Name: stomata tape-peel: an improved method for guard cell sample preparation
Uploaded: 2018-07-15T13:00:00
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우리는 다니엘 첸에서 디지털 영상 제작 팀의 벅 홀 고등학교 동영상 편집에 감사 합니다. Stomatal 가드 셀 proteomics, metabolomics 첸 실험실에서에이 연구는 미국 국립 과학 재단 (0818051, 1158000 및 1412547)에서 교부 금에 의해 지원 되었습니다. Wenwen 홍콩 중국 장학금 위원회에 의해 지원 됩니다. 박사 Qiuying Pang 중국 장학금 위원회 국가 자연 과학 재단의 중국 (31570396)에 의해 지원 됩니다.

1. 성장 하는 식물
<ol><li>Potting 혼합물에 씨를 출 아 할. 식물 성장 성장 챔버에 140 µmol 광자 m−2의 − 1 의 광도와 22 ° C 및 16 h 8 h 조명의 photoperiod 어두운 18 ° C에서 2 주 동안.</li>
	<li>4"직경 남 비는 토양을 포함으로 개별적으로 비슷한 크기의 묘를 이식 하 고 성장 단계 1.1에서에서 설명 하는 추가 동일한 조건에서 3 주. 참고: 습 한 토양을 유지 하는 일주일에 두 번 수돗물 식?...

<ol>
	<li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone+interactions+in+stomatal+function.">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li><li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+cell+signal+transduction.">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li><li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses.">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li><li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+applications+of+Arabidopsis+thaliana+guard+cell+protoplasts.">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li><li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+Dependence+Of+K++Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts.">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li><li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method.">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10 (2009).</li><li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll,+epidermal+and+vascular+tissues.">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li><li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents,+chaotropes,+dyes,+and+reducing+agents.">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laemmli-SDS-PAGE.">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+A+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS+(vol+75,+pg+1895).">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li></ol>

가드 셀 모델 시스템 식물에서 신호 전달 메커니즘 연구 이며 연구에 사용 하는 샘플의 준비는 생물학 질문에 가장 적합 한 보장 하는 것이 중요 하다. 식물 연구 지역 사회 내에서 가드 셀에 증가 관심에도 불구 하 고 보편적인 메서드는 stomatal 운동 및 생리학 있도록 stomatal 가드 셀을 준비 하는 방법에 대 한 공부 분자 변화 뿐만 아니라 시스템입니다. 그들을 도전 많은 부분에서 그들의 작은 크기...

Stomata 전반적인 생리학과 식물의 적합성에 중요 한 역할을 한다. 이 작은 식물 특정 구조 가드 셀으로 알려진 두 전문된 상피 세포에 의해 형성 되 고 잎의 abaxial 표면에 가장 풍부 하 게 발견 된다. Stomata가 식물 및 분위기,으로 물 증발을 통해 손실 컨트롤 사이 가스의 교환에 대 한 필요 합니다. 가드 셀 (예를 들어, 빛, 습도, 병원 체 접촉, 이산화탄소 수준) 다른 외부의 통합을 통해 stomata 조리개 조절 및 내부 (예., 내 생 호르몬) 자극1,2. 지난 20 년 동안에이 세포 유형은 식물에서 프로세스 신호 공부 셀 모델 시스템 되고있다. 이러한 셀 리프; 총 셀의 작은 분수를 만들 따라서, 그들의 독특한 휴대 조사, 생 화 학적 및 분자 속성 단일 셀 방식으로, 그것은 다른 리프 셀 종류에서 그들을 격리 하는 데 필요한. 과거, 가드 셀 연구는 자주 참여 하고있다 가드 셀 protoplasts (GCP)3,,45의 준비. 이 일반적으로 많은 양의 세포 벽 타락 효소 및 또는 혼합을 통해 기계적 장애를 사용 해야 합니다 그리고 작은 수익률 시간 일반적으로 자주 GCP 샘플을 준비 하는 데 많은 시간이 소요 비용과 시간이 많이 소요 될 입증. 더 중요 한 것은, 가드 셀 stomata 조리개를 조절 하는 완전 한 쌍으로, 행동 하기 때문에 GCP 사용 하 여 가드 셀 신호를 공부 하 고 인공 시스템으로 볼 수 있습니다.
여기, 우리는 그대로 가드 셀 풍성 하 게 하 고 자극에 생리 적인 응답을 유지 stomata를 준비 하는 방법을 개발 했습니다. 이 메서드는 mesophyll 셀 protoplasts6,7를 분리 하는 데 사용 된 방법에 의해 영감을 했다. 우리의 방법에 stomata 투명 스카치 테이프를 먼저 mesophyll 세포의 대부분을 분리 포장과 가드 셀을 포함 하는 abaxial 계층에서 잎의 adaxial 레이어에 연결을 사용 하 여 준비가 되어 있습니다. 이 잎의 각 측에 테이프의 조각을 추가 하 고 그들을 떨어져 필 링을 하면 됩니다. Abaxial 계층에서 셀 광원 stomata 오프닝 버퍼에서 복구할 수 있습니다. 후 나머지 포장도 세포의 세포 벽 타락 효소, 테이프에 가드 셀을 풍성 하 게 뒤에 남겨두고 소량을 사용 하 여 제거 됩니다.
이 간단한 방법에서는, stomatal 가드 셀 실용적이 고 반응 수 신속 하 게 그리고 효율적으로 준비, 농축된 stomatal 가드 세포를 최소의 비용으로 50 껍질에서 1 시간 이내에 복용. 여기에 메서드 protoplasts 준비는 이전 방법 보다는 식물 세포에 더 적은 손상을 부과 했다. 또한, 재료는이 방법은 수율 바람직한 단백질 금액에서 수집. 가장 중요 한 것은, 잎 혼합 대상이 되지 않습니다, 긴 소화 시간과 가드 셀 그대로 유지 하기 때문에 연구의 결과 더 밀접 하 게 가드 셀의 자연적인 생물학의 관련이 있을 것입니다. 이 방법으로 분자 수준에서 변경 stomatal 움직임 실시간에서 상관 수 있다. 따라서,이 준비 메서드를 사용 하 여 연구에서 얻은 지식을 가드 셀 신호에 대 한 보다 포괄적인 이해에 대 한 중요 한 것입니다.
우리 모델; 식물 애기 thaliana 사용 그러나이 프로토콜을 소화 시간에 작은 수정 stomatal 가드 셀 브라 시카 napus 등 다른 식물 종에의 농축에 적용할 수 있습니다. 개념의 증거로 서 우리는이 방법을 통해 농축 stomatal 가드 세포는 가능한 fluorescein diacetate (FDA) 분석 결과 각각 식물 호르몬 abscisic 산 (ABA)를 이용 하 여 연구에 의해 표시 된 것 처럼 자극에 반응 증명 하고있다. 또한, 우리는 높은-품질 단백질이 가드 셀에서 고립 될 수 있다 증명 하고있다. 여기, 우리는이 과정의 상세한 프로토콜을 설명합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:889px;" width="889">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Stainless Steel Surgical Scalpel</td>
			<td style="width:297px;">Feather&#160;</td>
			<td style="width:119px;">&#160;NC9999403</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Scotch Tape (3M)</td>
			<td style="width:297px;">ULINE</td>
			<td style="width:119px;">S-9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:297px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR455701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cellulase (Onozuka R-10)&#160;</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Macerozyme R-10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DM6000B Microscope&#160;</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;PI78443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3119-0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZQ Protein Quantitation Kit</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescein Diacetate (FDA)</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Abscisic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Metro Mix 500</td>
			<td style="width:297px;">BWI Companies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">TX-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Bio-Safe Comassie (G-250)</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microcentrifuge Tube (2mL)</td>
			<td style="width:297px;">USA Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:297px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tweezers&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4017-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">456-1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:297px;">Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stomata tape-peel: an improved method for guard cell sample preparation

가드 셀의 연구의 식물의 전반적인 기능에이 세포 유형은 특정 기부금의 지식에 근본적 이다. 그러나, 그것은 종종 어려운 분리 하 고 도전을 제공 따라서 종종 그들을 공부.
이 연구는 stomatal 가드 세포 농축 방법을 설정합니다. 프로토콜 가드 세포를 분리 하 고 세포에서 단백질을 추출에 스카치 테이프를 사용 합니다. 이 방법은 무결성과 가드 셀의 수익률 격리 중 향상과 세포 신호 프로세스와 어떻게 그들이 stomatal 운동 고기 연관의 연구에 대 한 신뢰할 수 있는 샘플을 제공 합니다. 이 방법에서는, 식물 잎 테이프의 두 부분 사이 분할 되었고 abaxial 쪽 제거를 떨어져 벗 겨. 이 프로토콜은 가드 셀을 애기 잎 조직에 적용 되었다. Fluorescein diacetate 생존 능력을 결정 하는 (FDA)와 abscisic 산 (ABA) stomata 운동 ABA에 대 한 응답에서을 평가 하는 세포 치료 했다. 결론적으로,이 프로토콜 증명 농축된 stomatal 가드 셀을 준비 하 고 단백질을 분리 하는 데 유용 합니다. 세포와 단백질의 품질 얻을 여기 생리 및 다른 생물학 연구.

대표 이미지 전에 애기 가드 셀의 전후 mesophyll와 표 피 세포의 소화 그림 1에 표시 됩니다. 효소 활동 및 세포 막의 무결성 (그림 1B 및 1 D)를 측정 하는 FDA를 사용 하 여 mesophyll와 표 피 세포의 제거 전후 가드 세포 생존 능력을 관찰할 수 있습니다. 그림 2 는 stomatal 운동의 애기 ABA 치료에 대 한 ...

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Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

이 프로토콜 생리 및 다른 생물학 학문을 위한 유용한 풍부한 stomatal 가드 셀 준비의 방법을 설명 합니다.

Stomata 테이프-껍질: 가드 셀 샘플 준비에 대 한 개선된 방법

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

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