Name: development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;
Uploaded: 2018-06-14T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃŽÂ± at JoVE.com

DD и YJC отметить поддержку от НРУ (проект IFNX, нет. CE17001002) и ImmunoQure AG для предоставления моноклональных антител. Мы благодарим Brigitte Бадер-Менье, Наталия Беллон, Кристин Bodemer, Алекс Belot, Изабель мелки и Пьер Quartier за предоставление клинических образцов. YJC признает Европейский исследовательский совет (GA 309449: стипендий для YJC) и государственные субсидии по программе «Инвестиции для будущего», учитывая ссылку АНР-10-IAHU-01 в ведении Национального исследовательского агентства (Франция).

<ol>
	<li>Isaacs, A., Lindenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classics+in+Oncology+Virus+Interference:+I.+The+Interferon.">Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).</li><li>Isaacs, A., Lindenmann, J., Valentine, R. C., Alerts, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pillars+Article:+Virus+Interference.+II.+Some+Properties+of+Interferon.">Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).</li><li>Hunt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombotic+Microangiopathy+Associated+with+Interferon+Beta.">Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta.</a> N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).</li><li>Hooks, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Interferon+in+the+Circulation+of+Patients+with+Autoimmune+Disease.">Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease.</a> N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).</li><li>Greenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-alpha/beta+Mediated+Innate+Immune+Mechanisms+in+Dermatomyositis.">Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis.</a> Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).</li><li>Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+interferonopathies+a+novel+set+of+inborn+errors+of+immunity.">Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).</li><li>Rodero, M. P., Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+interferon+-+mediated+monogenic+autoinflammation:+The+type+I+interferonopathies,+a+conceptual+overview.">Type I interferon - mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview.</a> J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).</li><li>Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+biological+assay+for+interferons.">A sensitive biological assay for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).</li><li>Meager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+assays+for+interferons.">Biological assays for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).</li><li>Hua, J., Kirou, K., Lee, C., Crow, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Assay+of+Type+I+Interferon+in+Systemic+Lupus+Erythematosus+Plasma+and+Association+With+Anti+-+RNA+Binding+Protein+Autoantibodies.">Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti - RNA Binding Protein Autoantibodies.</a> Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).</li><li>Niewold, T. B., Kariuki, S. N., Morgan, G. A., Shrestha, S., Pachman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+serum+interferon-alpha+activity+in+juvenile+dermatomyositis:+associations+with+disease+activity+at+diagnosis+and+after+thirty-six+months+of+therapy.">Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy.</a> Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).</li><li>Seo, Y., Kim, G., Kwak, H., Nam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+HeLa+Mx2+/+Luc+Reporter+Cell+Line+for+the+Quantification+of+Human+Type+I+Interferons.">Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons.</a> Pharmacology. 84, 135-144 (2009).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+surface+expression+of+Fc&#947;+receptor+RI+(+CD64+),+a+biomarker+reflecting+type-I+interferon+levels+in+systemic+lupus+erythematosus.">Monocyte surface expression of Fc&#947; receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).</li><li>Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Vesicular+Stomatitis+Virus+Replicon-Based+Bioassay+for+the+Rapid+and+Sensitive+Determination+of+Multi-Species+Type+I+Interferon.">A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon.</a> PLoS One. 6, e25858 (2011).</li><li>Rissin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assay+detects+serum+proteins+at+subfemtomolar+concentrations.">Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations.</a> Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).</li><li>Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+array+(Simoa)+assay+with+optimal+antibody+pairs+for+cytokine+detection+in+human+serum+samples.">Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples.</a> R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).</li><li>Simoa. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+Principle+of+SimoaTM+(Single+Molecule+Array)+Technology.">Scientific Principle of SimoaTM (Single Molecule Array) Technology.</a> Whitepaper 1.0. , 1-2 (2013).</li><li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assays+Theoretical+considerations.">Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations.</a> J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).</li><li>Yeung, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+highly+sensitive+immunoassay+technologies+for+quantitative+measurements+of+sub-pg+/+mL+levels+of+cytokines+in+human+serum.">Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum.</a> J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+measurements+of+tumor+necrosis+factor+&#945;+and+interleukin-6+in+the+plasma+of+patients+with+Crohn's+disease.">Single molecule measurements of tumor necrosis factor &#945; and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease.</a> J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).</li><li>Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Changes+of+Post-Translationally+Modified+Forms+of+CXCL10+and+Soluble+DPP4+in+HCV+Subjects+Receiving+Interferon-Free+Therapy.">Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy.</a> PLoS One. 10, e0133236 (2015).</li><li>Decalf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+DPP4+activity+in+humans+establishes+its+in+vivo+role+in+CXCL10+post-translational+modification:+prospective+placebo-controlled+clinical+studies.">Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies.</a> EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).</li><li>Rabing Brix Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+in+plasma+from+patients+with+diabetic+retinopathy+-+development+and+validation+of+digital+ELISA+by+Single+Molecule+Array+(Simoa)+technology.">Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy - development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology.</a> J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).</li><li>Disanto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+Neurofilament+Light:+A+Biomarker+of+Neuronal+Damage+in+Multiple+Sclerosis.">Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis.</a> Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+ultrasensitive+measurement+of+amyloid-+&#946;+1+-+42+peptide+in+human+plasma+with+utility+for+studies+of+Alzheimer's+disease+therapeutics.">A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- &#946; 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics.</a> Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).</li><li>Passaes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+HIV-1+p24+Assay+Detects+Single+Infected+Cells+and+Differences+in+Reservoir+Induction+by+Latency+Reversal+Agents.">Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents.</a> J. Virol. 91, e02296 (2017).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Detection+of+Bacterial+Genomic+DNA+at+Sub-Femtomolar+Concentrations+Using+Single+Molecule+Arrays.">Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays.</a> Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).</li><li>Cohen, L., Hartman, M. R., Amardey-wellington, A., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+direct+detection+of+microRNAs+using+single+molecule+arrays.">Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays.</a> Nucleic Acids Res. 45, e137 (2017).</li><li>Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AIRE-Deficient+Patients+Harbor+Unique+High-Affinity+Disease-Ameliorating+Autoantibodies.">AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies.</a> Cell. 166, 582-595 (2016).</li><li>Simoa. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homebrew+Assay+Development+Guide.">Homebrew Assay Development Guide.</a> Simoa HD-1 Analyzer &amp; Quanterix SR-X. User-0021 08. , (2017).</li><li>Rodero, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+interferon+alpha+protein+reveals+differential+levels+and+cellular+sources+in+disease.">Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease.</a> J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).</li><li>Pleil, J., Angrish, M., Madden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemistry+for+high-throughput+screening+of+human+exhaled+breath+condensate+(EBC)+media+implementation+of+automated+Quanterix+SIMOA+instrumentation.">Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation.</a> J. Breath Res. 9, 047108 (2015).</li><li>Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Proteomic+Strategy+for+Clinical+Biomarker+Discovery.">Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery.</a> Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).</li><li>Wilson, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Simoa+HD-1+Analyzer:+A+Novel+Fully+Automated+Digital+Immunoassay+Analyzer+with+Single-Molecule+Sensitivity+and+Multiplexing.">The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing.</a> J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).</li><li>Rivnak, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully-automated,+six-plex+single+molecule+immunoassay+for+measuring+cytokines+in+blood.">A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood.</a> J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).</li><li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Plasma+Proteome.+History,+character,+and+diagnostic+prospects.">The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).</li><li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISA+in+the+multiplex+era:+Potentials+and+pitfalls.">ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls.</a> Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Здесь мы описали, разработки и проверки цифровой массив ELISA высокую воспроизводимость, сверхчувствительная одной молекулы для прямого количественного определения белка ИФН α в образцах (шаги приведены в таблице 1). Одним из важнейших шагов в развитии assay является выбор антитела пара16, с характеристиками с точки зрения кинетики и epitope привязки является ключом к успешной assay. Важно избежать использования парных моноклональных антител, предназначенных же эпитоп или которые вызывают их пространственной препятствием. Поликлональные антитела могут использоваться как обнаружение антител для преодоления таких ограничений. Если на любом этапе не будет достигнуто желаемого чувствительность, следует рассмотреть дальнейшие возможности оптимизации. Это может включать использование альтернативных антитела пар, изменения в параметры, такие как тип протеина (например BSA < казеина), рН (6.0-8,5), ионной силы, буферной емкости (например, концентрации NaCl и фосфат), перевозчик бусы или присутствии ПАВ. Широкий спектр параметров con оптимизирован при разработке пробирного массив одной молекулы. Однако, в целом, условия, которые дают высокий сигнал: фон коэффициенты и минимальным LODs являются те предпочитали (см. рис. 1, рис. 2и рис. 3).
Что касается специфики, ИФН α assay показал, нет перекрестной реактивности для любых других IFNs испытания (β, γ, λ1, λ2, ω) (рис. 4a) и был способен обнаруживать все подтипы 13 ИФН α (рис. 4В). Однако assay показан ниже сродство для подтипа ИФН α2, (рис. 4b и Дополнительная таблица 4). Интересно, что разные чувствительности для различных классов ИФН α2 (a, b, c) также наблюдались, которые могут быть из-за различных производственных процедур или различных аминокислот, как подтип ИФН α2 были получены из различных коммерческих поставщиков. С этим единственным исключением все виды ИФН α дал очень похожи ответы. Специфика assay далее подтверждается предварительной обработки образцов с анти ИФН α клона, который отменил сигнал (рис. 6 и Дополнительная таблица 6).
Одним из главных преимуществ этой технологии является, что любой аналита интерес может быть целевой16. Кроме того могут быть проверены различные биологические образцы, такие как сыворотка, плазма, спинномозговой жидкости, сотовой лизатов, supernatants культуры31 и даже дыхание32. Обычно 1:3 Разведение плазмы производится во избежание потенциальных засорения анализатор массив одной молекулы. Однако аналита интерес может присутствовать при очень низких концентрациях в соответствующих биологических образцов и более высокие концентрации образца может быть необходимо (в зависимости от анализа чувствительности)33. Хотя существует потенциал для мультиплексирования при сохранении хорошей чувствительностью34, это более сложный процесс и анализов для измерения более чем 6 белков внутри те же эксперименты должны еще быть развитых35.
Способность выявлять и количественно цитокинов и другие биологические соответствующих белков при таких низких концентрациях открывает совершенно новый спектр приложений33,36. Хорошо известно, что многие белки оказывать свое действие даже при очень низких концентрациях, которые до сих пор были ниже предела обнаружения лучших ELISAs37. В то время как другие иммуноанализа технологии предлагают преимущества перед обычными ELISA19, мы демонстрируем здесь что одной молекулы массив цифровых ELISA является воспроизводимость и надежной платформой для сверхчувствительная обнаружения низкой концентрации цитокинов в образцах. Таким образом эта технология предлагает огромный потенциал для открытия биомаркеров и улучшение пациента управления широкого спектра заболеваний.

Тип я IFNs представляют собой семейство цитокинов, которые играют центральную роль в оркеструя противовирусное иммунных реакций. Они были впервые обнаружены Айзекс и Линденманн 60 лет назад,1,2 и это теперь известно что это гетерогенной семья полипептиды состоит из 14 различных подклассов (13 подтипам ИФН α и 1 IFN-β). Тип я IFNs важны для очистки вирусных инфекций, но также были вовлечены в патологии различных заболеваний человека государств, включая аутоиммунные расстройства системной красной волчанкой (СКВ), несовершеннолетних дерматомиозит (JDM), и тип Я interferonopathies в котором учредительный типа я ИФН индуцированной сигнализации приводит к патологии3,4,5,6,7.
Изучение типа ИФН белка уровнях в биологических образцах был сложным с ее первоначальной идентификации как «вмешательство вещество»1,2. В настоящее время сэндвич твердофазный Assay иммуносорбента (ELISA) является наиболее широко используемый метод для обнаружения ИФН α белка. Несмотря на то что конкретные, простой и быстрый, типа я ИФН ELISAs представляют важные ограничения, такие как Предельная чувствительность. Кроме того измерение всех подтипов ИФН α требует использования нескольких анализов с их собственный потенциал обнаружения и чувствительность. Хотя есть коммерческие ELISAs, которые обнаруживают различные подтипы ИФН-α, их чувствительность ограничен (1.95 пг/мл, 12,5 пг/мл и 12,5 пг/мл, соответственно) который часто является недостаточным для выявления белок Интерферон α в биологических образцах. Чтобы преодолеть это ограничение, несколько прокси биологических анализов были разработаны для количественного определения типа ИФН путем измерений индуцированных генных выражение или функциональную активность8,9,10,11, 12 , 13 , 14. Тем не менее, эти анализы не предоставляют прямого измерения ИФН α белка.
В этом исследовании одной молекулы массив цифровых ELISA технология была использована для разработки assay для обнаружения одного ИФН α белковых молекул. Цифровая ELISA использует же основной химии как обычные ELISA, однако, реакция происходит в массивах, состоящий из 50000 индивидуальных 46 размера femtoliter скважин15,16. Один белковых молекул захвачен антителами парамагнитных бусины и помечены биотинилированным обнаружения антител, а затем связывание фермента конъюгата, стрептавидина β-галактозидазы (SBG). Впоследствии бисер приостановлены с fluorogenic ферментов субстрат, resorufin-β-D-галактопиранозид (РГП), в одной молекула массивы. Уменьшая объем реакции 2 миллиарда раз17, высокая концентрация местных флуоресцентного сигнала достигается и одной молекулы рассчитывает стать возможным, поскольку каждая молекула генерирует сигнал, который теперь могут быть надежно измерены18. По существу массивы одной молекулы способны подсчета единого immunocomplexes и определяя среднее количество ферментов на шарик (AEB). Подсчет microwells, в котором обнаружен сигнал позволяет количественная оценка/цифровизации белковых молекул, как существует прямая корреляция между концентрацией белка и соотношение между immunocomplexed бисер и общее количество бусин, присутствующих в femtoliter размера камеры.
Юнг и др. провел исследование обширной оценки кросс платформенный, с использованием девяти различных технологий и четыре цитокина иммуноанализа с целью сравнения пробирного точность, чувствительность и корреляции данных через различные платформы19. Один из основных выводов этого исследования было, что одной молекулы массивы и одной молекулы, считая иммуноанализа представил высокая чувствительность для обнаружения цитокинов в сыворотке крови человека в диапазоне суб пг/мл, концентрация. Одной молекулы массив цифровых цитокина assays ELISA были использованы для изучения роли ФНО α и IL-6 в крона болезнь20, ИФН α в interferonopathy и 7аутоиммунное пациентам, и различные post-translationally изменение формы C-X-C мотив хемокиновых 10 (CXCL10) в хронический гепатит и здоровых доноров, получающих ситаглиптина21,22. Другие приложения включают в себя измерение родопсина у больных с диабетической ретинопатии23; исследование патологий мозга путем измерения сыворотки/плазмы neurofilament свет24 и амилоид β 1-42 пептид25в контексте рассеянного склероза и болезни Альцгеймера, соответственно. Одной молекулы массив анализов может использоваться также для улучшения возбудителя обнаружения таких характеристик ВИЧ вирусных водохранилище26, а также для обнаружения ДНК27 и микро РНК28. Основным преимуществом технологии одной молекулы массив является высокая универсальность, как assay против любого аналита интерес может быть разработан, при наличии пара специфическое антитело. Кроме того доморощенного наборы assay коммерчески доступных, позволяя развития новых анализов, протокол которого подробно описана в измененной форме ниже.
Здесь подробное описание шагов разработки и проверки для assay массив одной молекулы, результаты представлены в повышенной чувствительностью для обнаружения белок Интерферон α. Антитела для одной молекулы массив анализов должны быть весьма конкретными, избегая перекрестной реактивности с родственных белков (специфика видов, считается, если соответствующие). В идеале должны быть выбраны антитела с KD меньше, чем 10-9 M; высокое сродство обеспечивает прочное связывание с производством выше сигнала. Кинетика антитело антиген-связывая также являются важными и быстро Kна и медленным Kот будет пользу Ассамблеи комплекс антиген антитело. Начиная с антителом пару, которая имеет хорошую производительность в классической ИФА, с пределом обнаружения (LOD) 1-100 пг/мл, увеличивает шансы получения пробирного массив высокочувствительный одной молекулы. Чанг и коллеги выполнены детальные кинетические исследования биомолекулярного взаимодействия, происходящие в каждый шаг, предлагая набор уравнений, чтобы предсказать Аналитическая чувствительность18. Они показали, что одной молекулы массива цифровой ELISA, как представляется, быть эффективным в широком диапазоне сродства антител (KD ~ 10−11 - 10−9 М), а также что сигнал поколения больше зависит на стоимость таких антител.
Чтобы использовать высокое сродство антитела, мы воспользовались антител изолированы от больных с синдромом аутоиммунных polyendocrinopathy типа 1/аутоиммунных polyendocrinopathy кандидоз эктодермы дистрофия (APS1/APECED)29. По причинам, которые пока еще не поняты значительное большинство лиц, Эр недостаточным разработать основной набор высокого алчность антител против всех ИФН α подтипы29, и мы выбрали два клона антитела анти ИФН α дополнительные привязки работоспособностью для разных подтипов ИФН α, по оценкам IC50 значений. Сочетание этих уникальных высокоспецифичных антител с одной молекулы массив технологии позволили прямой количественной оценке ИФН α в концентрации attomolar (fg/мл). Такие сверхчувствительная Обнаружение белка ИФН α будет способствовать более глубокому пониманию природы, регулирование и биологического воздействия ИФН индуцированной ответа в настройках различных заболеваний.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody A (8H1 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody B (12H5 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody EBI-1 clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody BMS216BK clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216BK</td>
			<td>Not an ELISA kit but bulk abs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2c</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS305</td>
			<td>OK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;I (17)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2b</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;1</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11175-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4a (M1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4b (a4)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11180-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;B2 (a8)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11115-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;C (a10)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;D (a1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11125-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;G (a5)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11135-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;F (a21)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11130-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;H2 (a14)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;J1 (a7)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11160-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;K (a6)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11165-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;WA (a16)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11190-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#969;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#946;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; ELISA</td>
			<td>PBL</td>
			<td>41115.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISRE-Reporter</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>CCS-008L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fu-GENE HD Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Mediuem</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40 Substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer NanoDrop 1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtres</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC505096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Conjugation Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Encoded Paramagnetic Beads</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Wash Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11844071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Blocking Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Diluent Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector and Sample Diluent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylation Reaction Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11891195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>MS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa) reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBG, Bead and Detector Barcode Labels</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Reagent Bottles</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa specimen 96-well plates</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Discs</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa 2.0 conductive Tips</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Cuvettes</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa SBG Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa RGP Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 1</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 2</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing Oil</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa HD-1 Analyzer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa)</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems</td>
			<td>Singluex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;

Основной целью настоящего Протокола является описание разработки и проверки интерферон (ИФН)-α одной молекулы массив цифровых твердофазный Assay иммуносорбента (ELISA) анализа. Эта система позволяет количественная оценка человеческого ИФН α белка с беспрецедентной чувствительностью и нет перекрестной реактивности для других видов ИФН.
Первый ключевой шаг протокола является выбор пары антитела, следуют спряжение захвата антитела парамагнитных бусин и biotinylation обнаружения антител. После этого шага можно изменять различные параметры, такие как Пробирной конфигурации, детектор концентрации антител и состав буфера до достижения оптимальной чувствительности. Наконец специфика и воспроизводимости метода оцениваются для обеспечения уверенности в результатах. Здесь мы разработали assay массив одной молекуле ИФН α с пределом обнаружения 0,69 fg/мл, используя высокоспецифичные аутоантител, изолированы от пациентов с biallelic мутации белка аутоиммунных регулятор (Эр), вызывая аутоиммунных polyendocrinopathy синдром типа 1/аутоиммунных polyendocrinopathy кандидоз эктодермы дистрофия (APS1/APECED). Важно отметить, что эти антитела включено обнаружение всех 13 подтипам ИФН α.
Эта новая методология позволяет обнаружения и количественного определения белка ИФН α в человека биологических пробах в концентрациях, attomolar в первый раз. Такой инструмент будет весьма полезным в мониторинге уровня этого цитокина в здоровье и болезни государства, большинство особенно инфекции, аутоиммунные заболевания и autoinflammation.

Таким образом массив пробирного Пан ИФН α одной молекулы с пределом обнаружения 0,69 fg/мл, с использованием 2-шаг конфигурации с бисером захвата покрытием с 0.3 мг/мл анти ИФН-α антитела и анти ИФН α B обнаружения антител биотинилированным в соотношении биотина: антитела 30 был разработан. Используется для обнаружения антител биотинилированным и SBG концентрации были 0,3 мкг/мл и 150 часов, соответственно. Это весьма специфический assay способен обнаруживать все 13 подтипам ИФН α и крест не реагируют с другим типом IFNs. Таким образом хотя это не возможно для идентификации и количественной оценки каждого индивидуального вида ИФН α, все из них могут быть обнаружены и измеряется вместе давая Общая концентрация значение для ИФН α, которая состоит из 13 различных подклассов.
Чтобы исследовать потенциальные диагностические значение Этот недавно разработанный assay, ИФН α белка в плазме крови и сыворотки от здоровых лиц были измеряется и сравнивается с образцами от пациентов, страдающих от СКВ и JDM. Как показано на рисунке 7, высокий уровень белка ИФН α были обнаружены в обеих когортах болезни по сравнению с здорового контроля. Пунктирная линия показывает Лод обычными коммерчески доступных ELISA, иллюстрирующие, как этот подход не будет обнаруживать белок Интерферон α в этих групп пациентов, несмотря на известные ассоциации этого цитокина с этими фенотипов. Кроме того ИФН α может быть количественно над 5 журналы величины, иллюстрирующих широкий динамический диапазон assay, с обнаружению уровней между 1-10 fg/мл подтверждающие весьма деликатный характер assay.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57421/57421fig7.jpg"> Рисунок 7: количественная оценка ИФН α белка в плазме крови и сыворотки от пациента когорт. Этот рисунок был изменен с Rodero и др. 2017. плазмы, от здоровых элементов (n = 20) и пациентов, страдающих от СКВ (n = 72) и JDM (n = 43) были протестированы с Пан IFNα одной молекулы массив assay. Анализ проводился с помощью односторонней теста ANOVA (Крускала-Уоллиса) и Данн множественные сравнения тестирование между группами. Медиана изображен. Пунктирная линия показывает Лод ELISA ссылку по анти ИФН α (1.95 пг/мл = 1950 fg/мл). <a href="/files/ftp_upload/57421/57421fig7large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Шаг</td>
			<td>Соображений</td>
			<td>Ссылка</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1. антитела пара выбор</td>
			<td>Цель различных эпитопов</td>
			<td rowspan="3">Таблица 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Высокое сродство</td>
		</tr>
<tr>
<td>Быстро Kна / медленно Kвыкл
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2. антитела пара ориентации</td>
			<td rowspan="3">Выбор условий с низким предел обнаружения</td>
			<td rowspan="3">Рисунок 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3. захват концентрация антител</td>
		</tr>
<tr>
<td>4. биотина: детектор антитела соотношение</td>
		</tr>
<tr>
<td>5. 2-3-шаг настройки</td>
			<td>Выберите условие с высоким соотношением сигнал: фон</td>
			<td>Рисунок 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6. детектор концентрация антител</td>
			<td rowspan="2">Выбор условий с низким предел обнаружения</td>
			<td rowspan="2">Рисунок 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>7. SBG концентрация</td>
		</tr>
<tr>
<td>8. Специфика</td>
			<td>Оценить перекрестной реактивности</td>
			<td rowspan="2">Рисунок 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9. чувствительность</td>
			<td>Оценить признание подтипы (если применимо)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10. воспроизводимость</td>
			<td>Оценка изменчивости пробирного</td>
			<td>Рисунок 5</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: резюме шаги для разработки и оптимизации одной молекулы массив пробирного. В следующей таблице перечислены различные шаги, необходимые для разработки и оптимизации анализа массива одной молекулы, от первоначального выбора пары антитела до оценки воспроизводимости.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Антиген</td>
			<td>8H 1 (A)</td>
			<td>12H 5 (B)</td>
			<td>Sifalimumab</td>
			<td>Rontalizumab</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ1</td>
			<td>28.3</td>
			<td>51,3</td>
			<td>460</td>
			<td>22.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ2</td>
			<td>2563</td>
			<td>10.7</td>
			<td>9.02</td>
			<td>2.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ4</td>
			<td>5.11</td>
			<td>2,99</td>
			<td>35.35</td>
			<td>325.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ5</td>
			<td>2.01</td>
			<td>19.6</td>
			<td>93.29</td>
			<td>2.49</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ6</td>
			<td>64,7</td>
			<td>3.03</td>
			<td>4.97</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ7</td>
			<td>0.9</td>
			<td>0,63</td>
			<td>233.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ8</td>
			<td>302</td>
			<td>0,83</td>
			<td>691</td>
			<td>10.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ10</td>
			<td>2.54</td>
			<td>0.71</td>
			<td>43,2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ14</td>
			<td>3224</td>
			<td>2.1</td>
			<td>14.52</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ16</td>
			<td>1.83</td>
			<td>32.99</td>
			<td>59.18</td>
			<td>28.65</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ17</td>
			<td>2.21</td>
			<td>0,77</td>
			<td>890.9</td>
			<td>23,86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ21</td>
			<td>2.78</td>
			<td>12.87</td>
			<td>1769</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 2: выбор антитела Pan альфа. IC50 (нг/мл) определяется с помощью элемента интерферона стимулирует реакции (ISRE)-Люцифераза нейтрализации assay. Таблица показывает значения IC50 mAbs, используемых в одной молекулы массив assay для всех подтипов ИФН α. 10 000 ГЭС 293 MSR клетки были посеяны в белая половина площадь 96-луночных пластины и реверс transfected с 50 нг смешиванием ISRE-Светлячок Люцифераза репортер и Renilla Люцифераза конструкций с помощью трансфекции реагентов в соответствии с инструкциями производителя. Выражая Люцифераза конструкции служил как элемент внутренней нормализации. Клетки инкубировали на ночь в сокращение сыворотке среднего дополнена 0,1 мм заменимые аминокислоты, пируват натрия 1 мм, 0,5% плода бычьим сывороточным при 37 ° C, 5% CO2 в атмосфере увлажненные. После ночи инкубации клетки были стимулируется за 24 ч с среднего, содержащие смеси рекомбинантного человеческого ИФН α с или без анти ИФН α mAbs или управления IgG, которые были преинкубации за 1 ч при 37 ° C. После 24 ч стимуляции двойной Люцифераза репортер анализов были исполнены в соответствии с инструкциями производителя. «-» Не определен. Sifalimumab является полностью человеком, иммуноглобулина G1 κ моноклональное антитело, которое связывается и нейтрализует большинство подтипов ИФН α; Rontalizumab это гуманизированные моноклональные антитела против ИФН α. Адаптировано из Meyer et al. 2016 и Rodero и др. 2017.
Дополнительная таблица 1: выбор ориентации антитела, захватить концентрация антитела на бусы и соотношение biotinylation. Были протестированы две различные конфигурации, с использованием анти ИФН α A как захват антитела и анти ИФН α B как обнаружение антител (A) и вице-обратно (B). IFNα - 2c был использован как антиген. Для обеих конфигураций также испытывались различные захвата концентрации антитела, а также соотношения биотина: антитела (B:A). Насыщенность (сб). Оранжевый: АЕБ значения, которые использовались для расчета LOD; Эти концентрации были рассмотрены пустых значений АЕБ, оставался стабильным. LOD была рассчитана как означает чистый + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_1.xlsx">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительная таблица 2: испытание конфигурации 3-шаг 2 против. 2 и 3 - шаг конфигурации были оценены с помощью IFNα - 2c как антиген. АЕБ также как сигнал/фон пайки (S/B) приведены значения для обоих условий. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_2.xlsx">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительная таблица 3: оптимизация концентрации детектор и SBG. Три различных концентраций биотинилированным детектор антитела (0,1, 0,3 и 0,6 мкг/мл) вместе с трех различных концентраций SBG (50, 150 и 250 м) были оценены. АЕБ значения приведены для девяти проверенных условий. Оранжевый: АЕБ значения, которые использовались для расчета LOD; Эти концентрации были рассмотрены пустых значений АЕБ, оставался стабильным. LOD была рассчитана как означает чистый + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_3.xlsx">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительная таблица 4: специфичность и чувствительность оптимизированный assay массив одной молекулы IFNα. Средняя фермента за бусы значения отображаются, когда IFN-β IFN-λ1, ИФН λ2, ИФН ω и ИФН γ рекомбинантных белков были протестированы (A), вместе с 16 подтип ИФН α (B). «-» Не определен. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_4.xlsx">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительная таблица 5: воспроизводимость оптимизированный assay массив одной молекулы IFNα. Средние значения АЕБ для всех трех независимых работает показаны к концентрации 10.000 fg/мл. «-» Не определен. Насыщенность (сб). <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_5.xlsx">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительная таблица 6: assay протеина конкуренции. Средняя фермента за бусы значения отображаются для всех условий испытания. Измерения проводились в двух экземплярах. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_6.xlsx">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃŽÂ± at JoVE.com

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Здесь мы представляем протокол для описания разработки и проверки одной молекулы массив цифровых ИФА анализа, который позволяет ультра-чувствительных обнаружение всех подтипов ИФН α в образцах.

Разработка и валидация сверхчувствительная одной молекулы массив цифровых энзим соединенный Assay иммуносорбента для человеческий интерферон α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Фермент связанных Immunospot анализ (ELISPOT): Количественная оценка Th-1 клеточного иммунного ответа против микробных антигенов

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Use of Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Использование интерферона-γ энзимных Анализ Immunospot для характеристики Роман Т-клеточных эпитопов вируса папилломы человека

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Количественные высокой пропускной Single-клеточной цитотоксичности анализа для Т-клеток

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Характеристика воспалительных реакций во время интраназальной колонизации стрептококковой пневмонией

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Визуализация взаимодействий белок-ДНК в живых бактериальных клеток с использованием отслеживания одиночных молекул фотоактивируемые

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Применение Долгосрочный культивируют Интерферон-γ фермент-связанного Immunospot анализе для оценки эффекторных и памяти T-клеточные ответы у крупного рогатого скота

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Разработка и проверка количественной ПЦР метод для Equid герпесвирусных-2 Диагностика в Респираторные жидкостям

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Создание установки с высокой пропускной способностью для скрининга малых молекул, которые модулируют с-ди-GMP Передача сигналов в<em&gt; Синегнойной</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Анализ адгезии при сдвиге стресса для изучения Т-лимфоцитами взаимодействий молекул адгезии

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Измерение гриппа нейраминидазы ингибирования Титры антител методом ферментативного лектина Пробирной

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...