Name: development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;
Uploaded: 2018-06-14T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃŽÂ± at JoVE.com

DD och YJC erkänner stöd från ANR (projekt IFNX, ingen. CE17001002) och ImmunoQure AG för att tillhandahålla monoklonala antikroppar. Vi tackar Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki och Pierre Quartier för att tillhandahålla kliniska prover. YJC erkänner Europeiska forskningsrådet (GA 309449: gemenskap till YJC), och ett statsbidrag som förvaltas av National Research Agency (Frankrike) enligt programmet ”investeringar för framtiden” med referensnummer ANR-10-IAHU-01.

<ol>
	<li>Isaacs, A., Lindenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classics+in+Oncology+Virus+Interference:+I.+The+Interferon.">Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).</li><li>Isaacs, A., Lindenmann, J., Valentine, R. C., Alerts, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pillars+Article:+Virus+Interference.+II.+Some+Properties+of+Interferon.">Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).</li><li>Hunt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombotic+Microangiopathy+Associated+with+Interferon+Beta.">Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta.</a> N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).</li><li>Hooks, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Interferon+in+the+Circulation+of+Patients+with+Autoimmune+Disease.">Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease.</a> N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).</li><li>Greenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-alpha/beta+Mediated+Innate+Immune+Mechanisms+in+Dermatomyositis.">Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis.</a> Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).</li><li>Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+interferonopathies+a+novel+set+of+inborn+errors+of+immunity.">Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).</li><li>Rodero, M. P., Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+interferon+-+mediated+monogenic+autoinflammation:+The+type+I+interferonopathies,+a+conceptual+overview.">Type I interferon - mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview.</a> J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).</li><li>Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+biological+assay+for+interferons.">A sensitive biological assay for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).</li><li>Meager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+assays+for+interferons.">Biological assays for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).</li><li>Hua, J., Kirou, K., Lee, C., Crow, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Assay+of+Type+I+Interferon+in+Systemic+Lupus+Erythematosus+Plasma+and+Association+With+Anti+-+RNA+Binding+Protein+Autoantibodies.">Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti - RNA Binding Protein Autoantibodies.</a> Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).</li><li>Niewold, T. B., Kariuki, S. N., Morgan, G. A., Shrestha, S., Pachman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+serum+interferon-alpha+activity+in+juvenile+dermatomyositis:+associations+with+disease+activity+at+diagnosis+and+after+thirty-six+months+of+therapy.">Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy.</a> Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).</li><li>Seo, Y., Kim, G., Kwak, H., Nam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+HeLa+Mx2+/+Luc+Reporter+Cell+Line+for+the+Quantification+of+Human+Type+I+Interferons.">Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons.</a> Pharmacology. 84, 135-144 (2009).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+surface+expression+of+Fc&#947;+receptor+RI+(+CD64+),+a+biomarker+reflecting+type-I+interferon+levels+in+systemic+lupus+erythematosus.">Monocyte surface expression of Fc&#947; receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).</li><li>Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Vesicular+Stomatitis+Virus+Replicon-Based+Bioassay+for+the+Rapid+and+Sensitive+Determination+of+Multi-Species+Type+I+Interferon.">A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon.</a> PLoS One. 6, e25858 (2011).</li><li>Rissin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assay+detects+serum+proteins+at+subfemtomolar+concentrations.">Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations.</a> Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).</li><li>Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+array+(Simoa)+assay+with+optimal+antibody+pairs+for+cytokine+detection+in+human+serum+samples.">Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples.</a> R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).</li><li>Simoa. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+Principle+of+SimoaTM+(Single+Molecule+Array)+Technology.">Scientific Principle of SimoaTM (Single Molecule Array) Technology.</a> Whitepaper 1.0. , 1-2 (2013).</li><li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assays+Theoretical+considerations.">Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations.</a> J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).</li><li>Yeung, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+highly+sensitive+immunoassay+technologies+for+quantitative+measurements+of+sub-pg+/+mL+levels+of+cytokines+in+human+serum.">Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum.</a> J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+measurements+of+tumor+necrosis+factor+&#945;+and+interleukin-6+in+the+plasma+of+patients+with+Crohn's+disease.">Single molecule measurements of tumor necrosis factor &#945; and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease.</a> J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).</li><li>Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Changes+of+Post-Translationally+Modified+Forms+of+CXCL10+and+Soluble+DPP4+in+HCV+Subjects+Receiving+Interferon-Free+Therapy.">Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy.</a> PLoS One. 10, e0133236 (2015).</li><li>Decalf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+DPP4+activity+in+humans+establishes+its+in+vivo+role+in+CXCL10+post-translational+modification:+prospective+placebo-controlled+clinical+studies.">Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies.</a> EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).</li><li>Rabing Brix Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+in+plasma+from+patients+with+diabetic+retinopathy+-+development+and+validation+of+digital+ELISA+by+Single+Molecule+Array+(Simoa)+technology.">Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy - development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology.</a> J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).</li><li>Disanto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+Neurofilament+Light:+A+Biomarker+of+Neuronal+Damage+in+Multiple+Sclerosis.">Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis.</a> Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+ultrasensitive+measurement+of+amyloid-+&#946;+1+-+42+peptide+in+human+plasma+with+utility+for+studies+of+Alzheimer's+disease+therapeutics.">A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- &#946; 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics.</a> Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).</li><li>Passaes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+HIV-1+p24+Assay+Detects+Single+Infected+Cells+and+Differences+in+Reservoir+Induction+by+Latency+Reversal+Agents.">Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents.</a> J. Virol. 91, e02296 (2017).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Detection+of+Bacterial+Genomic+DNA+at+Sub-Femtomolar+Concentrations+Using+Single+Molecule+Arrays.">Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays.</a> Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).</li><li>Cohen, L., Hartman, M. R., Amardey-wellington, A., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+direct+detection+of+microRNAs+using+single+molecule+arrays.">Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays.</a> Nucleic Acids Res. 45, e137 (2017).</li><li>Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AIRE-Deficient+Patients+Harbor+Unique+High-Affinity+Disease-Ameliorating+Autoantibodies.">AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies.</a> Cell. 166, 582-595 (2016).</li><li>Simoa. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homebrew+Assay+Development+Guide.">Homebrew Assay Development Guide.</a> Simoa HD-1 Analyzer &amp; Quanterix SR-X. User-0021 08. , (2017).</li><li>Rodero, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+interferon+alpha+protein+reveals+differential+levels+and+cellular+sources+in+disease.">Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease.</a> J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).</li><li>Pleil, J., Angrish, M., Madden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemistry+for+high-throughput+screening+of+human+exhaled+breath+condensate+(EBC)+media+implementation+of+automated+Quanterix+SIMOA+instrumentation.">Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation.</a> J. Breath Res. 9, 047108 (2015).</li><li>Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Proteomic+Strategy+for+Clinical+Biomarker+Discovery.">Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery.</a> Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).</li><li>Wilson, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Simoa+HD-1+Analyzer:+A+Novel+Fully+Automated+Digital+Immunoassay+Analyzer+with+Single-Molecule+Sensitivity+and+Multiplexing.">The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing.</a> J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).</li><li>Rivnak, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully-automated,+six-plex+single+molecule+immunoassay+for+measuring+cytokines+in+blood.">A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood.</a> J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).</li><li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Plasma+Proteome.+History,+character,+and+diagnostic+prospects.">The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).</li><li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISA+in+the+multiplex+era:+Potentials+and+pitfalls.">ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls.</a> Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Vi beskrivs häri, utveckling och validering av en mycket reproducerbara, ultrasensitive enda molekyl array digital ELISA för direkt kvantifiering av IFN-α protein i mänskliga prover (steg sammanfattas i tabell 1). En av de viktigaste stegen i utvecklingen av analysen är valet av antikropp par16, med egenskaper när det gäller kinetik och epitop bindande nyckeln till en framgångsrik analys. Det är viktigt att undvika användning av Parade monoklonala antikroppar som riktar den samma epitop eller som orsaka sterisk hinder. Polyklonala antikroppar kan användas som identifiering antikroppar för att övervinna sådana begränsningar. Vid varje given steg uppnås inte önskad känslighet, bör ytterligare optimeringsmöjligheter övervägas. Detta kan inkludera användning av alternativa antikropp par, förändringar i parametrar såsom protein typ (t.ex. BSA < kasein), pH (6.0-8,5), jonstyrka, buffertkapacitet (e.g. NaCl och fosfat koncentrationer), bärare pärlor eller förekomsten av tensider. Ett brett utbud av parametrar optimeras con när du utvecklar en enda molekyl array analys. Dock sammantaget förhållanden som ger hög signal: bakgrunden nyckeltal och minimal LODs är de program (se figur 1, figur 2och figur 3).
När det gäller specificitet, IFN-α analysen visade ingen arg reactivity för eventuella andra behandlats testade (β, γ, λ1, λ2, ω) (figur 4a) och var i stånd att upptäcka alla 13 IFN-α subtyper (figur 4b). Analysen visade dock en lägre affinitet för IFN-α2 subtyp, (figur 4b och kompletterande Tabell4). Intressant, observerades olika känslighet för olika klasser av IFN-α2 (a, b, c) också, vilket kan bero på olika framställningsmetoder eller olika aminosyresekvenser, som de IFN-α2 subtyperna erhölls från olika kommersiella leverantörer. Med detta som enda undantag gav alla IFN-α arter mycket liknande svar. Analysens specificitet visades ytterligare av förbehandling av prov med den mot IFN-α en klon, som upphävts signalen (figur 6 och kompletterande Tabell6).
En av de främsta fördelarna med denna teknik är att någon analyt sevärdheter kan potentiellt riktade16. Dessutom kan olika biologiska prov testas, som serum, plasma, cerebrospinalvätska, cellulär lysates, kultur supernatanterna31 och även andetag32. Vanligtvis, utförs en 1:3 utspädning av plasma för att undvika potentiella igensättning av den enda molekyl array analyzer. Dock analyten av intresse kunde närvara vid mycket låga koncentrationer i de relevanta biologiska provet och högre koncentrationer av prov kan vara obligatoriska (beroende på analysens känslighet)33. Även om det finns potential för multiplexing bibehållen bra känslighet34, är det en mer utmanande process och analyser för att mäta större än 6 proteiner inom samma experimenten har ändå till vara framkallade35.
Förmågan att upptäcka och kvantifiera cytokiner och andra biologiska relevanta proteiner vid sådana låga koncentrationer öppnar upp en helt ny rad applikationer33,36. Det är väl känt att många proteiner utövar sina effekter även vid mycket låga koncentrationer, som hittills låg under detektionsgränsen för de bästa ELISAs37. Medan andra immunoassay tekniker erbjuder fördelar jämfört med konventionella ELISA19, visar vi här att enda molekyl array digital ELISA är en reproducerbar och robust plattform för ultrasensitive upptäckt av låg koncentration cytokiner i mänskliga prover. Denna teknik erbjuder enorma möjligheter för biomarkör identifiering och förbättrade patientens hantering av ett brett spektrum av sjukdomar.

Typ jag behandlats är en familj av cytokiner som spelar en central roll i iscensättandet antivirala immunsvar. De upptäcktes först av Isaacs och Lindenmann 60 år sedan1,2 och det är nu känt att denna heterogen familj av polypeptider består av 14 olika underklasser (13 IFN-α subtyper och 1 IFN-β). Typ jag behandlats är väsentliga för clearance av virusinfektioner, men har också varit inblandade i en mängd mänskliga sjukdomstillstånd, inklusive autoimmuna sjukdomar systemisk lupus erythematosus (SLE), juvenil dermatomyosit (JDM), patologi och typ Jag interferonopathies i vilken konstituerande typen IFN-inducerad signalering resultaten i patologi3,4,5,6,7.
Studera typ I IFN protein nivåer i biologiska prover har varit utmanande sedan dess inledande identifiering som en ”störande ämne”1,2. Sandwich enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) är för närvarande den mest använda metoden för påvisande av IFN-α protein. Trots att specifika, enkel och snabb, typ I IFN ELISAs närvarande viktiga begränsningar, såsom begränsad känslighet. Dessutom, kräver mätning av alla IFN-α subtyper användning av flera analyser varje med sin egen upptäckt kapacitet och känslighet. Medan det finns kommersiella ELISA-test som upptäcker olika subtyper av IFN-α, deras känslighet är begränsad (1,95 pg/mL, 12,5 pg/mL och 12,5 pg/mL, respektive) som ofta är otillräcklig för att upptäcka IFN-α protein i biologiska prover. För att kringgå den här begränsningen av flera biologiska proxy analyser har utvecklats för att kvantifiera typ I IFN genom att mäta inducerade genuttryck eller funktionell aktivitet8,9,10,11, 12 , 13 , 14. dessa analyser ger dock inte en direkt mätning av proteinet IFN-α.
I denna studie användes enda molekyl med digital array ELISA-teknik för att utveckla ett test för påvisande av enstaka IFN-α proteinmolekyler. Digitala ELISA använder samma grundläggande kemi som konventionella ELISA, dock reaktionen sker i matriser bestående av 50 000 enskilda 46 femtoliter storlek brunnar15,16. Enda proteinmolekyler fångas av antikroppsbelagda paramagnetiska pärlor och märkt med en biotinylerade detektionsantikropp, följt av bindningen av ett enzymkonjugat, streptividin-β-galaktosidas (SBG). Därefter, är pärlorna upphängda med ett fluorogenic enzym substrat, resorufin-β-D-galactopyranoside (RGP), till singel-molekyl arrayer. Genom att minska volymen reaktion 2 miljarder gånger17, en hög lokal koncentration av fluorescerande signal uppnås och enda molekyl räknas blir möjligt, eftersom varje molekyl skapar en signal som nu kan tillförlitligt mätt18. I huvudsak kan enda molekyl matriser räkna enda immunocomplexes och att bestämma ett genomsnittligt antal enzymer per pärla (AEB). Räkna mikrobrunnarna där en signal detekteras tillåter kvantifiering/digitalisering av proteinmolekyler, som det finns en direkt korrelation mellan proteinkoncentration och förhållandet mellan immunocomplexed-pärlor och en totala antalet pärlor i femtoliter-stora kamrarna.
Yeung et al. utfört en omfattande plattformsoberoende utvärderingsstudie med nio olika tekniker och fyra cytokin immunanalyser med syftet att jämföra precision analys, känslighet och data korrelation över olika plattformar19. En av de viktigaste resultaten av studien var att enda molekyl matriser och enda molekyl räknar immunoassay presenteras högsta känsligheten för upptäckt av cytokiner i humant serum inom intervallet sub-pg/mL koncentration. Enda molekyl array digital ELISA cytokin-analyser har använts för att studera rollen av TNF-α och IL-6 i Crohns sjukdom20, IFN-α i interferonopathy och autoimmuna patienter 7, och de olika post-translationally modifierade former av C-X-C motiv chemokine 10 (CXCL10) i kronisk hepatit och friska donatorer som fick sitagliptin21,22. Andra program omfatta mätning av rhodopsin i patienter med diabetesretinopati23; studien av hjärnan patologier genom serum/plasma mätningar av neurofilament light24 och amyloid-β 1-42 peptid25, i samband med multipel skleros och Alzheimers sjukdom, respektive. Enda molekyl array-analyser kan också användas för upptäckt av förbättrad patogen såsom karakterisering av HIV viral reservoar26, och även för upptäckt av DNA27 och micro RNAs28. En stor fördel med den enda molekyl array-tekniken är denna hög flexibilitet, då ett test mot någon analyt sevärdheter kan utvecklas om en specifik antikropp-paret finns. Dessutom är homebrew assay kit kommersiellt tillgängliga, så att utvecklingen av nya analyser, protokollet som är detaljerad i modifierad form nedan.
Här, presenteras en detaljerad beskrivning av utveckling och validering stegen för en enda molekyl array analys som resulterar i förbättrad känslighet för IFN-α protein upptäckt. Antikroppar för enda molekyl array analyser bör vara högspecifik, undvika arg reactivity med relaterade proteiner (med arter specificitet beaktas om det är relevant). Antikroppar med en KD mindre än 10-9 M bör helst väljas; hög affinitet säkerställer starka bindning, med produktionen av en högre signal. Kineticsen av antikropp-antigen bindningen är också viktiga och snabb Kpå och långsam Koff kommer att gynna antigen-antikropp komplexa församling. Börjar med en antikropp-par som har en bra prestanda i klassiskt ELISA, med en detektionsgräns (LOD) 1-100 pg/ml, ökar chanserna att få en mycket känslig enda molekyl array analys. Chang och kollegor utfört detaljerad kinetiska studier av biomolekylära interaktioner inträffar vid varje steg, föreslår en uppsättning ekvationer att förutsäga Analytisk känslighet18. De visade den enda molekyl arrayen digital ELISA verkar vara effektiv inom ett brett spektrum av antikropp tillhörighet (KD ~ 1011 - 10−9 M) as well as det signal generationen är mer beroende av den-andelen sådana antikroppar.
För att utnyttja hög affinitet typ antikroppar tog vi fördel av antikroppar isolerade från patienter med autoimmuna polyendocrinopathy syndromet 1/autoimmuna polyendocrinopathy-candidiasis-ektodermala dystrofi (APS1/APECED)29. Av skäl som ännu inte har förstått, den stora majoriteten av AIRE-brist individer utveckla en grunduppsättning av hög-aviditet antikroppar mot alla IFN-α subtyper29och vi valt två mot IFN-α-antikropp kloner av kompletterande bindande samhörighet för de olika subtyperna, IFN-α, som uppskattade av IC50 värden. Kombinationen av dessa unika hög affinitet antikroppar med enda molekyl array-teknik aktiverad direkt kvantifiering av IFN-α vid attomolar (fg/mL) koncentrationer. Sådana ultrasensitive IFN-α protein upptäckt kommer att bidra till en bättre förståelse av naturen, förordning och biologiska effekter av IFN-inducerad svar i olika sjukdomen inställningar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody A (8H1 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody B (12H5 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody EBI-1 clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody BMS216BK clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216BK</td>
			<td>Not an ELISA kit but bulk abs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2c</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS305</td>
			<td>OK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;I (17)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2b</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;1</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11175-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4a (M1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4b (a4)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11180-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;B2 (a8)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11115-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;C (a10)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;D (a1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11125-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;G (a5)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11135-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;F (a21)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11130-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;H2 (a14)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;J1 (a7)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11160-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;K (a6)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11165-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;WA (a16)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11190-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#969;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#946;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; ELISA</td>
			<td>PBL</td>
			<td>41115.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISRE-Reporter</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>CCS-008L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fu-GENE HD Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Mediuem</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40 Substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer NanoDrop 1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtres</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC505096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Conjugation Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Encoded Paramagnetic Beads</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Wash Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11844071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Blocking Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Diluent Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector and Sample Diluent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylation Reaction Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11891195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>MS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa) reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBG, Bead and Detector Barcode Labels</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Reagent Bottles</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa specimen 96-well plates</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Discs</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa 2.0 conductive Tips</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Cuvettes</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa SBG Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa RGP Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 1</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 2</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing Oil</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa HD-1 Analyzer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa)</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems</td>
			<td>Singluex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;

Huvudsyftet med detta protokoll är att beskriva utveckling och validering av en interferon (IFN)-α enda molekyl array digital enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) analys. Detta system möjliggör kvantifiering av humant IFN-α protein med oöverträffad känslighet och ingen korsreaktivitet för andra arter av IFN.
Det första viktiga steget i protokollet är valet av antikropp paret, följt av konjugationen av capture antikropp till paramagnetiska pärlor och biotinylation hos en detektionsantikropp. Efter detta steg, kan olika parametrar såsom assay konfiguration, detektor antikroppskoncentrationen och buffert sammansättning ändras tills optimal känslighet uppnås. Slutligen, specificitet och metodens reproducerbarhet bedöms för att säkerställa förtroendet för resultaten. Här utvecklade vi ett IFN-α enda molekyl array test med en detektionsgräns på 0,69 fg/mL med hög affinitet autoantikroppar isolerade från patienter med biallelic mutationer i proteinet autoimmuna regulator (AIRE) orsakar autoimmuna polyendocrinopathy syndrom typ 1/autoimmuna polyendocrinopathy-candidiasis-ektodermala dystrofi (APS1/APECED). Ännu viktigare, aktiverat dessa antikroppar upptäckt av alla 13 undertyper för IFN-α.
Denna nya metod tillåter detektering och kvantifiering av IFN-α protein i mänskliga biologiska prover vid attomolar koncentrationer för första gången. Ett sådant verktyg kommer att vara mycket användbart i övervakningen av denna cytokin i hälso- och sjukdomstillstånd, de flesta särskilt infektioner, autoimmunitet och autoinflammation.

Sammanfattningsvis belagd en pan-IFN-α enda molekyl array analys med en detektionsgräns på 0,69 fg/mL, med en 2-stegs-konfiguration med fånga pärlor med 0,3 mg/mL mot IFN-α en antikropp och mot IFN-α B upptäckt antikropp biotinylerade i biotin: antikropp förhållandet 30 utvecklades. De koncentrationer som används för biotinylerade detektionsantikropp och SBG var 0,3 µg/mL och 150 pM, respektive. Denna mycket specifika analys kan detektera alla 13 IFN-α subtyper och reagerar inte cross med annan typ av behandlats. Således, medan det inte är möjligt att identifiera och kvantifiera varje enskild art av IFN-α, alla av dem kan upptäckas och mätt tillsammans vilket ger en total koncentrationsvärde för IFN-α som består av 13 olika underklasser.
För att undersöka det potentiella diagnostiska värdet av denna nyutvecklade analys, IFN-α protein i plasma och serum från friska individer mättes och jämfördes med prover från patienter med SLE och JDM. Som illustreras i figur 7, upptäcktes höga nivåer av IFN-α protein sjukdomen kohorterna jämfört med friska kontroller. Den streckade linjen visar LOD för en konventionell kommersiellt tillgänglig ELISA, som illustrerar hur detta tillvägagångssätt inte skulle upptäcka IFN-α protein i dessa patientgrupper trots de kända intresseorganisationerna för denna cytokin med dessa fenotyper. IFN-α kunde dessutom kvantifieras över 5 loggar av omfattning, som illustrerar det brett dynamiskt omfånget av analysen, med detekterbara halter mellan 1-10 fg/mL bekräftar den känsliga naturen i analysen.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57421/57421fig7.jpg"> Figur 7: kvantifiering av IFN-α protein i plasma och serum från patientgrupper. Denna siffra har ändrats från Rodero et al. 2017. plasma från friska kontroller (n = 20) och patienter med SLE (n = 72) och JDM (n = 43) testades med pan-IFNα enda molekyl array analys. Analysen utfördes med envägs ANOVA-test (Kruskal-Wallis) och Dunns flera jämförelse tester mellan grupperna. Median är avbildad. Streckade linjen visar LOD av en referens mänsklig mot IFN-α ELISA (1,95 pg/mL = 1950 fg/mL). <a href="/files/ftp_upload/57421/57421fig7large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Steg</td>
			<td>Överväganden</td>
			<td>Referens</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1. antikropp par val</td>
			<td>Mål olika epitoper</td>
			<td rowspan="3">Tabell 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hög affinitet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Snabbt Kpå / långsam Koff
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2. antikropp par orientering</td>
			<td rowspan="3">Välj villkor med den lägsta gränsen för upptäckt</td>
			<td rowspan="3">Figur 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3. fånga antikroppskoncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>4. biotin: detektor antikropp baserat</td>
		</tr>
<tr>
<td>5. 2 vs 3-steg konfiguration</td>
			<td>Välj villkor med högst Signal: bakgrund i förhållande</td>
			<td>Figur 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6. detektor antikroppskoncentration</td>
			<td rowspan="2">Välj villkor med den lägsta gränsen för upptäckt</td>
			<td rowspan="2">Figur 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>7. SBG koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>8. specificitet</td>
			<td>Bedöma korsreaktivitet</td>
			<td rowspan="2">Figur 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9. känslighet</td>
			<td>Bedöma erkännande av subtyper (om tillämpligt)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10. reproducerbarhet</td>
			<td>Bedöma assay variabilitet</td>
			<td>Figur 5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Sammanfattning av åtgärder för utveckling och optimering av en enda molekyl array analys. Denna tabell sammanfattar de olika steg som krävs för utveckling och optimering av en enda molekyl array analys, från inledande valet av antikropp par tills bedömningen av reproducerbarhet.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antigen</td>
			<td>8H 1 (A)</td>
			<td>12H 5 B</td>
			<td>Sifalimumab</td>
			<td>Rontalizumab</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ1</td>
			<td>28,3</td>
			<td>51,3</td>
			<td>460</td>
			<td>22.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ2</td>
			<td>2563</td>
			<td>10,7</td>
			<td>9,02</td>
			<td>2.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ4</td>
			<td>5.11</td>
			<td>2,99</td>
			<td>35.35</td>
			<td>325,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ5</td>
			<td>2,01</td>
			<td>19,6</td>
			<td>93.29</td>
			<td>2,49</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ6</td>
			<td>64,7</td>
			<td>3.03</td>
			<td>4,97</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ7</td>
			<td>0,9</td>
			<td>0,63</td>
			<td>233,1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ8</td>
			<td>302</td>
			<td>0,83</td>
			<td>691</td>
			<td>10,86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ10</td>
			<td>2,54</td>
			<td>0,71</td>
			<td>43,2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ14</td>
			<td>3224</td>
			<td>2.1</td>
			<td>14,52</td>
			<td>0,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ16</td>
			<td>1,83</td>
			<td>32,99</td>
			<td>59,18</td>
			<td>28.65</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ17</td>
			<td>2.21</td>
			<td>0,77</td>
			<td>890.9</td>
			<td>23,86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ21</td>
			<td>2,78</td>
			<td>12,87</td>
			<td>1769</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Pan-alpha antikropp urval. IC50 (ng/mL) fastställs med hjälp av elementet interferon-stimulerad svar (ISRE)-luciferas neutralization assay. Tabellen visar IC50 värdena för mAbs används i enda molekyl array analys för alla IFN-α undertyper. 10 000 HEK 293 MSR celler var seedad i vit halv-området 96 brunnar och omvänd-transfekterade med 50 ng förblandade ISRE-Firefly luciferas reporter och Renilla luciferas konstruktioner med transfection reagens enligt tillverkarens anvisningar. Den luciferas-uttryckande bygga tjänade som en inre normalisering kontroll. Cellerna var inkuberas över natten i minskat Serum Medium kompletteras med 0,1 mM onödiga aminosyror, 1 mM natrium pyruvat, 0,5% fetalt bovint serum vid 37 ° C, 5% CO2 i en fuktad atmosfär. Efter natten inkubation stimuleras celler för 24 h med medium som innehåller blandningar av rekombinant humant IFN-α med eller utan mot IFN-α mAbs eller kontroll IgG som hade varit teststamman för 1 h vid 37 ° C. Efter 24 h av stimulering utfördes dubbla luciferas reporter analyser enligt tillverkarens anvisningar. «-» Ej bestämd. Sifalimumab är en helt human, immunglobulin G1 κ monoklonal antikropp som binder till och neutraliserar majoriteten av IFN-α undertyper; Rontalizumab är en humaniserad monoklonal antikropp mot IFN-α. Anpassad från Meyer et al. 2016 och Rodero o.a. 2017.
Kompletterande Tabell1: val av antikropp orientering, fånga antikroppskoncentration på pärlor och baserat på biotinylation. De två möjliga olika konfigurationerna testades, med mot IFN-α A som capture antikropp och mot IFN-α B som upptäckt antikropp (A), och vice versa (B). IFNα - 2c användes som antigen. Olika capture antikropp koncentrationer samt biotin: antikropp (B:A) nyckeltal testades också för båda konfigurationerna. Mättnad (Sat). Orange: AEB värden som användes för beräkning av LOD; dessa koncentrationer ansågs tom som AEB värden varit stabil. LOD beräknades som menar tom + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_1.xlsx">vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande Tabell2: Test av 2 vs 3-steg konfiguration. De 2 och 3 - steg konfigurationerna bedömdes med IFNα - 2c som antigen. AEB visas samt som signal/bakgrund ransoner (S/B) värdena för båda villkoren. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_2.xlsx">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande Tabell3: optimering av detektor och SBG koncentration. Tre olika koncentrationer av biotinylerade detektor antikropp (0,1, 0,3 och 0,6 µg/mL) tillsammans med tre olika koncentrationer av SBG (50, 150 och 250 pM) bedömdes. AEB värden visas för de nio testa villkor. Orange: AEB värden som användes för beräkning av LOD; dessa koncentrationer ansågs tom som AEB värden varit stabil. LOD beräknades som menar tom + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_3.xlsx">vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande Tabell4: specificitet och känslighet optimerad IFNα enda molekyl array analysens. Genomsnittliga enzym per pärlor värden visas när IFN-β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω och IFN-γ rekombinanta proteiner var testade (A), tillsammans med de 16 undertyperna av IFN-α (B). «-» Ej bestämd. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_4.xlsx">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande Tabell5: reproducerbarhet optimerad IFNα enda molekyl array analysens. De AEB medelvärdena för alla tre oberoende körs visas till en koncentration av 10.000 fg/mL. «-» Ej bestämd. Mättnad (Sat). <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_5.xlsx">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande Tabell6: Protein konkurrens assay. Genomsnittliga enzym per pärlor värden visas för alla villkor testade. Mätningar gjorda i två exemplar. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_6.xlsx">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃŽÂ± at JoVE.com

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Här presenterar vi ett protokoll för att beskriva utveckling och validering av en enda molekyl array digital ELISA-testet, vilket gör den ultra känslig detektion av alla IFN-α undertyper i mänskliga prover.

Utveckling och validering av en Ultrasensitive enda molekyl Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay för humant Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzymkopplad immunospot analys (ELISPOT): Kvantifiering av TH-1 cellulära immunsvaret mot mikrobiella antigener

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Use of Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Användning av interferon-γ Enzymkopplad immunospot Analys att karaktärisera nya T-cellsepitoper av humant papillomvirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ hög kapacitet encelliga cytotoxicitetsanalys för T-celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Karakterisering av inflammatoriska svar under intranasal kolonisering med Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Visualisera protein-DNA interaktioner i levande bakteriella celler med photoactivated Single-molekyl Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Tillämpning av Långsiktigt odlade Interferon-γ Enzymkopplad immunospot analys för bedömning Effector och Memory T-cellssvar hos nötkreatur

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Utveckling och validering av en kvantitativ PCR-metod för hästdjur Herpesvirus-2 Diagnostik i Andnings Vätskor

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Inrättandet av en hög kapacitet Setup för screening av små molekyler som modulerar c-di-GMP Signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Analys av vidhäftning under Shear stress för studier av T-lymfocyter-adhesionsmolekyl interaktioner

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Mätning influensaneuraminidas Inhibition Antikroppstitrar genom enzymkopplad lektin analys

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...