Name: stomata tape-peel: an improved method for guard cell sample preparation
Uploaded: 2018-07-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation at JoVE.com

Nous remercions Daniel Chen du numérique vidéo Production équipe de Buchholz High School pour l’assistance au montage de la vidéo. Cette recherche sur les cellules de garde des stomates, protéomique et métabolomique dans le laboratoire de Chen a été soutenue par des subventions de la US National Science Foundation (0818051, 1158000 et 1412547). Wenwen Kong est pris en charge par le China Scholarship Council. M. Qiuying Pang est pris en charge par le China Scholarship Council et de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31570396).

1. la culture de plantes
<ol><li>Faire germer les graines dans le mélange de rempotage. Faire pousser des plantes dans une chambre de croissance avec une intensité lumineuse de 140 µmol photons m−2 s −1 et une photopériode de 8 h à 22 ° C et 16 h de lumière sombre à 18 ° C pendant 2 semaines.</li>
	<li>Repiquez les plantules de tailles similaires individuellement dans 4" diamètre pots contenant du sol et de grandir pour 3 semaines dans les mêmes conditions supplémentaires décrits ...

<ol>
	<li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone+interactions+in+stomatal+function.">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li><li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+cell+signal+transduction.">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li><li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses.">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li><li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+applications+of+Arabidopsis+thaliana+guard+cell+protoplasts.">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li><li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+Dependence+Of+K++Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts.">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li><li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method.">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10 (2009).</li><li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll,+epidermal+and+vascular+tissues.">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li><li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents,+chaotropes,+dyes,+and+reducing+agents.">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laemmli-SDS-PAGE.">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+A+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS+(vol+75,+pg+1895).">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li></ol>

Les cellules de garde sont un système modèle pour l’étude des mécanismes de transduction de signal dans les plantes et il est important de veiller à ce que la préparation des échantillons utilisés dans l’étude est la plus appropriée pour répondre à des questions biologiques. Malgré l’intérêt croissant pour les cellules de garde au sein de la communauté de recherche plante, il n’y a aucune méthode universelle sur comment préparer les cellules stomatiques stomatiques qui permettrait à la fois le ...

Stomates jouent un rôle important dans la physiologie et la remise en forme de plantes ensemble. Ces structures spécifiques de plantes minuscules sont formés par deux cellules épidermiques spécialisées appelées cellules stomatiques et sont trouvent plus abondamment sur la face abaxiale des feuilles. Stomates sont nécessaires pour l’échange de gaz entre la plante et l’atmosphère, ainsi que le contrôle des pertes d’eau par transpiration. Réglementer les cellules stomatiques ouverture des stomates grâce à l’intégration de différent externe (par exemple, lumière, humidité, contact de l’agent pathogène, des niveaux de dioxyde de carbone) et internes (p. ex.., hormones endogènes) stimuli1,2. Au cours des 20 dernières années, ce type de cellule est devenu un système modèle pour étudier cellule signalisation processus chez les plantes. Ces cellules forment une petite fraction des cellules totales dans une feuille ; ainsi, afin d’étudier leur cellulaire unique, les propriétés biochimiques et moléculaires d’une manière unicellulaires, il faut les isoler des autres types de cellules de feuille. Dans le passé, études des cellules de garde ont souvent impliqué la préparation des cellules de garde des protoplastes (GCP)3,4,5. Typiquement, cela nécessite l’utilisation de grandes quantités d’enzymes dégradant la paroi cellulaire et ou rupture mécanique par mélange et a prouvé d’être coûteux et fastidieux car il faut généralement plusieurs heures pour préparer un échantillon GCP, souvent de fois avec peu de rendement. Plus important encore, parce que les cellules de garde agissent comme des paires complètes pour réguler l’ouverture des stomates, l’utilisation des BPC peut considérer comme un système artificiel à l’étude de la signalisation des cellules de garde.
Ici, nous avons développé une méthode pour préparer des stomates dans lequel les cellules de garde intactes sont enrichis et maintenir les réactions physiologiques aux stimuli. Cette méthode s’inspire d’une méthode qui a permis d’isoler du mésophylle cellule protoplastes6,7. Dans notre méthode, les stomates sont préparés selon claire ruban Scotch pour séparer tout d’abord la majorité des cellules du mésophylle jointe à la couche adaxiale de la feuille de la couche abaxiale contenant les chaussées et les cellules stomatiques. Cela se fait par l’apposition d’un morceau de ruban de chaque côté de la feuille et les peeling appart. Les cellules de la couche abaxiale sont autorisés à récupérer sous la lumière dans un tampon de l’ouverture des stomates. Plus tard, les cellules restantes de la chaussée sont supprimés à l’aide d’une petite quantité d’enzymes, laissant derrière elle des cellules de garde qui s’enrichissent sur la bande de dégradant les parois cellulaires.
Dans cette méthode simple, stomatiques cellules stomatiques qui soient viables et adaptés peuvent rapidement et efficacement être prêt, en moins d’une heure pour obtenir des cellules de garde des stomates enrichis de 50 peelings avec un coût minime. La méthode ici impose moins de dommages aux cellules végétales que les méthodes précédentes où sont préparés les protoplastes. En outre, les matières recueillies de cette méthode rendement protéines souhaitable s’élève. Surtout, parce que la feuille n’est pas soumise à la fusion ou temps de digestion longue et cellules stomatiques sont intacts, les résultats d’études sera plus étroitement des celui de la garde physique biologie d’une cellule. Avec cette méthode, stomatiques mouvements peuvent être reliées en temps réel à des changements au niveau moléculaire. Ainsi, les connaissances acquises grâce à des études à l’aide de cette méthode de préparation serait important pour une compréhension plus complète de la signalisation des cellules de garde.
Nous avons utilisé la plante Arabidopsis thaliana comme modèle ; Toutefois, le présent protocole peut être appliqué à l’enrichissement de stomatiques cellules stomatiques chez d’autres espèces végétales telles que Brassica napus avec de petites modifications dans le temps de digestion. Comme une preuve de concept, nous avons démontré que stomatiques cellules stomatiques, enrichis par l’intermédiaire de cette méthode sont viables et réactif aux stimuli comme indiqué par le dosage de fluorescéine diacétate (FDA) et les études utilisant l’hormone végétale l’acide abscissique (ABA), respectivement. En outre, nous avons démontré que les protéines de haute qualité peuvent être isolés dans ces cellules stomatiques. Nous décrivons ici un protocole détaillé de ce processus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:889px;" width="889">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Stainless Steel Surgical Scalpel</td>
			<td style="width:297px;">Feather&#160;</td>
			<td style="width:119px;">&#160;NC9999403</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Scotch Tape (3M)</td>
			<td style="width:297px;">ULINE</td>
			<td style="width:119px;">S-9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:297px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR455701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cellulase (Onozuka R-10)&#160;</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Macerozyme R-10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DM6000B Microscope&#160;</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;PI78443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3119-0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZQ Protein Quantitation Kit</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescein Diacetate (FDA)</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Abscisic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Metro Mix 500</td>
			<td style="width:297px;">BWI Companies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">TX-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Bio-Safe Comassie (G-250)</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microcentrifuge Tube (2mL)</td>
			<td style="width:297px;">USA Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:297px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tweezers&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4017-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">456-1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:297px;">Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stomata tape-peel: an improved method for guard cell sample preparation

L’étude des cellules stomatiques est essentiel à la connaissance des apports spécifiques de ce type de cellule à la fonction globale de plantes. Toutefois, il est souvent difficile d’isoler, et donc les étudier souvent fournit un défi.
Cette étude établit une méthode d’enrichissement stomatique cellules de garde. Le protocole utilise le ruban Scotch pour isoler les cellules stomatiques et extraire des protéines des cellules. Cette méthode améliore l’intégrité et le rendement des cellules de garde lors de l’isolation et fournit un échantillon fiable pour l’étude des processus de signalisation cellulaire et comment elles sont corrélées aux phénotypes mouvement stomatique. Dans cette méthode, les feuilles de la plante ont été partitionnés entre deux portions de la bande et pelées part pour retirer la face abaxiale. Ce protocole a été appliqué aux tissus foliaires Arabidopsis pour isoler les cellules stomatiques. Les cellules ont été traitées avec la fluorescéine diacétate (FDA) pour déterminer la viabilité et l’acide abscissique (ABA) pour évaluer le mouvement des stomates en réponse à ABA. En conclusion, le présent Protocole s’avère utile pour la préparation des cellules de garde des stomates enrichis et isoler des protéines. La qualité des protéines et cellules obtenus ici activation physiologique et autres études biologiques.

Une image représentative des cellules stomatiques Arabidopsis avant et après que la digestion du mésophylle et des cellules épidermiques est illustrée à la Figure 1. La viabilité des cellules de garde avant et après l’enlèvement du mésophylle et les cellules épidermiques peut être observée à l’aide de FDA pour mesurer l’activité enzymatique et l’intégrité de la membrane cellulaire (Figure 1 b et 1...

Watch this Scientific Journal Video about Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation at JoVE.com

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

Ce protocole décrit une méthode de préparation des cellules de garde des stomates enrichis qui est utile pour des études biologiques physiologiques et autres.

Stomates Tape-Peel : Une méthode améliorée pour la préparation d’échantillons de cellules de garde

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

Préparation des échantillons MALDI: la méthode de la couche ultra mince

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Recherche

Biologie

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Assemblée, de chargement, et l&#39;alignement d&#39;une cellule échantillon ultracentrifugation analytique

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western Blot: préparation d&#39;échantillons à la détection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Une méthode améliorée pour la mesure précise et rapide des performances de vol en<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Préparation d’échantillons pour la microscopie à force atomique à virion unique et l’imagerie par fluorescence à super-résolution

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Amélioration Technique Swiss-laminage pour la préparation Intestinal des tissus pour immunohistochimique et immunofluorescence Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Préparation d&#39;échantillons pour l&#39;analyse de masse Cytométrie

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Une approche alternative pour la préparation de l&#39;échantillon avec une faible Nombre de cellules d&#39;analyse TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Hybrid-Cut: Une méthode Sectionnement améliorée pour les échantillons de tissus végétaux récalcitrantes

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Préparation des échantillons et l’imagerie des Exosomes par microscopie électronique à Transmission

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...