Name: stomata tape-peel: an improved method for guard cell sample preparation
Uploaded: 2018-07-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation at JoVE.com

ونحن نشكر دانيال تشن من "الرقمية الفيديو إنتاج فريق من بوشهولز المدرسة الثانوية" للمساعدة في تحرير الفيديو. دعمت هذه البحوث stomatal الحرس الخلايا والبروتينات وجميع في مختبر تشن من المنح المقدمة من "لنا المؤسسة الوطنية للعلوم" (0818051 و 1158000 و 1412547). ويدعم "مجلس المنح الدراسية الصيني" كونغ فنون. الدكتور قيوينج بانغ معتمد من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني ومؤسسة العلوم الطبيعية الصينية الوطنية (31570396).

1-زراعة النباتات
<ol><li>تنبت البذور في بوتينغ الخليط. تنمو النباتات في حجرة نمو مع شدة ضوء 140 µmol الفوتونات م2 ق 1 وكبيرة ح 8 الضوء على 22 درجة مئوية و 16 ح الظلام عند 18 درجة مئوية لمدة أسبوعين.</li>
	<li>زرع شتلات أحجام مماثلة على حدة في القطر الأواني 4 "التي تحتوي على التربة وتنمو لمدة 3 أساب...

<ol>
	<li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone+interactions+in+stomatal+function.">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li><li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+cell+signal+transduction.">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li><li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses.">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li><li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+applications+of+Arabidopsis+thaliana+guard+cell+protoplasts.">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li><li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+Dependence+Of+K++Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts.">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li><li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method.">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10 (2009).</li><li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll,+epidermal+and+vascular+tissues.">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li><li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents,+chaotropes,+dyes,+and+reducing+agents.">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laemmli-SDS-PAGE.">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+A+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS+(vol+75,+pg+1895).">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li></ol>

خلايا الحرس نظام نموذجي لدراسة آليات توصيل الإشارات في النباتات ومن المهم التأكد من أن إعداد العينات المستخدمة في هذه الدراسة هو الأكثر ملاءمة للإجابة على الأسئلة البيولوجية. وعلى الرغم من الاهتمام المتزايد بخلايا الحرس داخل مجتمع البحوث النباتية، هناك لا يوجد طريقة عالمية على كيفية إع?...

الثغور دوراً هاما في علم وظائف الأعضاء واللياقة البدنية للنباتات عموما. هذه الهياكل محطة صغيرة محددة يتم تشكيلها من قبل اثنين من خلايا البشرة المتخصصة المعروفة باسم خلايا الحرس وتم العثور على الأكثر وفرة على سطح الأوراق أباكسيال. الثغور ضرورية لتبادل الغازات بين النبات والغلاف الجوي، فضلا عن السيطرة على فقدان الماء عن طريق النتح. تنظيم خلايا الحرس الفتحة الثغور من خلال التكامل الخارجي مختلفة (مثلاً، والضوء، والرطوبة، والممرض الاتصال، مستويات ثاني أكسيد الكربون) والداخلية (على سبيل المثال.، الهرمونات الذاتية) المحفزات1،2. في السنوات العشرين الماضية، أصبح هذا النوع خلية نظام نموذجي لدراسة الخلية إشارات العمليات في مصانع. هذه الخلايا تشكل نسبة ضئيلة من مجموع الخلايا في ورقة؛ وهكذا، للتحقيق على الخلوي فريدة من نوعها، الخصائص الكيميائية الحيوية والجزيئية في طريقة وحيدة الخلية، ومن الضروري أن عزلها عن سائر أنواع خلية ورقة. في الماضي، كثيرا ما شملت الدراسات خلية الحرس إعداد خلية الحرس بروتوبلاستس (GCP)3،،من45. هذا عادة يتطلب استخدام كميات كبيرة من الإنزيمات المهينة جدار الخلية واو تعطل الميكانيكية عن طريق مزج، وقد ثبت أن تكون مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً لأنه يأخذ عادة عدة ساعات لإعداد عينة GCP، كثيرا ما مرات مع العائد القليل. الأهم من ذلك، لأنه بمثابة خلايا الحرس أزواج كاملة لتنظيم الفتحة الثغور، استخدام GCP يمكن اعتبار نظام مصطنع لدراسة مما يشير إلى خلية الحرس.
هنا، قمنا بتطوير أسلوب إعداد الثغور التي هي إثراء سليمة الحرس الخلايا والحفاظ على الاستجابات الفسيولوجية للمنبهات. هذه الطريقة مستوحاة من أسلوب الذي تم استخدامه لعزل mesophyll خلية بروتوبلاستس6،7. في أسلوبنا، تعد الثغور باستخدام واضحة اﻻسكتلندي لأول مرة فصل غالبية الخلايا mesophyll يعلق على طبقة أداكسيال نبات من طبقة أباكسيال التي تحتوي على خلايا الحرس والرصيف. يتم ذلك عن طريق لصق قطعة من الشريط لكل جانب من النبات وتقشير لهم عن بعضها البعض. الخلايا من طبقة أباكسيال يسمح باسترداد تحت الضوء في المخزن مؤقت فتح الثغور. بعد تتم إزالة الخلايا الأرصفة المتبقية باستخدام كمية صغيرة من جدار الخلية اللاإنسانية الإنزيمات، تاركة وراءها الحرس الخلية التي يتم إثراء على الشريط.
في هذه الطريقة البسيطة، خلايا الحرس ستوماتال تكون قابلة للاستمرار وتستجيب بسرعة وكفاءة تكون مستعدة، مع أخذ أقل من ساعة واحدة للحصول على خلايا الحرس ستوماتال المخصب من القشور 50 مع أدنى حد من التكلفة. الأسلوب هنا يفرض أقل ضررا على الخلايا النباتية من الأساليب السابقة حيث يتم إعداد بروتوبلاستس. وباﻹضافة إلى ذلك، المواد التي جمعت من هذا الأسلوب الغلة البروتين المرغوب فيه المبالغ. الأهم من ذلك، لأن الورقة لا تخضع لمزج أو خلايا الحرس وأوقات الهضم طويلة تبقى على حالها، ونتائج الدراسات سوف أوثق تكون ذات الصلة بعلم الأحياء الطبيعية خلية الحرس. مع هذا الأسلوب، يمكن الربط بين حركات stomatal في الوقت الحقيقي مع التغيرات على المستوى الجزيئي. وبالتالي، سيكون من المهم إلى فهم أكثر شمولاً لخلية الحرس مما يشير إلى المعرفة المكتسبة من استخدام هذا الأسلوب في إعداد الدراسات.
كنا النبات نبات التمويل كنموذج؛ ومع ذلك يمكن تطبيق هذا البروتوكول في إثراء stomatal خلايا الحرس في الأنواع النباتية الأخرى مثل نابوس كرنب مع بعض التعديلات الصغيرة في وقت الهضم. كدليل على المفهوم، لقد أظهرنا أن خلايا الحرس ستوماتال المخصب عن طريق هذا الأسلوب ناجعة وسريعة الاستجابة للمحفزات كما هو موضح بمقايسة اسيتات (FDA) fluorescein ودراسات استخدام حمض التسقيط هرمون النبات (ABA)، على التوالي. وباﻹضافة إلى ذلك، أثبتنا أن البروتينات عالية الجودة يمكن أن تكون معزولة من هذه الخلايا الحرس. هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل لهذه العملية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:889px;" width="889">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Stainless Steel Surgical Scalpel</td>
			<td style="width:297px;">Feather&#160;</td>
			<td style="width:119px;">&#160;NC9999403</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Scotch Tape (3M)</td>
			<td style="width:297px;">ULINE</td>
			<td style="width:119px;">S-9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:297px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR455701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cellulase (Onozuka R-10)&#160;</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Macerozyme R-10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DM6000B Microscope&#160;</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;PI78443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3119-0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZQ Protein Quantitation Kit</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescein Diacetate (FDA)</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Abscisic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Metro Mix 500</td>
			<td style="width:297px;">BWI Companies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">TX-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Bio-Safe Comassie (G-250)</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microcentrifuge Tube (2mL)</td>
			<td style="width:297px;">USA Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:297px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tweezers&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4017-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">456-1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:297px;">Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stomata tape-peel: an improved method for guard cell sample preparation

دراسة خلايا الحرس ضروري لمعرفة المساهمات المحددة لهذا النوع من الخلية للدالة الشاملة للنباتات. ومع ذلك، غالباً ما يصعب عزل وهكذا دراستها غالباً ما يوفر تحديا.
تحدد هذه الدراسة أسلوب إثراء stomatal حارس خلية. ويستخدم البروتوكول اﻻسكتلندي لعزل خلايا الحرس واستخراج البروتينات من الخلايا. هذا الأسلوب يحسن السلامة والعائد لحراسة الخلية أثناء العزل وتوفر نموذج موثوق بها لدراسة عمليات إرسال الإشارات في الخلية، وكيفية الربط بين حركة ستوماتال تعمل. في هذا الأسلوب، أوراق النبات تم تقسيمه بين جزأين من الشريط ومقشرة بعيداً لإزالة الجانب أباكسيال. تم تطبيق هذا البروتوكول على أنسجة أوراق نبات لعزل خلايا الحرس. الخلايا تعامل مع فلوريسسين اسيتات (FDA) لتحديد جدوى وحمض التسقيط (ABA) لتقييم حركة الثغور في الاستجابة لرابطة المحامين الأمريكية. وفي الختام، يثبت هذا البروتوكول مفيدة لإعداد خلايا الحرس ستوماتال المخصب وعزل البروتينات. الحصول على نوعية الخلايا والبروتينات هنا تمكين الفسيولوجية والدراسات البيولوجية الأخرى.

صورة تمثيلية لنبات الحرس الخلايا قبل وبعد الهضم mesophyll وخلايا البشرة ويرد في الشكل 1. ويمكن ملاحظة صلاحية خلية الحرس قبل وبعد إزالة mesophyll وخلايا البشرة باستخدام إدارة الأغذية والعقاقير لقياس النشاط الأنزيمي وسلامة غشاء الخلية (الشكل 1 باء و...

Watch this Scientific Journal Video about Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation at JoVE.com

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

هذا البروتوكول وصف أسلوب إعداد خلايا الحرس ستوماتال المخصب مفيد للدراسات البيولوجية الفسيولوجية وغيرها.

الشريط الثغور-التقشير: طريقة محسنة لإعداد نموذج خلية الحرس

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI تحضير العينة : الترا أسلوب طبقة رقيقة

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

التجمع ، والتحميل ، والمحاذاة لخلية نموذج تحليلي نابذة فائقة السرعة

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

الغربية التنشيف : إعداد نموذج لكشف

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

لتحسين طريقة لقياس دقة وسرعة الأداء في الطيران<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

إعداد عينة للفحص المجهري للقوة الذرية Virion واحد والتصوير الفلوري فائقة الدقة

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

تحسين تقنيات السويسري المتداول لإعداد المعوية الأنسجة لالمناعى وتحليلات مناعي

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

إعداد نموذج لتحليل قداس الخلوي

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

طريقة بديلة لإعداد نموذج مع انخفاض عدد الخلايا لتحليل تيم

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

الهجين قطع: طريقة محسنة باجتزاء لعينات الأنسجة النباتية المتمردة

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

نموذج إعداد وتصوير اكسوسوميس مجهر إلكتروني

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...