Name: development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;
Uploaded: 2018-06-14T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃŽÂ± at JoVE.com

DD y YJC reconocen apoyo de la ANR (proyecto IFNX, no. CE17001002) y ImmunoQure AG para proporcionar anticuerpos monoclonales. Agradecemos a Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki y Pierre Quartier para proporcionar las muestras clínicas. YJC reconoce el Consejo Europeo de investigación (GA 309449: Beca de YJC) y un subsidio del estado a cargo de la Agencia Nacional de investigación (Francia) bajo el programa de "Inversiones para el futuro", teniendo la referencia ANR-10-IAHU-01.

<ol>
	<li>Isaacs, A., Lindenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classics+in+Oncology+Virus+Interference:+I.+The+Interferon.">Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).</li><li>Isaacs, A., Lindenmann, J., Valentine, R. C., Alerts, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pillars+Article:+Virus+Interference.+II.+Some+Properties+of+Interferon.">Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).</li><li>Hunt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombotic+Microangiopathy+Associated+with+Interferon+Beta.">Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta.</a> N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).</li><li>Hooks, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Interferon+in+the+Circulation+of+Patients+with+Autoimmune+Disease.">Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease.</a> N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).</li><li>Greenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-alpha/beta+Mediated+Innate+Immune+Mechanisms+in+Dermatomyositis.">Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis.</a> Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).</li><li>Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+interferonopathies+a+novel+set+of+inborn+errors+of+immunity.">Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).</li><li>Rodero, M. P., Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+interferon+-+mediated+monogenic+autoinflammation:+The+type+I+interferonopathies,+a+conceptual+overview.">Type I interferon - mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview.</a> J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).</li><li>Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+biological+assay+for+interferons.">A sensitive biological assay for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).</li><li>Meager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+assays+for+interferons.">Biological assays for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).</li><li>Hua, J., Kirou, K., Lee, C., Crow, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Assay+of+Type+I+Interferon+in+Systemic+Lupus+Erythematosus+Plasma+and+Association+With+Anti+-+RNA+Binding+Protein+Autoantibodies.">Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti - RNA Binding Protein Autoantibodies.</a> Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).</li><li>Niewold, T. B., Kariuki, S. N., Morgan, G. A., Shrestha, S., Pachman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+serum+interferon-alpha+activity+in+juvenile+dermatomyositis:+associations+with+disease+activity+at+diagnosis+and+after+thirty-six+months+of+therapy.">Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy.</a> Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).</li><li>Seo, Y., Kim, G., Kwak, H., Nam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+HeLa+Mx2+/+Luc+Reporter+Cell+Line+for+the+Quantification+of+Human+Type+I+Interferons.">Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons.</a> Pharmacology. 84, 135-144 (2009).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+surface+expression+of+Fc&#947;+receptor+RI+(+CD64+),+a+biomarker+reflecting+type-I+interferon+levels+in+systemic+lupus+erythematosus.">Monocyte surface expression of Fc&#947; receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).</li><li>Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Vesicular+Stomatitis+Virus+Replicon-Based+Bioassay+for+the+Rapid+and+Sensitive+Determination+of+Multi-Species+Type+I+Interferon.">A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon.</a> PLoS One. 6, e25858 (2011).</li><li>Rissin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assay+detects+serum+proteins+at+subfemtomolar+concentrations.">Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations.</a> Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).</li><li>Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+array+(Simoa)+assay+with+optimal+antibody+pairs+for+cytokine+detection+in+human+serum+samples.">Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples.</a> R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).</li><li>Simoa. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+Principle+of+SimoaTM+(Single+Molecule+Array)+Technology.">Scientific Principle of SimoaTM (Single Molecule Array) Technology.</a> Whitepaper 1.0. , 1-2 (2013).</li><li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assays+Theoretical+considerations.">Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations.</a> J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).</li><li>Yeung, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+highly+sensitive+immunoassay+technologies+for+quantitative+measurements+of+sub-pg+/+mL+levels+of+cytokines+in+human+serum.">Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum.</a> J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+measurements+of+tumor+necrosis+factor+&#945;+and+interleukin-6+in+the+plasma+of+patients+with+Crohn's+disease.">Single molecule measurements of tumor necrosis factor &#945; and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease.</a> J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).</li><li>Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Changes+of+Post-Translationally+Modified+Forms+of+CXCL10+and+Soluble+DPP4+in+HCV+Subjects+Receiving+Interferon-Free+Therapy.">Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy.</a> PLoS One. 10, e0133236 (2015).</li><li>Decalf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+DPP4+activity+in+humans+establishes+its+in+vivo+role+in+CXCL10+post-translational+modification:+prospective+placebo-controlled+clinical+studies.">Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies.</a> EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).</li><li>Rabing Brix Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+in+plasma+from+patients+with+diabetic+retinopathy+-+development+and+validation+of+digital+ELISA+by+Single+Molecule+Array+(Simoa)+technology.">Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy - development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology.</a> J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).</li><li>Disanto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+Neurofilament+Light:+A+Biomarker+of+Neuronal+Damage+in+Multiple+Sclerosis.">Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis.</a> Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+ultrasensitive+measurement+of+amyloid-+&#946;+1+-+42+peptide+in+human+plasma+with+utility+for+studies+of+Alzheimer's+disease+therapeutics.">A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- &#946; 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics.</a> Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).</li><li>Passaes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+HIV-1+p24+Assay+Detects+Single+Infected+Cells+and+Differences+in+Reservoir+Induction+by+Latency+Reversal+Agents.">Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents.</a> J. Virol. 91, e02296 (2017).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Detection+of+Bacterial+Genomic+DNA+at+Sub-Femtomolar+Concentrations+Using+Single+Molecule+Arrays.">Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays.</a> Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).</li><li>Cohen, L., Hartman, M. R., Amardey-wellington, A., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+direct+detection+of+microRNAs+using+single+molecule+arrays.">Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays.</a> Nucleic Acids Res. 45, e137 (2017).</li><li>Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AIRE-Deficient+Patients+Harbor+Unique+High-Affinity+Disease-Ameliorating+Autoantibodies.">AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies.</a> Cell. 166, 582-595 (2016).</li><li>Simoa. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homebrew+Assay+Development+Guide.">Homebrew Assay Development Guide.</a> Simoa HD-1 Analyzer &amp; Quanterix SR-X. User-0021 08. , (2017).</li><li>Rodero, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+interferon+alpha+protein+reveals+differential+levels+and+cellular+sources+in+disease.">Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease.</a> J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).</li><li>Pleil, J., Angrish, M., Madden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemistry+for+high-throughput+screening+of+human+exhaled+breath+condensate+(EBC)+media+implementation+of+automated+Quanterix+SIMOA+instrumentation.">Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation.</a> J. Breath Res. 9, 047108 (2015).</li><li>Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Proteomic+Strategy+for+Clinical+Biomarker+Discovery.">Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery.</a> Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).</li><li>Wilson, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Simoa+HD-1+Analyzer:+A+Novel+Fully+Automated+Digital+Immunoassay+Analyzer+with+Single-Molecule+Sensitivity+and+Multiplexing.">The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing.</a> J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).</li><li>Rivnak, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully-automated,+six-plex+single+molecule+immunoassay+for+measuring+cytokines+in+blood.">A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood.</a> J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).</li><li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Plasma+Proteome.+History,+character,+and+diagnostic+prospects.">The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).</li><li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISA+in+the+multiplex+era:+Potentials+and+pitfalls.">ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls.</a> Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Adjunto, describimos el desarrollo y validación de un sola molécula altamente reproducible, ultrasensible matriz digital ELISA para la cuantificación directa de la proteína IFN-α en muestras humanas (pasos resumidos en la tabla 1). Uno de los pasos más críticos en el desarrollo del ensayo es la elección del anticuerpo par16, con las características en cuanto a la cinética y del epítopo vinculante siendo clave para un análisis acertado. Es importante evitar el uso de anticuerpos monoclonales apareados que destino el mismo epitopo o que causan impedimento estérico. Anticuerpos policlonales podrían utilizarse como anticuerpos de detección para superar tales limitaciones. Si en cualquier etapa dada la sensibilidad deseada no se logra, más posibilidades de optimización se deben considerar. Esto puede incluir el uso de pares de anticuerpos alternativos, cambios en parámetros como el tipo de proteína (por ejemplo, BSA < caseína), pH (6.0-8.5), fuerza iónica, capacidad tampón (por ejemplo, concentraciones de NaCl y fosfato), granos del portador, o la presencia de tensioactivos. Una amplia gama de parámetros con optimizarse en el desarrollo de un análisis de matriz de molécula única. Sin embargo, en general, condiciones que le dan proporciones de alta señal: fondo y LODs mínima son los preferidos (ver figura 1, figura 2y figura 3).
En cuanto a la especificidad, el ensayo del IFN-α demostraron ninguna reactividad cruzada para cualquier otros IFN probado (β, γ, λ1, λ2, ω) (figura 4a) y fue capaz de detectar los 13 subtipos de IFN-α (Figura 4b). Sin embargo, el ensayo demostró una menor afinidad por el subtipo de IFN α2, (Figura 4b y complementario tabla 4). Curiosamente, diferentes sensibilidades de las diferentes clases de IFN-α2 (a, b, c) también observaron, que puede ser debido a procesos de fabricación diferentes o secuencias de aminoácidos diferentes, como los subtipos de IFN α2 se obtuvieron de diferentes comerciales proveedores. Con esta sola excepción, todas las especies de IFN-α dieron respuestas muy similares. La especificidad de la prueba quedó demostrada además por tratamiento previo de las muestras con anti-IFN-α un clon, que derogó la señal (figura 6 y cuadro complementario 6).
Una de las principales ventajas de esta tecnología es que cualquier analito de interés puede ser potencialmente objetivo16. Además, pueden analizarse diferentes especímenes biológicos, tales como suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, Lisados celulares, cultura sobrenadantes31 y respiración hasta32. Generalmente, se realiza una dilución de 1:3 de plasma para evitar la obstrucción potencial del analizador array sola molécula. Sin embargo, el analito de interés puede estar presente en muy bajas concentraciones en la muestra biológica relevante y concentraciones más altas de la muestra podrían ser necesario (dependiendo de la sensibilidad del ensayo)33. Aunque existe la posibilidad de multiplexación manteniendo buena sensibilidad34, es un proceso más difícil y ensayos para la medición de más de 6 proteínas dentro de los experimentos mismos tienen todavía ser desarrollado35.
La capacidad de detección y cuantificación de citoquinas y otras proteínas biológicas pertinentes en tales concentraciones bajas se abre toda una nueva gama de aplicaciones33,36. Es bien sabido que numerosas proteínas ejercen sus efectos incluso en concentraciones muy bajas, que hasta ahora estaban por debajo del límite de detección de los ELISA mejor37. Mientras que otras tecnologías de inmunoensayo ofrecen ventajas sobre los convencionales ELISA19, demostramos aquí que a la sola molécula matriz digital es una plataforma robusta y reproducible para la detección ultrasensible de baja concentración de citoquinas en muestras humanas. Esta tecnología ofrece gran potencial para el descubrimiento de biomarcadores y mejor manejo de pacientes de una amplia gama de enfermedades.

Tipo I IFNs son una familia de citoquinas que juegan un papel central en la orquestación de la respuesta inmune antiviral. Fueron primero descubiertos por Isaacs y Lindenmann 60 años1,2 y que ahora se conoce que esta heterogénea familia de polipéptidos cuenta con 14 diferentes subclases (13 subtipos de IFN-α y IFN-1 β). Tipo I IFNs son esenciales para la separación de las infecciones virales, pero también han sido implicados en la patología de una variedad de Estados de enfermedad humana, incluyendo las enfermedades autoinmunes lupus eritematoso sistémico (les), dermatomyositis juvenil (JDM), y el tipo Me interferonopathies en el tipo constitutivo que IFN-inducido señalización resultados en patología3,4,5,6,7.
Estudiando la proteína IFN de tipo I niveles en muestras biológicas ha sido difícil desde su identificación inicial como una "injerencia en sustancia"1,2. En la actualidad, sándwich de ensayo genitals del ImmunoSorbent (ELISA) es el método más ampliamente utilizado para la detección de la proteína IFN-α. A pesar de ser específico, simple y rápido, tipo I IFN ELISA presentan limitaciones importantes, tales como limitada sensibilidad. Además, la medida de todos los subtipos de IFN-α requiere el uso de múltiples ensayos con su propia sensibilidad y capacidad de detección. Si bien hay ELISAs comerciales que detectan diferentes subtipos de IFN-α, su sensibilidad es limitada (1.95 pg/mL, 12,5 pg/mL y 12,5 pg/mL, respectivamente) que a menudo es insuficiente para detectar la proteína IFN-α en muestras biológicas. Para superar esta limitación, varios proxy biológica se han desarrollado ensayos para cuantificar tipo I IFN por medir la expresión génica inducida o actividad funcional8,9,10,11, 12 , 13 , 14. sin embargo, estos ensayos no proporcionan una medida directa de la proteína IFN-α.
En este estudio, a la sola molécula matriz digital ELISA tecnología se utilizó para desarrollar un análisis para la detección de moléculas individuales de proteínas IFN-α. ELISA digital utiliza la misma química básica como ELISA convencional, sin embargo, la reacción ocurre en arreglos de discos que comprende1646 femtoliter tamaño de la pozos de la individual 50.000 de la15,. Las moléculas de proteína solo son capturadas por perlas paramagnéticas recubiertas de anticuerpo y marcadas con un anticuerpo de detección biotinilado, seguido por Unión de una enzima conjugado, estreptavidina-β-galactosidasa (SBG). Posteriormente, los granos se suspenden con un sustrato de enzima fluorógenos, resorufin-β-D-galactopiranosida (RGP), en arreglos de discos de una sola molécula. Disminuyendo el volumen se logra la reacción de 2 mil millones de veces17, una alta concentración local de la señal fluorescente y cuentas sola molécula ser factibles, ya que cada molécula genera una señal de que ahora puede ser confiablemente medición18. En esencia las matrices sola molécula son capaces de contar solo immunocomplexes y determinar un promedio de enzimas por grano (AEB). Contando los pocillos en los que se detecta una señal permite cuantificación/digitalización de moléculas de proteína, ya que existe una correlación directa entre la concentración de la proteína y la relación entre granos de immunocomplexed y un número total de granos presentes en las cámaras de tamaño femtoliter.
Yeung et al. realizó un estudio de evaluación de plataforma cruzada extensa con nueve diferentes tecnologías y cuatro inmunoensayos de la citoquina con el objetivo de comparar análisis precisión, sensibilidad y correlación de datos entre diferentes plataformas19. Uno de los hallazgos claves del estudio fue que sola molécula matrices y sola molécula contando inmunoensayo presentaron la más alta sensibilidad para la detección de citocinas en suero humano dentro de la gama de concentración sub-pg/mL. Sola molécula matriz digital ELISA citocinas los ensayos se han utilizado para estudiar el papel de TNF-α e IL-6 en el Crohn enfermedad20, IFN-α en interferonopathy y autoinmunes pacientes 7, y los diferentes postraduccional modificación formas del C-X-C motivo chemokine 10 (CXCL10) en la hepatitis crónica y en donantes sanos recibiendo sitagliptina21,22. Otras aplicaciones incluyen la medición de la rodopsina en pacientes con retinopatía diabética23; el estudio de patologías del cerebro a través de las mediciones de suero o plasma del neurofilament luz24 y β amiloide 1-42 péptido25, en el contexto de la esclerosis múltiple y enfermedad de Alzheimer, respectivamente. Sola molécula matriz ensayos también pueden utilizarse para detección de patógenos mejoradas tales como caracterización del reservorio viral VIH26y también para la detección de ADN27 y micro RNAs28. Una gran ventaja de la tecnología de matriz de molécula única es esta gran versatilidad, como un ensayo contra cualquier analito de interés se puede desarrollar si se dispone de un par de anticuerpos específicos. Además, kits de ensayo de homebrew están disponibles comercialmente, permitiendo el desarrollo de nuevos ensayos, el protocolo que se detalla en el formulario modificado.
Aquí, una descripción detallada de los pasos de desarrollo y validación de un ensayo de arreglo sola molécula se presenta que resulta en mayor sensibilidad para la detección de la proteína IFN-α. Anticuerpos contra la molécula única matriz ensayos debe ser altamente específico, evitando reactividad cruzada con proteínas relacionadas (con especificidad de especie considerada si es relevante). Idealmente, deben elegirse de anticuerpos con una KD menor que 10-9 M; alta afinidad asegura atascamiento fuerte, con la producción de una señal mayor. La cinética de la Unión antígeno-anticuerpo son también importantes y rápida Ken y K lentoapagado favorecerá Asamblea complejo antígeno-anticuerpo. A partir de un par de anticuerpo que tiene un buen rendimiento en ELISA clásica, con un límite de detección (LOD) de 1-100 pg/mL, aumenta las posibilidades de obtener un análisis de matriz muy sensible a la sola molécula. Chang y sus colegas realizaron estudios cinéticos detallados de las interacciones biomoleculares que ocurren en cada paso, proponiendo un conjunto de ecuaciones para predecir la sensibilidad analítica18. Demostraron esa matriz sola molécula ELISA digital parece ser eficaz en una amplia gama de afinidades de anticuerpo (KD ~ 10−11 - 10−9 M), así como la generación de esa señal es más dependiente de la tasa de estos anticuerpos.
Para utilizar afinidad alta tomamos ventaja de los anticuerpos aislados de pacientes con el síndrome polyendocrinopathy autoinmune los anticuerpos tipo distrofia polyendocrinopathy-candidiasis-ectodérmica autoinmune 1 (APS1/APECED)29. Por razones que todavía no se entienden, la gran mayoría de las personas deficientes en AIRE desarrolla un conjunto básico de anticuerpos de alta avidez contra todos los subtipos de IFN-α29, y se seleccionaron dos clones de anticuerpos anti-IFN-α de las afinidades de enlace complementario para los diferentes subtipos de IFN-α, según la estimación de valores de IC50 . La combinación de estos anticuerpos de alta afinidad únicas con tecnología de matriz de molécula única permitió la cuantificación directa de IFN-α en las concentraciones de attomolar (fg/mL). Tal detección ultrasensible de la proteína IFN-α contribuye a una mejor comprensión de la naturaleza, la regulación y el impacto biológico de la respuesta de IFN-inducido en entornos diferentes de la enfermedad.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody A (8H1 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody B (12H5 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody EBI-1 clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody BMS216BK clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216BK</td>
			<td>Not an ELISA kit but bulk abs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2c</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS305</td>
			<td>OK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;I (17)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2b</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;1</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11175-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4a (M1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4b (a4)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11180-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;B2 (a8)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11115-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;C (a10)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;D (a1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11125-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;G (a5)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11135-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;F (a21)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11130-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;H2 (a14)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;J1 (a7)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11160-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;K (a6)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11165-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;WA (a16)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11190-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#969;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#946;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; ELISA</td>
			<td>PBL</td>
			<td>41115.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISRE-Reporter</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>CCS-008L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fu-GENE HD Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Mediuem</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40 Substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer NanoDrop 1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtres</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC505096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Conjugation Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Encoded Paramagnetic Beads</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Wash Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11844071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Blocking Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Diluent Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector and Sample Diluent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylation Reaction Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11891195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>MS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa) reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBG, Bead and Detector Barcode Labels</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Reagent Bottles</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa specimen 96-well plates</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Discs</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa 2.0 conductive Tips</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Cuvettes</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa SBG Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa RGP Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 1</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 2</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing Oil</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa HD-1 Analyzer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa)</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems</td>
			<td>Singluex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;

El objetivo principal de este protocolo es describir el desarrollo y validación de interferón (IFN)-ensayo de ensayo genitals del ImmunoSorbent (ELISA) digital de matriz α sola molécula. Este sistema permite la cuantificación de la proteína IFN-α humana con sensibilidad sin precedentes y con ninguna reactividad cruzada para otras especies de IFN.
El primer paso clave del protocolo es la elección de la pareja de anticuerpo, seguida por la conjugación del anticuerpo de captura de bolas paramagnéticas y biotinylation del anticuerpo de detección. Tras este paso, diferentes parámetros tales como la configuración de análisis, concentración de anticuerpo detector y tampón composición pueden modificarse hasta logra una sensibilidad óptima. Por último, especificidad y reproducibilidad del método son evaluados para asegurar la confianza en los resultados. Aquí, hemos desarrollado un ensayo de arreglo sola molécula de IFN-α con un límite de detección de fg/mL 0,69 con autoanticuerpos de alta afinidad aislados de pacientes con mutaciones biallelic en la proteína del regulador autoinmune (AIRE) provocando polyendocrinopathy autoinmune síndrome tipo 1 autoinmune distrofia polyendocrinopathy-candidiasis-ectodérmica (APS1/APECED). Lo importante, estos anticuerpos permitieron la detección de los 13 subtipos de IFN-α.
Esta nueva metodología permite la detección y cuantificación de la proteína IFN-α en muestras biológicas humanas a concentraciones de attomolar por primera vez. Esta herramienta será muy útil en el seguimiento de los niveles de esta citoquina en la salud y la enfermedad, la mayoría especialmente infección, autoinmunidad y autoinflammation.

En Resumen, un análisis de matriz de molécula única pan-IFN-α con un límite de detección de 0.69 fg/mL, con una configuración de 2 pasos de captura cuentas recubierta de 0,3 mg/mL de anti-IFN-α un anticuerpo y anti-IFN-α B detección anticuerpo biotinilado en una proporción de biotina: anticuerpo de 30 fue desarrollado. Las concentraciones para anticuerpo de detección biotinilado y SBG fueron 0.3 μg/mL y 150 pM, respectivamente. Este ensayo altamente específico es capaz de detectar todos los 13 subtipos de IFN-α y Cruz no reacciona con otro tipo de IFN. Así, si bien no es posible identificar y cuantificar cada especie individual de IFN-α, todos ellos pueden ser detectadas y medición da un valor total de la concentración de IFN-α, que comprende las subclases diferentes 13.
Para explorar el posible valor diagnóstico de este nuevo ensayo, la proteína IFN-α en plasma y el suero de individuos sanos se midieron y compararon con muestras de pacientes con SLE y JDM. Como se ilustra en la figura 7, se detectaron altos niveles de la proteína IFN-α en ambas cohortes de enfermedad en comparación con controles sanos. La línea punteada indica el LDD de un convencional ELISA disponible comercialmente, que ilustran cómo este enfoque no detectaría la proteína IFN-α en estos grupos de pacientes a pesar de las asociaciones conocidas de esta citoquina con estos fenotipos. Además, IFN-α podría cuantificarse en 5 registros de magnitud, que ilustran el amplio rango dinámico del ensayo, con niveles detectables entre 1-10 fg/mL confirma el carácter altamente sensible de la prueba.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57421/57421fig7.jpg"> Figura 7: cuantificación de la proteína IFN-α en plasma y suero de paciente cohortes. Esta figura ha sido modificada de Rodero et al. 2017. plasma de controles sanos (n = 20) y pacientes que sufren de SLE (n = 72) y JDM (n = 43) se probaron en el ensayo de matriz pan-IFNα sola molécula. Análisis se realizan mediante la prueba ANOVA unidireccional (Kruskal-Wallis) y Dunn comparación entre grupos. Se representa la mediana. Línea punteada indica LOD de un referencia humana ELISA de anti-IFN-α (pg/mL 1.95 = 1950 fg/mL). <a href="/files/ftp_upload/57421/57421fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Paso</td>
			<td>Consideraciones</td>
			<td>Referencia</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1. elección de pareja anticuerpo</td>
			<td>Objetivo diferentes epítopes</td>
			<td rowspan="3">Tabla 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alta afinidad</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rápido Ken / lento Kapagado
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2. orientación del par de anticuerpos</td>
			<td rowspan="3">Elegir las condiciones con el más bajo límite de detección</td>
			<td rowspan="3">Figura 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3. concentración de anticuerpo de captura</td>
		</tr>
<tr>
<td>4. proporción de anticuerpos biotina: Detector</td>
		</tr>
<tr>
<td>5. 2 vs. configuración de 3 pasos</td>
			<td>Escoger la condición con el cociente más alto de la señal: fondo</td>
			<td>Figura 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6. concentración de anticuerpo detector</td>
			<td rowspan="2">Elegir las condiciones con el más bajo límite de detección</td>
			<td rowspan="2">Figura 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>7. concentración SBG</td>
		</tr>
<tr>
<td>8. especificidad</td>
			<td>Evaluar reactividad cruzada</td>
			<td rowspan="2">Figura 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9. sensibilidad</td>
			<td>Evaluar el reconocimiento de subtipos (si corresponde)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10. reproducibilidad</td>
			<td>Evaluar la variabilidad del ensayo</td>
			<td>Figura 5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Resumen de pasos para el desarrollo y optimización de un análisis de la matriz de la sola molécula. Esta tabla resume los diferentes pasos necesarios para el desarrollo y optimización de un análisis de matriz de molécula única, de la elección inicial del par de anticuerpos hasta la evaluación de la reproducibilidad.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antígeno de</td>
			<td>8H 1 (A)</td>
			<td>12H 5 (B)</td>
			<td>Sifalimumab</td>
			<td>Rontalizumab</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ1</td>
			<td>28.3</td>
			<td>51,3</td>
			<td>460</td>
			<td>22.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ2</td>
			<td>2563</td>
			<td>10.7</td>
			<td>9.02</td>
			<td>2.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ4</td>
			<td>5.11</td>
			<td>2.99</td>
			<td>35.35</td>
			<td>325.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ5</td>
			<td>2.01</td>
			<td>19.6</td>
			<td>93.29</td>
			<td>2.49</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ6</td>
			<td>64.7</td>
			<td>3.03</td>
			<td>4.97</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ7</td>
			<td>0,9</td>
			<td>0,63</td>
			<td>233.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ8</td>
			<td>302</td>
			<td>0,83</td>
			<td>691</td>
			<td>10.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ10</td>
			<td>2.54</td>
			<td>0.71</td>
			<td>43.2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ14</td>
			<td>3224</td>
			<td>2.1</td>
			<td>14.52</td>
			<td>0,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ16</td>
			<td>1,83</td>
			<td>32.99</td>
			<td>59.18</td>
			<td>28.65</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ17</td>
			<td>2.21</td>
			<td>0.77</td>
			<td>890.9</td>
			<td>23.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ21</td>
			<td>2.78</td>
			<td>12.87</td>
			<td>1769</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: selección de anticuerpos alfa Pan. IC50 (ng/mL) determinada mediante el elemento de respuesta interferón-estimulantes (ISRE)-ensayo de neutralización de luciferasa. Tabla muestra valores de IC50 de mAbs utilizados en análisis de matriz de molécula única para todos los subtipos de IFN-α. 10.000 células de HEK 293 MSR fueron sembradas en placas de 96 pocillos de área mitad blanco y reverso-transfected con 50 ng premezclado ISRE-Firefly luciferase reporter y construcciones de luciferasa Renilla transfección reactivos según las instrucciones del fabricante. La construcción de expresión de luciferasa sirve como control interno de la normalización. Las células fueron incubadas durante la noche en reducido suero suplementado con aminoácidos no esenciales de 0,1 mM, piruvato de sodio 1 mM, 0,5% de suero fetal bovino a 37 ° C, 5% CO2 en un ambiente humidificado. Después de la incubación durante la noche, las células fueron estimuladas por 24 h con medio que contiene mezclas de recombinante humano IFN-α con o sin mAbs anti-IFN-α o control IgG que había se incuba durante 1 h a 37 ° C. Después de 24 h de estimulación, dual luciferase reporter ensayos fueron realizados según las instrucciones del fabricante. «-» No determinado. Sifalimumab es un humano, inmunoglobulina G1 κ anticuerpo monoclonal que se une y neutraliza la mayoría de los subtipos de IFN-α; Rontalizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado contra IFN-α. Adaptado de Meyer et al. 2016 y Rodero et al. 2017.
Complementario tabla 1: selección de la orientación del anticuerpo, captura la concentración de anticuerpos en los granos y el cociente de Biotinilación. Las dos posibles configuraciones diferentes fueron probadas, con el anti-IFN-α como anticuerpo de captura y B anti-IFN-α como detección anticuerpo (A) y vice versa (B). IFNα - 2C se utilizó como antígeno. Las concentraciones de anticuerpo de captura diferentes así como ratios de biotina: anticuerpo (B:A) también fueron probadas para ambas configuraciones. Saturación (Sat). Naranja: Valores AEB que se utilizaron para el cálculo de LOD; Estas concentraciones eran consideradas en blanco como los AEB valores permanecidos constantes. LOD se calculó como la media en blanco + 3de. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_1.xlsx">haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Adicional cuadro 2: prueba de configuración de 3 pasos de 2 vs. Las configuraciones de paso 2 y 3 - se evaluaron con IFNα - 2c como antígeno. AEB valores así como señal/fondo raciones (SG) se muestran para ambas condiciones. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_2.xlsx">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Adicional cuadro 3: optimización de concentración Detector y SBG. Tres diferentes concentraciones de anticuerpo detector de biotinilado (0.1, 0.3 y 0.6 μg/mL) junto con tres diferentes concentraciones de SBG (50, 150 y 250 pM) fueron evaluados. AEB valores se muestran para las nueve condiciones de prueba. Naranja: Valores AEB que se utilizaron para el cálculo de LOD; Estas concentraciones eran consideradas en blanco como los AEB valores permanecidos constantes. LOD se calculó como la media en blanco + 3de. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_3.xlsx">haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Adicional cuadro 4: especificidad y sensibilidad de la prueba de conjunto optimizada de IFNα sola molécula. Enzima promedio por valores de granos aparecen cuando IFN-β, IFN-λ1, λ2 IFN, IFN-ω y IFN-γ proteínas recombinantes fueron probaron (A), junto con los 16 subtipos de IFN-α (B). «-» No determinado. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_4.xlsx">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Adicional cuadro 5: reproducibilidad del optimizado IFNα sola molécula matriz análisis. Se muestran los valores promedio de la AEB para todos tres carreras independientes a una concentración de 10.000 fg/mL. «-» No determinado. Saturación (Sat). <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_5.xlsx">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Complementario tabla 6: Análisis de proteína competencia. Enzima promedio por cuentas de valores se muestran para todas las condiciones probadas. Las mediciones se realizaron por duplicado. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_6.xlsx">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃŽÂ± at JoVE.com

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Aquí presentamos un protocolo para describir el desarrollo y validación de un sola molécula matriz digital ensayo ELISA, que permite la detección ultrasensible de todos los subtipos de IFN-α en muestras humanas.

Desarrollo y validación de una sola molécula ultrasensible matriz Digital análisis de enzima-ligado del inmunosorbente para interferón-α humano

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzima-inmunoensayo de ensayo (ELISPOT): La cuantificación de la Th-1 respuesta inmune celular contra antígenos microbianos

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Investigación

Inmunología e Infección

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Use of Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

El uso de interferón-γ enzimo-inmunoensayo para la Caracterización de Nuevos epítopos de células T del virus del papiloma humano

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Caracterización De Las Respuestas Inflamatorias Durante La Colonización Intranasal Con Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Visualización de la proteína-DNA en células bacterianas en directo mediante fotoactivado Tracking Single-molécula

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Aplicación de Ensayo inmunoensayo de largo plazo culta Interferón-γ ligado a enzimas para la evaluación efectoras y de memoria T respuestas celulares en el ganado

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Desarrollo y validación de un método de PCR cuantitativa para Equid herpesvirus-2 Diagnóstico en los flujos respiratorios

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establecimiento de un programa de instalación de alto rendimiento para la detección de pequeñas moléculas que modulan la c-di-GMP Señalización en el<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Ensayo de adhesión en condiciones de estrés de cizalla para el Estudio de linfocitos T-molécula de adhesión Interacciones

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

La medición de la influenza neuraminidasa inhibición títulos de anticuerpos mediante un ensayo de lectina ligado a enzimas

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...