Name: development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;
Uploaded: 2018-06-14T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃŽÂ± at JoVE.com

DD ve YJC kabul ANR desteğinden (proje IFNX, yok. CE17001002) ve ImmunoQure AG monoklonal antikorlar sağlamak için. Biz Brigitte balta-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki ve Pierre Quartier klinik örnekler sağlamak için teşekkür ederiz. YJC kabul eder Avrupa Araştırma Konseyi (GA 309449: YJC için arkadaş grubu) ve başvuru ANR-10-IAHU-01 taşıyan "yatırımlar gelecek için" program kapsamında Ulusal Araştırma Ajansı (Fransa) tarafından yönetilen bir devlet sübvansiyon.

<ol>
	<li>Isaacs, A., Lindenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classics+in+Oncology+Virus+Interference:+I.+The+Interferon.">Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).</li><li>Isaacs, A., Lindenmann, J., Valentine, R. C., Alerts, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pillars+Article:+Virus+Interference.+II.+Some+Properties+of+Interferon.">Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon.</a> Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).</li><li>Hunt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombotic+Microangiopathy+Associated+with+Interferon+Beta.">Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta.</a> N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).</li><li>Hooks, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Interferon+in+the+Circulation+of+Patients+with+Autoimmune+Disease.">Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease.</a> N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).</li><li>Greenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-alpha/beta+Mediated+Innate+Immune+Mechanisms+in+Dermatomyositis.">Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis.</a> Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).</li><li>Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+interferonopathies+a+novel+set+of+inborn+errors+of+immunity.">Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).</li><li>Rodero, M. P., Crow, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+interferon+-+mediated+monogenic+autoinflammation:+The+type+I+interferonopathies,+a+conceptual+overview.">Type I interferon - mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview.</a> J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).</li><li>Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+biological+assay+for+interferons.">A sensitive biological assay for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).</li><li>Meager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+assays+for+interferons.">Biological assays for interferons.</a> J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).</li><li>Hua, J., Kirou, K., Lee, C., Crow, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Assay+of+Type+I+Interferon+in+Systemic+Lupus+Erythematosus+Plasma+and+Association+With+Anti+-+RNA+Binding+Protein+Autoantibodies.">Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti - RNA Binding Protein Autoantibodies.</a> Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).</li><li>Niewold, T. B., Kariuki, S. N., Morgan, G. A., Shrestha, S., Pachman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+serum+interferon-alpha+activity+in+juvenile+dermatomyositis:+associations+with+disease+activity+at+diagnosis+and+after+thirty-six+months+of+therapy.">Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy.</a> Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).</li><li>Seo, Y., Kim, G., Kwak, H., Nam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+HeLa+Mx2+/+Luc+Reporter+Cell+Line+for+the+Quantification+of+Human+Type+I+Interferons.">Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons.</a> Pharmacology. 84, 135-144 (2009).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+surface+expression+of+Fc&#947;+receptor+RI+(+CD64+),+a+biomarker+reflecting+type-I+interferon+levels+in+systemic+lupus+erythematosus.">Monocyte surface expression of Fc&#947; receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).</li><li>Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Vesicular+Stomatitis+Virus+Replicon-Based+Bioassay+for+the+Rapid+and+Sensitive+Determination+of+Multi-Species+Type+I+Interferon.">A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon.</a> PLoS One. 6, e25858 (2011).</li><li>Rissin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assay+detects+serum+proteins+at+subfemtomolar+concentrations.">Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations.</a> Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).</li><li>Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+array+(Simoa)+assay+with+optimal+antibody+pairs+for+cytokine+detection+in+human+serum+samples.">Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples.</a> R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).</li><li>Simoa. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+Principle+of+SimoaTM+(Single+Molecule+Array)+Technology.">Scientific Principle of SimoaTM (Single Molecule Array) Technology.</a> Whitepaper 1.0. , 1-2 (2013).</li><li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assays+Theoretical+considerations.">Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations.</a> J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).</li><li>Yeung, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+highly+sensitive+immunoassay+technologies+for+quantitative+measurements+of+sub-pg+/+mL+levels+of+cytokines+in+human+serum.">Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum.</a> J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+measurements+of+tumor+necrosis+factor+&#945;+and+interleukin-6+in+the+plasma+of+patients+with+Crohn's+disease.">Single molecule measurements of tumor necrosis factor &#945; and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease.</a> J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).</li><li>Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Changes+of+Post-Translationally+Modified+Forms+of+CXCL10+and+Soluble+DPP4+in+HCV+Subjects+Receiving+Interferon-Free+Therapy.">Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy.</a> PLoS One. 10, e0133236 (2015).</li><li>Decalf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+DPP4+activity+in+humans+establishes+its+in+vivo+role+in+CXCL10+post-translational+modification:+prospective+placebo-controlled+clinical+studies.">Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies.</a> EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).</li><li>Rabing Brix Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+in+plasma+from+patients+with+diabetic+retinopathy+-+development+and+validation+of+digital+ELISA+by+Single+Molecule+Array+(Simoa)+technology.">Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy - development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology.</a> J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).</li><li>Disanto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+Neurofilament+Light:+A+Biomarker+of+Neuronal+Damage+in+Multiple+Sclerosis.">Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis.</a> Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+ultrasensitive+measurement+of+amyloid-+&#946;+1+-+42+peptide+in+human+plasma+with+utility+for+studies+of+Alzheimer's+disease+therapeutics.">A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- &#946; 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics.</a> Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).</li><li>Passaes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+HIV-1+p24+Assay+Detects+Single+Infected+Cells+and+Differences+in+Reservoir+Induction+by+Latency+Reversal+Agents.">Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents.</a> J. Virol. 91, e02296 (2017).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Detection+of+Bacterial+Genomic+DNA+at+Sub-Femtomolar+Concentrations+Using+Single+Molecule+Arrays.">Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays.</a> Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).</li><li>Cohen, L., Hartman, M. R., Amardey-wellington, A., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+direct+detection+of+microRNAs+using+single+molecule+arrays.">Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays.</a> Nucleic Acids Res. 45, e137 (2017).</li><li>Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AIRE-Deficient+Patients+Harbor+Unique+High-Affinity+Disease-Ameliorating+Autoantibodies.">AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies.</a> Cell. 166, 582-595 (2016).</li><li>Simoa. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homebrew+Assay+Development+Guide.">Homebrew Assay Development Guide.</a> Simoa HD-1 Analyzer &amp; Quanterix SR-X. User-0021 08. , (2017).</li><li>Rodero, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+interferon+alpha+protein+reveals+differential+levels+and+cellular+sources+in+disease.">Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease.</a> J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).</li><li>Pleil, J., Angrish, M., Madden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemistry+for+high-throughput+screening+of+human+exhaled+breath+condensate+(EBC)+media+implementation+of+automated+Quanterix+SIMOA+instrumentation.">Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation.</a> J. Breath Res. 9, 047108 (2015).</li><li>Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Proteomic+Strategy+for+Clinical+Biomarker+Discovery.">Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery.</a> Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).</li><li>Wilson, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Simoa+HD-1+Analyzer:+A+Novel+Fully+Automated+Digital+Immunoassay+Analyzer+with+Single-Molecule+Sensitivity+and+Multiplexing.">The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing.</a> J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).</li><li>Rivnak, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully-automated,+six-plex+single+molecule+immunoassay+for+measuring+cytokines+in+blood.">A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood.</a> J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).</li><li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Plasma+Proteome.+History,+character,+and+diagnostic+prospects.">The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).</li><li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISA+in+the+multiplex+era:+Potentials+and+pitfalls.">ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls.</a> Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, geliştirme ve son derece tekrarlanabilir, vericiyi molekülünü dizi dijital ELISA IFN-α proteinin insan örnekleri ( Tablo 1' de özetlenen adımları) doğrudan miktar için doğrulama nitelendirdi. Tahlil gelişiminde en önemli adımlardan biri antikor çifti16, kinetik ve anahtar başarılı bir tahlil için olmak epitope bağlama açısından özelliklere sahip seçimdir. Aynı epitope hedef veya bu steric engel neden eşleştirilmiş monoklonal antikorların kullanımı önlemek önemlidir. Poliklonal antikorlar gibi sınırlamalar üstesinden gelmek için algılama antikor kullanılabilir. Eğer herhangi bir belirli adımdan istenen hassasiyet elde değil, daha fazla en iyi duruma getirme olanakları dikkate alınmalıdır. Bu alternatif antikor çiftleri, protein türü gibi parametreleri değişiklikleri kullanımı içerebilir (örneğin BSA < kazein), pH (6.0-8,5), iyonik gücü, arabelleğe alma kapasitesi (örneğin NaCl ve fosfat konsantrasyonları), taşıyıcı boncuk/veya yüzey aktif maddeleri varlığı. Parametrelerin geniş con bir tek molekül dizi tahlil geliştirilirken optimize. Ancak, genel olarak, yüksek sinyal: arka plan oranları ve en az LODs vermek koşullar tercih olanlardır (bkz: resim 1, resim 2ve Şekil 3).
Özgüllük ile ilgili, IFN-α tahlil gösterdi herhangi bir diğer IFNs için çapraz hiçbir reaktivite test (β, γ, λ1, λ2, ω) (Şekil 4a) ve tüm 13 IFN-α alt türlerinden (Şekil 4b) algılama yeteneğine sahip. Ancak, tahlil IFN-α2 alt türü, (Şekil 4b ve ek tablo 4) için daha düşük bir ilgi gösterdi. IFN-α2 alt türlerinden farklı ticari elde gibi ilginçtir, IFN-α2 (a, b, c) farklı sınıfları için farklı hassasiyetleri de, farklı üretim prosedürleri veya farklı amino asit dizileri, nedeniyle olabilen gözlendi tedarikçiler. Bu tek istisna ile IFN-α türler çok benzer yanıt verdi. Testin özgüllüğü daha fazla anti-IFN-α (Şekil 6 ve ek tablo 6) sinyal kaldırıldı bir klon ile örneklerinin ön arıtma tarafından sunuldu.
Bu teknoloji ana avantajlarından biri herhangi bir analit ilgi hedeflenen16potansiyel olabilir olduğunu. Ayrıca, farklı biyolojik örnekler, serum, plazma, beyin omurilik sıvısı, hücresel lysates, kültür supernatants31 ve hatta nefes32gibi test edilebilir. Genellikle, bir 1:3 seyreltme plazma potansiyel tek molekül dizi analyzer tıkanma önlemek için yapılır. Ancak, faiz analit ilgili biyolojik örnek çok düşük konsantrasyonlarda mevcut olabilir ve örnek daha yüksek konsantrasyonlarda (bağlı olarak tahlil duyarlılık) gerekli33olabilir. Orada iyi duyarlılık34koruyarak çoğullama için potansiyel, aynı deneyleri içinde 6 protein var henüz için geliştirilen35daha büyük ölçme deneyleri ve daha zor bir işlem olsa da.
Algılamak ve sitokinler ve diğer biyolojik ilgili proteinler gibi düşük konsantrasyonlarda ölçmek yeteneği uygulamaları33,36yepyeni bir dizi kadar açılır. İyi çok sayıda protein etkileri, hatta en iyi ELISAs37tespiti sınırın altına olan şu ana kadar çok düşük konsantrasyonlarda sarfetmek bilinmektedir. Diğer immunoassay teknolojileri geleneksel ELISA19avantajları sunarken, biz burada tek molekül dizi dijital ELISA düşük konsantrasyon sitokinler NEMS tespiti için tekrarlanabilir ve sağlam bir platform olduğunu ispat insan örnekleri. Bu nedenle, bu teknoloji biyomarker bulma ve hastalıkların geniş bir dizi gelişmiş hasta yönetimi için büyük bir potansiyel sunmaktadır.

Ben IFNs olan bir ailenin antiviral bağışıklık yanıtı düzenlediğini merkezi bir rol oynamak sitokinler türü. Onlar ilk Isaacs ve Lindenmann 60 yıl önce1,2 ve o şimdi polipeptitler türdeş olmayan bu ailenin 14 farklı alt sınıfları (13 IFN-α alt türlerini ve 1 IFN-β) oluşmaktadır bilinen keşfedildi. Ben IFNs viral enfeksiyonların temizlenmesi için gerekli olan, ama aynı zamanda insan hastalık durumlarında, otoimmün hastalıklar sistemik lupus eritematozus (SLE), juvenil Dermatomiyozit (JDM), dahil olmak üzere çeşitli patolojisi karıştığı türü ve türü Ben interferonopathies kurucu hangi yazıyla ben IFN kaynaklı sinyal patoloji3,4,5,6,7' sonuçları.
Eğitim tip ı IFN protein düzeyleri biyolojik örneklerde olmuştur zorlu beri onun ilk kimlik bir "madde engel"1,2. Şu anda, sandviç Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) IFN-α protein algılanması için en çok kullanılan yöntemdir. Belirli, basit ve hızlı olmasına rağmen ' tip ı sınırlı hassasiyet gibi IFN ELISAs mevcut önemli sınırlamalar. Buna ek olarak, tüm IFN-α türlerinden ölçüm kendi algılama kapasitesi ve duyarlılık ile birden fazla deneyleri kullanımını gerektirir. Farklı alt türlerinden IFN-α algılamak ticari ELISAs olmakla birlikte, onların hassasiyeti sınırlıdır (1,95 pg/mL, 12,5 pg/mL ve 12.5 pg/mL, sırasıyla) kez IFN-α protein biyolojik örnekleri algılamak yetersiz olduğu. Bu sınırlamayı aşmak için çeşitli biyolojik proxy deneyleri ölçmek için geliştirilmiştir tip ı IFN indüklenen gen ekspresyonu ya da fonksiyonel etkinlik8,9,10,11, ölçerek 12 , 13 , 14. yine de, bu deneyleri IFN-α protein doğrudan bir ölçüm sağlamak değil.
Bu çalışmada, tek molekül dizi dijital ELISA teknoloji tek IFN-α protein molekülleri tespiti için bir tahlil geliştirmek için kullanıldı. Dijital ELISA aynı temel kimya geleneksel ELISA olarak kullanır, ancak, reaksiyon 50.000 bireysel 46 femtoliter boy kuyu15,16oluşan diziler yer alır. Tek protein molekülleri antikor kaplı paramagnetic boncuk tarafından yakalanır ve bir enzim eşlenik, streptavidin-β-galaktozidaz (SBG) bağlama tarafından takip biotinylated algılama antikor taşır. Daha sonra boncuk fluorogenic enzim substratı resorufin-β-D-galactopyranoside (alp), içine tek molekül dizileri ile askıya alınır. Birimin azalan tarafından tepki 2 milyar kez17, floresan sinyal yerel yüksek yoğunlukta elde edilir ve tek molekül sayıları her molekül şimdi güvenilir olabilir bir sinyali üretir olarak mümkün hale18ölçülür. Esas olarak tek molekül dizileri tek immunocomplexes sayma ve enzimler boncuk (AEB) başına ortalama sayısını belirleme yeteneğine sahiptirler. Protein konsantrasyonu ve immunocomplexed-boncuk ve boncuk mevcut toplam sayısı arasındaki oran arasında doğrudan bir ilişki olduğu bir sinyal tespit microwells Sayma miktar/dijitalleştirme protein moleküllerinin izin verir femtoliter-büyüklük odası.
Yeung ve ark. dokuz farklı teknolojiler ve dört sitokin uzun tahlil duyarlılık, hassasiyet ve veri korelasyon arasında farklı platformlarda19karşılaştırma amacı ile kullanarak bir kapsamlı çapraz platform değerlendirme çalışması yapılır. Çalışmanın temel bulgular tek molekül diziler ve tek molekül immunoassay sayma sitokinler algılanması için en yüksek duyarlılık alt-pg/mL konsantrasyon aralığı içinde insan serumda sunulan biriydi. Crohn hastalığı20, IFN-α interferonopathy ve oto-immün hastalar 7, IL-6 ve TNF-α rolde çalışma için kullanılan tek molekül dizi dijital ELISA sitokin deneyleri ve farklı değiştirilme tarihi post-translationally C-X-C formları Motif kemokin 10 (CXCL10) Kronik hepatit ve sağlıklı bağış sitagliptin21,22alma. Diyabetik retinopati23olan hastalarda rhodopsin ölçümü diğer uygulamalar dahil; beyin patolojileri neurofilament serum/plazma ölçümleri aracılığıyla çalışma ışık24 ve amiloid-β 1-42 peptid25, multipl skleroz ve Alzheimer hastalığı, bağlamında anılan sıraya göre. Tek molekül dizi deneyleri için geliştirilmiş patojen algılama gibi HIV viral rezervuar26karakterizasyonu ve DNA27 ve mikro RNA'lar28algılanması için de kullanılabilir. Tek molekül dizi teknoloji önemli bir avantajı bu yüksek çok yönlülük, spesifik antikor çifti varsa bir tahlil karşı ilgi herhangi bir analit geliştirilebilir gibidir. Buna ek olarak, homebrew tahlil kitleri hangi protokolü değiştirilen form aşağıda ayrıntılı yeni deneyleri, gelişimi sağlayan ticari olarak kullanılabilir.
Burada, bir tek molekül dizi tahlil için geliştirme ve doğrulama adımları ayrıntılı bir açıklama bu sonuçları IFN-α protein algılama için geliştirilmiş hassasiyet gösterilir. Antikor molekülünü dizi deneyleri için son derece kesin, (varsa kabul türler özgüllük ile) ilişkili proteinler ile çapraz reaktivite kaçınmak gerekir. İdeal olarak, bir KD daha küçük 10-9 M antikorlar seçilmelidir; yüksek benzeşimi güçlü bağlama ile daha yüksek bir sinyal üretimini sağlar. Antikor-antijen bağlayıcı kinetik are da önemli ve hızlı Küzerinde ve yavaş Kkapalı antijen-antikor kompleksi derleme lehine. Bir sınırı 1-100 pg/mL, tespiti (LOD olarak) olan klasik ELISA içinde iyi bir performans sunuyor bir antikor çifti ile başlayan son derece hassas tek molekül dizi tahlil elde etme şansını artırır. Chang ve meslektaşları her adım, meydana gelen biyomoleküler etkileşimleri ayrıntılı kinetik çalışmalar denklemler analitik duyarlılık18tahmin etmek için bir dizi teklif uygulandı. Dijital ELISA görünür çok çeşitli antikor benzeşim içinde etkili olabilmesi için bu tek molekül diziyi gösterdiler (KD ~ 10−11 - 10−9 M), hem de o sinyal üretimi daha üzerinde-oranı üzerinde böyle antikorların bağlıdır.
Yüksek afinite yararlanmak için 1/otoimmün polyendocrinopathy kandidiyazis ektodermal distrofi (APS1/APECED)29biz izole Antikorlar otoimmün polyendocrinopathy sendromlu hastalarda yararlandı antikorlar yazın. Henüz anlaşılamamıştır nedeniyle, AIRE eksikliği bireylerin büyük çoğunluğu yüksek-hırs antikorlar karşı tüm IFN-α alt türlerinden29çekirdek kümesi geliştirmek ve biz tamamlayıcı bağlama benzeşim iki anti-IFN-α antikor klonları seçildi farklı IFN-α alt türleri için ŞA50 değerleri tarafından tahmini olarak. Bu benzersiz yüksek afinite antikor molekülünü dizi teknoloji ile kombinasyonu IFN-α doğrudan miktar attomolar (fg/mL) konsantrasyonlarda etkin. Böyle NEMS IFN-α protein algılama daha iyi doğa, yönetmelik ve IFN kaynaklı yanıt farklı hastalık ayarları olarak biyolojik etkisini anlamak için katkıda bulunacaktır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody A (8H1 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody B (12H5 clone)</td>
			<td>ImmunoQure AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Not commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody EBI-1 clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; antibody BMS216BK clone</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS216BK</td>
			<td>Not an ELISA kit but bulk abs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2c</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>BMS305</td>
			<td>OK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;I (17)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;2b</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;1</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11175-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4a (M1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11177-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;4b (a4)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11180-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;B2 (a8)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11115-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;C (a10)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;D (a1)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11125-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;G (a5)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11135-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;F (a21)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11130-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;H2 (a14)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;J1 (a7)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11160-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;K (a6)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11165-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#945;WA (a16)</td>
			<td>PBL</td>
			<td>11190-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#955;2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#969;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#946;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN &#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IFN-&#945; ELISA</td>
			<td>PBL</td>
			<td>41115.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISRE-Reporter</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>CCS-008L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fu-GENE HD Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Mediuem</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40 Substitute</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer NanoDrop 1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>No longer available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtres</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC505096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Conjugation Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Encoded Paramagnetic Beads</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Wash Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11844071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Blocking Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Diluent Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detector and Sample Diluent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylation Reaction Buffer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102040</td>
			<td>Can not be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11891195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>MS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips (10, 20, 200 and 1000 &#956;l)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa) reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBG, Bead and Detector Barcode Labels</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Reagent Bottles</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa specimen 96-well plates</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Discs</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa 2.0 conductive Tips</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa Cuvettes</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa SBG Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>102295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa RGP Reagent</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>101736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 1</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa System Buffer 2</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing Oil</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simoa HD-1 Analyzer</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>100032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule array (Simoa)</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems</td>
			<td>Singluex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and validation of an ultrasensitive single molecule array digital enzyme-linked immunosorbent assay for human interferon-&#945;

Amacı bu iletişim kuralı, geliştirme ve doğrulama bir interferon (IFN) tarif etmektir-α tek molekül dizi dijital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) tahlil. Bu sistem insan IFN-α protein miktar IFN diğer türler için eşi görülmemiş hassasiyet ve yok olan sayesinde sağlar.
Protokolü'nün önemli bir ilk adım paramagnetic boncuk ve algılama antikor biotinylation yakalama antikor konjugasyon tarafından takip antikor çiftinin seçimdir. Optimum hassasiyet elde kadar bu adımı tahlil yapılandırma, dedektör antikor konsantrasyon ve arabellek oluşturma gibi farklı parametreler değiştirilebilir. Son olarak, özgüllük ve tekrarlanabilirlik yöntemin sonuçları güven sağlamak için değerlendirilir. Burada, geliştirdiğimiz bir IFN-α tek molekül dizi tahlil limiti 0.69 fg/mL biallelic mutasyonlar otoimmün polyendocrinopathy neden olan otoimmün regülatörü (AIRE) protein ile hastalardan izole yüksek afinite otoantikorlar kullanarak algılama sendromu tip 1/otoimmün polyendocrinopathy kandidiyazis ektodermal distrofi (APS1/APECED). Önemlisi, bu antikorlar tüm 13 IFN-α türlerinden algılama etkin.
Bu yeni yöntem algılama ve IFN-α protein miktar attomolar konsantrasyonlarda insan biyolojik örneklerde ilk kez sağlar. Acayip bir insan sağlığı ve hastalık durumlarında, bu sitokin düzeyleri izlemek son derece yararlı olacaktır çoğu özellikle enfeksiyon, otoimmünite ve autoinflammation.

Özet olarak, bir pan-IFN-α tek molekül dizi tahlil limiti 0.69 fg/mL, 2-adım yapılandırma yakalama boncuk ile kullanarak algılama 0.3 mg/mL anti-IFN-α ile kaplı bir biotin: antikor oranı, bir antikor ve anti-IFN-α B algılama antikor biotinylated 30 geliştirilmiştir. Biotinylated algılama antikor ve SBG için kullanılan konsantrasyonları 0,3 olduğunu µg/mL ve 150 pM, anılan sıraya göre. Bu çok özel tahlil tüm 13 IFN-α alt türlerini tespit yeteneğine sahiptir ve cross IFNs başka tür tepki vermez. Böylece, tanımlamak ve IFN-α tek tek her tür ölçmek mümkün değildir, ancak hepsini tespit edilebilir ve birlikte IFN-13 farklı alt sınıflarını oluşturan α için toplam konsantrasyonu değer veren ölçülür.
Yeni geliştirilen bu tahlil olası tanı değerini keşfetmek için IFN-α protein plazma ve serum sağlıklı bireylerin ölçülen ve SLE ve JDM muzdarip hastaların örnekleri ile karşılaştırıldığında. Şekil 7' de gösterildiği gibi sağlıklı kontrol ile karşılaştırıldığında her iki hastalık kohortlardan IFN-α protein yüksek seviyede algılandı. Noktalı çizgi nasıl bu yaklaşım IFN-α protein bu sitokin bilinen kurum ile bu fenotipleri rağmen hasta bu gruplarda bulmak istiyorsunuz değil gösteren bir geleneksel ticari olarak mevcut ELISA LOD gösterir. Ayrıca, IFN-α tespit düzeyleri arasında 1-10 fg/mL teyit tahlil son derece hassas doğası ile tahlil geniş dinamik aralığını gösteren büyüklüğü, 5 günlükleri sayısal.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57421/57421fig7.jpg"> Şekil 7: miktar plazma ve serum üzerinden hasta kohortlardan IFN-α proteinin. Bu rakam Rodero ve arkdeğiştirildi. 2017. plazma sağlıklı kontrol üzerinden (n = 20) ve SLE hastalarda (n = 72) ve JDM (n 43 =) pan-IFNα tek molekül dizi tahlil ile test edildi. Çözümlemenin tek yönlü ANOVA testi (Kruskal-Wallis) ve Dunn'ın birden fazla karşılaştırma grupları arasında test kullanarak. Medyan tasvir edilir. Noktalı çizgi gösterir bir başvuru insan anti-IFN-α ELISA LOD (1,95 pg/mL = 1950 fg/mL). <a href="/files/ftp_upload/57421/57421fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adım</td>
			<td>Dikkat edilmesi gereken noktalar</td>
			<td>Başvuru</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1. antikor çifti seçim</td>
			<td>Hedef farklı epitopları</td>
			<td rowspan="3">Tablo 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Yüksek benzeşimi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Küzerinde hızlı / yavaş Kkapalı
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2. antikor çift yönlendirme</td>
			<td rowspan="3">Algılama en düşük Limit ile koşulları seçin</td>
			<td rowspan="3">Resim 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3. antikor konsantrasyon yakalama</td>
		</tr>
<tr>
<td>4. biotin: Dedektör antikor oranı</td>
		</tr>
<tr>
<td>5. 2 3-adım yapılandırma vs</td>
			<td>Sinyal: arka plan oranı en yüksek olan koşul seçin</td>
			<td>Resim 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6. Dedektör antikor konsantrasyonu</td>
			<td rowspan="2">Algılama en düşük Limit ile koşulları seçin</td>
			<td rowspan="2">Şekil 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>7. SBG konsantrasyonu</td>
		</tr>
<tr>
<td>8. özgüllük</td>
			<td>Olan değerlendirmek</td>
			<td rowspan="2">Şekil 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9. duyarlılık</td>
			<td>(Varsa) tanıma alt türlerinden değerlendirmek</td>
		</tr>
<tr>
<td>10. tekrarlanabilirlik</td>
			<td>Tahlil değişkenliği değerlendirmek</td>
			<td>Şekil 5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Özet adımlar geliştirme ve bir tek molekül dizi tahlil iyileştirmesi için. Bu tablo geliştirme ve tekrarlanabilirlik değerlendirilmesi kadar antikor çiftinin ilk seçim bir tek molekül dizi tahlil duruma getirilmesi için gereken farklı adımları özetlemektedir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antijen</td>
			<td>8H 1 (A)</td>
			<td>12H 5 (B)</td>
			<td>Sifalimumab</td>
			<td>Rontalizumab</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ1</td>
			<td>28,3</td>
			<td>51.3</td>
			<td>460</td>
			<td>22.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ2</td>
			<td>2563</td>
			<td>10,7</td>
			<td>9,02</td>
			<td>2.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ4</td>
			<td>5.11</td>
			<td>2.99</td>
			<td>35.35</td>
			<td>325.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ5</td>
			<td>2,01</td>
			<td>19,6</td>
			<td>93,29</td>
			<td>2.49</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ6</td>
			<td>64.7</td>
			<td>3.03</td>
			<td>4,97</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ7</td>
			<td>0,9</td>
			<td>0,63</td>
			<td>233.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ8</td>
			<td>302</td>
			<td>0,83</td>
			<td>691</td>
			<td>10.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ10</td>
			<td>2.54</td>
			<td>0.71</td>
			<td>43,2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ14</td>
			<td>3224</td>
			<td>2.1</td>
			<td>14.52</td>
			<td>0,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ16</td>
			<td>1.83</td>
			<td>32.99</td>
			<td>59.18</td>
			<td>28.65</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ17</td>
			<td>2.21</td>
			<td>0.77</td>
			<td>890.9</td>
			<td>23.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ21</td>
			<td>2,78</td>
			<td>12.87</td>
			<td>1769</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Pan-Alfa antikoru seçim. IC50 (ng/mL) belirlenen interferon teşvik yanıt öğesini (ISRE) kullanarak-Luciferase nötralizasyon tahlil. Masa tek molekül dizi tahlil tüm IFN-α alt türleri için kullanılan mAbs IC50 değerlerini gösterir. 10.000 HEK 293 MSR hücreleri beyaz yarı-alan 96-şey levha tohumlari ve ters-50 ng premix ISRE ateş böceği luciferase muhabir ve üreticinin yönergelerine göre transfection reaktifler kullanarak Renilla luciferase yapıları ile transfected. Luciferase ifade etme yapı iç normalleştirme denetimi olarak görev yaptı. Hücreleri gecede İndirimli Serum 0,1 mM gerekli olmayan amino asitler, 1 mM sodyum pyruvate, 37 ° C'de % 0.5 fetal Sığır serum, oksijen bir atmosferde % 5 CO2 ile desteklenmiş orta inkübe. Gecede kuluçka sonra hücreleri, 24 saat rekombinant insan IFN-α ile ya da ezelî anti-IFN-α mAbs ya da denetim 37 ° C'de 1 h için preincubated IgG karışımları içeren orta ile teşvik Stimülasyon 24 saat sonra üreticinin yönergelerine göre çift luciferase muhabir deneyleri gerçekleştirilmiştir. «-» Belirlenmemiştir. Sifalimumab bir tamamen insan immünoglobulin G1 κ monoklonal bağlar ve IFN-α alt türlerinden çoğunluğu nötralize antikor olduğunu; Rontalizumab karşı IFN-α insanlaşmış monoklonal antikor var. Meyer vd. 2016 ve Rodero vd. 2017.
Ek tablo 1: seçim antikor yönelimi, yakalama antikor konsantrasyon boncuk ve biotinylation oranı. İki olası farklı yapılandırma anti-IFN-α yakalama antikor ve anti-IFN-α B algılama antikor (A) ve Yardımcısı kullanarak test edildi tersi (B). IFNα - 2c antijen kullanıldı. Biyotin: antikor (B:A) oranları yanı sıra farklı yakalama antikor konsantrasyonları da her iki yapılandırmaları için test edildi. Doyma (Doy). Turuncu: LOD hesaplaması için kullanılan AEB değerleri; Bu konsantrasyonları sabit kaldı AEB değerleri olarak boş kabul edildi. LOD olarak hesaplanır demek boş + 3SD. olarak <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_1.xlsx">bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek tablo 2: 2 vs 3-adım yapılandırma testi. 2 ve 3 - adım yapılandırmaları kullanarak IFNα - 2 c antijen değerlendirildi. AEB değerleri de sinyal/erzak (S/B) arka plan gibi koşulların her ikisi de görüntülenir. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_2.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek tablo 3: dedektörü ve SBG konsantrasyon optimizasyonu. Biotinylated dedektörü antikor (0.1, 0.3 ve 0.6 µg/mL) ile birlikte SBG üç farklı konsantrasyonlarda üç farklı konsantrasyonlarda (50, 150 ve 250 pM) değerlendirildi. AEB değerler için dokuz test edilmiş koşullar gösterilmiştir. Turuncu: LOD hesaplaması için kullanılan AEB değerleri; Bu konsantrasyonları sabit kaldı AEB değerleri olarak boş kabul edildi. LOD olarak hesaplanır demek boş + 3SD. olarak <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_3.xlsx">bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek tablo 4: özgüllük ve en iyi duruma getirilmiş IFNα tek molekül dizi tahlil duyarlılığını. Boncuk değeri ortalama enzim otelde IFN β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω ve IFN γ rekombinant proteinler edildi (A), ile birlikte 16 alt türlerinden IFN-α (B) test gösterilir. «-» Belirlenmemiştir. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_4.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek tablo 5: en iyi duruma getirilmiş IFNα tek molekül dizi testin tekrarlanabilirlik. Tüm üç bağımsız çalışan için Ortalama AEB değerleri 10.000 fg/mL konsantrasyonu için gösterilir. «-» Belirlenmemiştir. Doyma (Doy). <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_5.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek tablo 6: Protein rekabet tahlil. Boncuk değeri ortalama enzim test tüm koşulları için gösterilir. Ölçüler içinde yinelenen yapıldı. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_6.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃŽÂ± at JoVE.com

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Burada açıklamak için geliştirme ve insan örneklerinde tüm IFN-α türlerinden Ultra-duyarlı algılama sağlayan bir tek molekül dizi dijital ELISA yöntemi, doğrulama iletişim kuralı mevcut.

Geliştirme ve doğrulama vericiyi bir tek molekül dijital enzim bağlı Immunosorbent Assay insan Interferon-α için dizi

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzim-linked immünospot Testi (ELISPOT): Th-1 Mikrobiyal antijenlere karşı hücresel immün cevaplar Kantitasyonu

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Use of Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Human Papillomavirüs Roman T hücre epitopları Karakterizasyonu için interferon-γ Enzim bağlı immünospot Assay Kullanımı

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pneumoniae ile İntranazal Kolonizasyon Sırasında İnflamatuar Yanıtların Karakterizasyonu

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Sığırlarda Efektör ve hafıza T Hücre Yanıtları değerlendirilmesi için uzun vadeli kültürlü İnterferon-γ Enzim-linked immünospot Testi Uygulaması

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Solunum Sıvılarda equid Herpes-2 Teşhis için bir Nicel PCR Yöntemi Geliştirilmesi ve Validasyonu

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Enzim-linked Lektin Testi tarafından Grip Nöraminidaz İnhibisyon antikor titreleri Ölçme

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...