentes subclasses (13 subtipos de IFN-α e IFN-1 β). Tipo eu IFNs são essenciais para o apuramento das infecções virais, mas também têm sido implicados na patologia de uma variedade de Estados de doenças humanas, incluindo as doenças auto-imunes Lúpus eritematoso sistémico (SLE), Dermatomiosite juvenil (DMJ), e o tipo Eu interferonopathies em qual tipo de constitutivo eu induzida pelo IFN sinalização resulta em patologia3,4,5,6,7.
Estudar tipo de proteína IFN níveis em amostras biológicas tem sido um desafio desde sua identificação inicial como um, "interferindo substância"1,2. Atualmente, o sanduíche do ensaio de imunoabsorção Enzyme-Linked (ELISA) é o método mais utilizado para detecção de proteínas IFN-α. Apesar de ser específicos, simples e rápida, tipo eu IFN ELISAs apresentam limitações importantes, tais como limitada sensibilidade. Além disso, a medição de todos os subtipos de IFN-α requer o uso de múltiplos ensaios cada com sua própria capacidade de detecção e sensibilidade. Enquanto houver ELISAs comerciais que detectam diferentes subtipos de IFN-α, sua sensibilidade é limitada (1,95 pg/mL, pg/mL 12,5 e 12.5 pg/mL, respectivamente) que é muitas vezes insuficiente para detectar proteínas IFN-α em amostras biológicas. Para contornar essa limitação, vários proxy biológico foram desenvolvidos ensaios para quantificar do tipo I IFN medindo expressão gênica induzida ou atividade funcional8,9,10,11, 12 , 13 , 14. no entanto, estes ensaios não fornecem uma medida direta da proteína IFN-α.
Neste estudo, a única molécula matriz digital ELISA tecnologia foi usada para desenvolver um ensaio para a detecção de moléculas de proteína IFN-α única. ELISA digital utiliza a mesma química básica como ELISA convencional, no entanto, a reação ocorre em matrizes compreendendo 50.000 individual 46 femtoliter tamanho poços15,16. Moléculas de proteína única são capturadas pelo anticorpo-revestida de grânulos paramagnéticos e rotuladas com um anticorpo de detecção biotinilado, seguido por ligação de um conjugado de enzima, streptavidin-β-galactosidase (SBG). Posteriormente, os grânulos são suspensos com um substrato fluorogenic, resorufin-β-D-galactopyranoside (RGP), em matrizes de único-molécula. Diminuindo o volume reação 2 bilhões de vezes17, uma alta concentração local do sinal fluorescente é alcançada e contagens de molécula se tornar viáveis, como cada molécula gera um sinal de que agora pode ser fiavelmente mensurados18. Em essência única molécula matrizes são capazes de contar único imunocomplexos e determinar um número médio de enzimas por grânulo (AEB). Contando aos micropoços em que é detectado um sinal permite a quantificação/digitalização de moléculas de proteína, como não há uma correlação direta entre a concentração de proteína e a relação entre contas de immunocomplexed e um número total de grânulos presentes no as câmaras de tamanho femtoliter.
Yeung et al. realizaram um estudo de avaliação abrangente de plataformas usando diferentes tecnologias de nove e quatro citocinas imunoensaios com o objectivo de comparar a precisão do ensaio, sensibilidade e correlação de dados através de diferentes plataformas19. Dentre as principais conclusões do estudo foi que única molécula matrizes e única molécula contando imunoensaio apresentaram a maior sensibilidade para a deteção de citocinas no soro humano dentro do intervalo de concentração de sub-pg/mL. Ensaios de citocina única molécula matriz Digitas ELISA foram usados para estudar o papel do TNF-α e IL-6 no Crohn doença20, IFN-α em interferonopathy e autoimunes pacientes 7, e as diferentes post-translationally modificado em formas de C-X-C motivo chemokine 10 (CXCL10) em hepatite crônica e doadores saudáveis recebendo sitagliptina21,22. Outras aplicações incluem a medição de rodopsina em pacientes com retinopatia diabética,23; o estudo das patologias do cérebro através de medições de soro/plasma do Neurofilamento luz24 e β-amiloide 1-42 peptídeo25, no contexto da esclerose múltipla e a doença de Alzheimer, respectivamente. Ensaios de matriz única molécula também podem ser usados para detecção de patógeno melhorada como caracterização de reservatório viral HIV26e também para detecção de DNA27 e micro RNAs28. Uma grande vantagem da tecnologia de matriz única molécula é este grande versatilidade, como um ensaio contra qualquer analito de interesse pode ser desenvolvido se um par de anticorpo específico está disponível. Além disso, kits de ensaio do homebrew são comercialmente disponíveis, permitindo o desenvolvimento de novos ensaios, o protocolo que é detalhado em uma forma modificada abaixo.
Aqui, uma descrição detalhada das etapas de desenvolvimento e validação para um ensaio de matriz única molécula é apresentada que resulte em maior sensibilidade para a deteção de proteínas de IFN-α. Anticorpos para ensaios de matriz única molécula devem ser altamente específicos, evitando a reactividade cruzada com proteínas relacionadas (com especificidade de espécie considerada-se relevante). Idealmente, devem ser escolhidos de anticorpos com um KD menor que 10-9 M; alta afinidade assegura ligação forte, com a produção de um sinal mais elevado. A cinética da ligação antígeno-anticorpo são também importantes e rápido Kna e K lentofora favorecerá a montagem de complexos antígeno-anticorpo. Começando com um par de anticorpo que tem um bom desempenho em ELISA clássica, com um limite de detecção (LOD) de 1-100 pg/mL, aumenta as chances de obtenção de um ensaio de matriz de molécula altamente sensível. Chang e colegas realizaram estudos cinéticos detalhados das interações biomoleculares ocorrendo em cada passo, propondo um conjunto de equações para predizer a sensibilidade analítica18. Eles mostraram essa matriz única molécula ELISA digital parece ser eficaz dentro de uma ampla gama de afinidades de anticorpo (KD ~ 10−11 - 10−9 M), bem como a geração de sinal é mais dependente a taxa de tais anticorpos.
Para utilizar alta afinidade anticorpos que tiramos vantagem de anticorpos isolados de pacientes com a Síndrome Poliglandular autoimune tipo 1/autoimune Poliglandular-candidíase-ectodérmica distrofia (APS1/APECED)29. Por razões que ainda não estão totalmente esclarecidos, a grande maioria dos indivíduos de AIRE-deficiente desenvolver um conjunto de alta avidez anticorpos contra todos os subtipos de IFN-α29, e nós selecionamos dois clones de anticorpo anti-IFN-α de afinidades de ligação complementares para os diferentes subtipos de IFN-α, como estimado por valores de IC50 . A combinação destes anticorpos exclusivo de alta afinidade com a tecnologia de matriz única molécula permitiu a quantificação direta de IFN-α em concentrações attomolar (fg/mL). Tal deteção de proteínas de IFN-α ultra-sensível irá contribuir para uma melhor compreensão da natureza, regulamento e impacto biológico da resposta induzida pelo IFN em configurações diferentes da doença.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody A (8H1 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody B (12H5 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody EBI-1 clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody BMS216BK clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216BK</td>
			<td>Not an ELISA kit but bulk abs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2c</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS305</td>
			<td>OK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;I (17)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2b</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;1</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11175-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4a (M1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4b (a4)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11180-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;B2 (a8)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11115-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;C (a10)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;D (a1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11125-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;G (a5)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11135-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;F (a21)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11130-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;H2 (a14)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;J1 (a7)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11160-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;K (a6)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11165-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;WA (a16)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11190-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#969;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#946;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; ELISA</td>
			<td>PBL</td>
			<td>41115.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISRE-Reporter</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>CCS-008L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fu-GENE HD Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Mediuem</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40 Substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer NanoDrop 1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtres</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC505096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Conjugation Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Encoded Paramagnetic Beads</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Wash Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11844071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Blocking Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Diluent Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector and Sample Diluent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylation Reaction Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11891195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>MS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa) reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBG, Bead and Detector Barcode Labels</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Reagent Bottles</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa specimen 96-well plates</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Discs</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa 2.0 conductive Tips</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Cuvettes</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa SBG Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa RGP Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 1</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 2</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing Oil</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa HD-1 Analyzer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa)</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems</td>
			<td>Singluex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;

O principal objectivo do presente protocolo é descrever o desenvolvimento e validação de um interferon (IFN)-ensaio digital do ensaio de imunoabsorção Enzyme-Linked (ELISA) de α única molécula matriz. Este sistema permite a quantificação da proteína IFN-α humana com sensibilidade sem precedentes e com nenhuma reactividade cruzada para outras espécies de IFN.
A primeira etapa chave do protocolo é a escolha do par de anticorpos, seguido pela conjugação do anticorpo captura de grânulos paramagnéticos e biotinylation do anticorpo de detecção. Após esta etapa, diferentes parâmetros, tais como configuração de ensaio, concentração de anticorpo do detector e composição do tampão podem ser modificados até que seja alcançada a sensibilidade a melhor. Finalmente, especificidade e reprodutibilidade do método são avaliados para garantir confiança nos resultados. Aqui, nós desenvolvemos um ensaio de matriz única molécula IFN-α com um limite de detecção de 0,69 fg/mL usando alta afinidade auto-anticorpos isolados de pacientes com biallelic mutações na proteína regulador auto-imune (AIRE) causando Poliglandular Auto-imune síndrome tipo 1/autoimune Poliglandular-candidíase-ectodérmica distrofia (APS1/APECED). Importante, estes anticorpos permitiram a deteção de 13 todos os subtipos de IFN-α.
Esta nova metodologia permite a detecção e quantificação de proteína IFN-α em amostras biológicas humanas em concentrações attomolar pela primeira vez. Essa ferramenta será muito útil na monitorização dos níveis desta citocina na saúde humana e Estados de doença, mais particularmente infecção, auto-imunidade e autoinflammation.

Em resumo, um ensaio de matriz única molécula pan-IFN-α com um limite de detecção de 0,69 fg/mL, usando uma configuração de 2-passo com captura de grânulos revestidos com 0,3 mg/mL de anti-IFN-α um anticorpo e anti-IFN-α B deteção anticorpo biotinilado na proporção de biotina: anticorpo 30 foi desenvolvido. As concentrações usadas para biotinilado deteção e SBG foram 0,3 µ g/mL e 150 pM, respectivamente. Este ensaio altamente específico é capaz de detectar todos os 13 subtipos de IFN-α e o cross não reage com outro tipo de IFNs. Assim, enquanto não é possível identificar e quantificar cada espécie individual de IFN-α, todos eles podem ser detectados e medidos juntos, dando um valor de concentração total para IFN-α, que compreende as 13 diferentes subclasses.
Para explorar o potencial valor diagnóstico deste teste recentemente desenvolvido, proteína IFN-α no plasma e no soro de indivíduos saudáveis foram medidos e comparados com amostras de pacientes que sofrem de SLE e JDM. Conforme ilustrado na Figura 7, altos níveis de proteína IFN-α foram detectados em ambas as coortes de doença em comparação com controles saudáveis. A linha pontilhada indica o LOD de um convencional ELISA comercialmente disponível, ilustrando como esta abordagem não detectaria proteína IFN-α nestes grupos de pacientes apesar das associações desta citocina conhecidas com estes fenótipos. Além disso, IFN-α pode ser quantificada sobre 5 registros de magnitude, ilustrando a ampla faixa dinâmica do ensaio, com níveis detectáveis entre 1-10 fg/mL, confirmando a natureza altamente sensível do ensaio.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57421/57421fig7.jpg"> Figura 7: quantificação da proteína IFN-α no plasma e soro do pacientes coortes. Esta figura foi modificada em Rodero et al. 2017. plasma de controles saudáveis (n = 20) e pacientes que sofrem de SLE (n = 72) e JDM (n = 43) foram testados com o ensaio de matriz única molécula pan-IFNα. Análise foi realizada usando o teste de ANOVA One-Way (Kruskal-Wallis) e do Dunn teste entre grupos de comparação múltipla. Mediana é retratada. Linha pontilhada indica LOD de um referência humana anti-IFN-α ELISA (1,95 pg/mL = 1950 fg/mL). <a href="/files/ftp_upload/57421/57421fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Passo</td>
			<td>Considerações sobre</td>
			<td>Referência</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1. escolha do par de anticorpo</td>
			<td>Diferentes epitopos alvo</td>
			<td rowspan="3">Tabela 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alta afinidade</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rápido Kna / K lentofora
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2. orientação do par anticorpo</td>
			<td rowspan="3">Escolha uma condição com o menor limite de detecção</td>
			<td rowspan="3">Figura 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3. capturar a concentração de anticorpos</td>
		</tr>
<tr>
<td>4. relação de anticorpo biotina: Detector</td>
		</tr>
<tr>
<td>5. 2 vs 3-passo de configuração</td>
			<td>Escolher a condição com a maior relação de sinal: fundo</td>
			<td>Figura 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6. concentração de anticorpo detector</td>
			<td rowspan="2">Escolha uma condição com o menor limite de detecção</td>
			<td rowspan="2">Figura 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>7. concentração de SBG</td>
		</tr>
<tr>
<td>8. especificidade</td>
			<td>Determinar a reactividade cruzada</td>
			<td rowspan="2">Figura 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9. sensibilidade</td>
			<td>Avaliar o reconhecimento dos subtipos (se aplicável)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10. reprodutibilidade</td>
			<td>Avaliar a variabilidade do ensaio</td>
			<td>Figura 5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Resumo das etapas de desenvolvimento e otimização de um ensaio de matriz única molécula. Esta tabela resume os diferentes passos necessários para o desenvolvimento e otimização de um ensaio de matriz única molécula, desde a escolha inicial do par de anticorpo até a avaliação da reprodutibilidade.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antigénio</td>
			<td>8H 1 (A)</td>
			<td>12H 5 (B)</td>
			<td>Sifalimumab</td>
			<td>Rontalizumab</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ1</td>
			<td>28,3</td>
			<td>51,3</td>
			<td>460</td>
			<td>22,63</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ2</td>
			<td>2563</td>
			<td>10.7</td>
			<td>9,02</td>
			<td>2.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ4</td>
			<td>5.11</td>
			<td>2.99</td>
			<td>35.35</td>
			<td>325.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ5</td>
			<td>2.01</td>
			<td>19,6</td>
			<td>93.29</td>
			<td>2,49</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ6</td>
			<td>64,7</td>
			<td>3.03</td>
			<td>4.97</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ7</td>
			<td>0.9</td>
			<td>0,63</td>
			<td>233.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ8</td>
			<td>302</td>
			<td>0,83</td>
			<td>691</td>
			<td>10,86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ10</td>
			<td>2.54</td>
			<td>0,71</td>
			<td>43,2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ14</td>
			<td>3224</td>
			<td>2.1</td>
			<td>14.52</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ16</td>
			<td>1.83</td>
			<td>32.99</td>
			<td>59,18</td>
			<td>28.65</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ17</td>
			<td>2.21</td>
			<td>0,77</td>
			<td>890,9</td>
			<td>23.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ21</td>
			<td>2.78</td>
			<td>12.87</td>
			<td>1769</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: seleção do anticorpo Pan-alfa. IC50 (ng/mL) determinada usando o elemento de resposta interferon-estimulada (ISRE)-ensaio de neutralização de Luciferase. Tabela mostra valores de IC50 de mAbs utilizados no ensaio de matriz única molécula para todos os subtipos de IFN-α. 10.000 células HEK 293 MSR foram semeadas em placas de 96 poços de metade-área brancas e reverso-transfectadas com 50 ng pré-misturado ISRE-Firefly luciferase repórter e construtos de Renilla luciferase usando reagentes de transfecção de acordo com as instruções do fabricante. A construção do luciferase-expressando serviu como um controle interno de normalização. As células foram incubadas durante a noite em reduzida soro suplementado com aminoácidos não essenciais de 0,1 mM, piruvato de sódio 1 mM, 0,5% de soro bovino fetal a 37º C, 5% de CO2 em um ambiente umidificado. Após a incubação durante a noite, as células foram estimuladas por 24 h com meio contendo misturas de recombinante humano IFN-α com ou sem anti-IFN-α mAbs ou controle IgG que tinha sido pré-incubada durante 1 h a 37 ° C. Após 24h de estimulação, dual luciferase repórter ensaios foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. «-» Não determinado. Sifalimumab é um plenamente humano, imunoglobulina G1 κ anticorpo monoclonal que vincula e neutraliza a maioria dos subtipos de IFN-α; Rontalizumab é um anticorpo monoclonal humanizado contra IFN-α. Adaptado de Meyer et al . 2016 e Rodero et al 2017.
Suplementares tabela 1: seleção da orientação do anticorpo, capturar a concentração de anticorpo em grânulos e relação biotinylation. Foram testadas duas possíveis configurações diferentes, usando o A anti-IFN-α como captura anticorpo e anti-IFN-α B como anticorpo de deteção (A) e vice versa (B). IFNα - 2C foi utilizado como antígeno. Captura de diferentes concentrações de anticorpos, bem como relações de biotina: anticorpo (B:A) também foram testadas para ambas as configurações. Saturação (Sat). Laranja: Valores AEB que foram usados para cálculo de LOD; essas concentrações foram consideradas em branco como os valores AEB manteve-se estável. LOD foi calculado como dizer em branco + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_1.xlsx">clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Suplementares tabela 2: teste da configuração do passo 3-2 vs. As configurações de etapa 2 e 3 - foram avaliadas usando IFNα - 2C como antígeno. Valores AEB também como sinal/fundo rações (S/B) são mostradas para ambas as condições. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_2.xlsx">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Suplementares tabela 3: otimização de concentração Detector e SBG. Três diferentes concentrações de biotinilado detector (0,1, 0,3 e 0,6 µ g/mL) em conjunto com três diferentes concentrações da SBG (50, 150 e 250 pM) foram avaliados. AEB valores são mostrados para as nove condições testadas. Laranja: Valores AEB que foram usados para cálculo de LOD; essas concentrações foram consideradas em branco como os valores AEB manteve-se estável. LOD foi calculado como dizer em branco + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_3.xlsx">clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Suplementares tabela 4: especificidade e sensibilidade do ensaio de matriz de molécula do IFNα otimizado. Enzima média por valores de grânulos são mostrados quando IFN-β, IFN-λ1, λ2-IFN, IFN-ω e IFN-γ proteínas recombinantes foram testaram (A), juntamente com os 16 subtipos de IFN-α (B). «-» Não determinado. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_4.xlsx">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Suplementares tabela 5: reprodutibilidade do otimizado IFNα única molécula matriz ensaio. Os valores médios da AEB para todas as três corridas independentes são mostrados para uma concentração de 10.000 fg/mL. «-» Não determinado. Saturação (Sat). <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_5.xlsx">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Suplementares tabela 6: ensaio de competição de proteína. Enzima média por grânulos, os valores são mostrados para todas as condições testadas. As medições foram feitas em duplicado. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_6.xlsx">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Aqui nós apresentamos um protocolo para descrever o desenvolvimento e validação de uma única molécula matriz digital ensaio de ELISA, que permite a detecção de ultra sensível de todos os subtipos de IFN-α em amostras humanas.

Desenvolvimento e validação de uma única molécula ultra-sensível de matriz Digital ensaio imunossorvente ligado à enzima para humana Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

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O uso de interferão-γ Enzyme-linked Assay immunospot Caracterizar Novel epitopos de células T de papilomavírus humano

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Caracterização de Respostas Inflamatórias Durante Colonização Intranasal com Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Visualizando interações DNA-proteína em células bacterianas ao vivo usando fotoativado única molécula de Rastreamento

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Aplicação de longo prazo cultivadas Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Ensaio para a Avaliação e efetoras de memória T respostas de células em gado

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Desenvolvimento e validação de um método PCR quantitativa para equídeo herpesvírus 2 Diagnostics em fluidos respiratórios

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Estabelecimento de um programa de configuração de alta capacidade para a triagem de pequenas moléculas que modulam c-di-GMP Sinalização<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Ensaio de Adesão Sob tensão de cisalhamento para o Estudo da Linfócitos T-Molécula de adesão de Interações

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Medição de Inibição da Neuraminidase Influenza títulos de anticorpos por Enzyme-linked Lectina Ensaio

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...