Name: stomata tape-peel: an improved method for guard cell sample preparation
Uploaded: 2018-07-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation at JoVE.com

Мы благодарим Даниэль Чэнь от цифрового видео производства команда Бухгольц высшей школы для помощи в редактировании видео. Это исследование на устьичную гвардии клетки, протеомики и метаболомики в лаборатории Чэнь была поддержана грантов от нас национального научного фонда (0818051, 1158000 и 1412547). Wenwen Kong поддерживается Советом стипендии Китая. Д-р Qiuying Пан поддерживается Советом стипендии Китая и национального фонда естественных наук Китая (31570396).

1. Выращивание растений
<ol><li>Прорастают семена в заливки смеси. Растут растения в камере роста с интенсивностью освещения 140 мкмоль фотоны m−2 s −1 и фотопериода 8 h света при 22 ° C и 16 h темной при 18 ° C в течение 2 недель.</li>
	<li>Трансплантировать сеянцы аналогичных размеров индиви...

<ol>
	<li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone+interactions+in+stomatal+function.">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li><li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+cell+signal+transduction.">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li><li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses.">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li><li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+applications+of+Arabidopsis+thaliana+guard+cell+protoplasts.">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li><li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+Dependence+Of+K++Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts.">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li><li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method.">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10 (2009).</li><li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll,+epidermal+and+vascular+tissues.">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li><li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents,+chaotropes,+dyes,+and+reducing+agents.">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laemmli-SDS-PAGE.">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+A+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS+(vol+75,+pg+1895).">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li></ol>

Гвардии клетки являются модель системы для изучения механизмы трансдукции сигнала в растениях, и важно обеспечить наиболее подходящий ответ на биологические вопросы подготовки проб, используемых в исследовании. Несмотря на растущий интерес к гвардии клеток в рамках исследовательско...

Устьиц играют важную роль в общей физиологии и фитнес растений. Эти крошечные завод конкретные структуры формируются две специализированные клетки эпидермиса, известный как охранник клетки и наиболее обильно находятся на abaxial поверхности листьев. Устьиц необходимы для обмен газов между завода и атмосферы, а также контроль за потери воды за счет транспирации. Гвардии клетки регулируют устьиц диафрагмы путем интеграции различных внешних (например, света, влажности, возбудитель контакт, уровни углекислого газа) и внутренние (например., эндогенных гормонов) раздражители1,2. За последние 20 лет этот тип ячейки стала модель системы для изучения ячейки сигнализации процессы в растениях. Эти клетки составляют небольшую долю общего числа клеток в листа; Таким образом расследовать их уникальных сотовых, биохимических и молекулярных свойств в виде одноклеточных, необходимо изолировать их от других типов клетки листа. В прошлом гвардии клетки исследования часто связан с подготовкой гвардии клеток протопласта (GCP)3,4,5. Это обычно требует использования большого количества унижающих достоинство ферменты клеточной стенки, и или механические нарушения через смешивания и оказалось, чтобы быть дорогостоящим и трудоемким, поскольку он обычно занимает много времени, чтобы подготовить образец GCP, часто раз с маленькой доходности. Что еще более важно потому что гвардии клетки действуют в качестве полной пары регулировать устьиц диафрагмы, использование GCP можно рассматривать как искусственные системы для изучения клеток гвардии сигнализации.
Здесь мы разработали метод подготовить устьиц, в которых нетронутыми гвардии клетки обогащаются и сохранять физиологические реакции на раздражители. Этот метод был вдохновлен метод, который был использован для изолировать мезофилл клеток протопласта6,7. В нашем методе устьиц готовятся с использованием четких Скотч сначала отделить большинство клеток мезофилл придает adaxial слой листьев от abaxial слой, содержащий тротуар и гвардии клетки. Это делается путем проставления кусок ленты на каждой стороне листа и пилинг их друг от друга. Клетки из abaxial слоя разрешается взять под свет в буфере устьиц открытия. Позже оставшиеся тротуар клетки удаляются с помощью небольшого количества клеточной стенки, унижающего достоинство ферментов, оставив позади гвардии ячейку, обогащаются на ленте.
В этой простой метод устьичного гвардии клетки, которые являются жизнеспособной и гибкой можно быстро и эффективно быть готовым, принимая менее чем за час для получения обогащенного устьиц клеток гвардии из 50 пилинг с минимальными затратами. Этот метод предусматривает меньший ущерб для растительных клеток, чем предыдущие методы, где готовят протопласта. Кроме того материалы собраны из этого метода доходности желательно белка сумм. Самое главное потому что лист не подвергается смешивания или длительных пищеварение раз и гвардии клетки остаются нетронутыми, результаты исследований более тесно будет отношение к естественной биологии клетки гвардии. С помощью этого метода можно соотнести устьичных движений в реальном времени с изменениями на молекулярном уровне. Таким образом знания, полученные от исследований с использованием этого метода подготовки бы важное значение для более полного понимания гвардии клеток сигнализации.
Мы использовали растение Arabidopsis thaliana как модель; Однако этот протокол может применяться к обогащению устьиц клеток гвардии в других видов растений, таких как рапс с небольшими изменениями в время пищеварения. Как доказательство концепции мы продемонстрировали, что устьичного гвардии клетки, обогащенный через этот метод жизнеспособным и реагировать на раздражители, как показано на флуоресцеин диацетат (FDA) анализа и исследований с использованием абсцизовой кислоты растительный гормон (ABA), соответственно. Кроме того мы продемонстрировали, что высококачественные белки могут быть изолированы от этих клеток гвардии. Здесь мы описываем подробный протокол этого процесса.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:889px;" width="889">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Stainless Steel Surgical Scalpel</td>
			<td style="width:297px;">Feather&#160;</td>
			<td style="width:119px;">&#160;NC9999403</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Scotch Tape (3M)</td>
			<td style="width:297px;">ULINE</td>
			<td style="width:119px;">S-9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:297px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR455701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cellulase (Onozuka R-10)&#160;</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Macerozyme R-10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DM6000B Microscope&#160;</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;PI78443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3119-0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZQ Protein Quantitation Kit</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescein Diacetate (FDA)</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Abscisic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Metro Mix 500</td>
			<td style="width:297px;">BWI Companies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">TX-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Bio-Safe Comassie (G-250)</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microcentrifuge Tube (2mL)</td>
			<td style="width:297px;">USA Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:297px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tweezers&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4017-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">456-1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:297px;">Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stomata tape-peel: an improved method for guard cell sample preparation

Исследование клеток охранник имеет важное значение для знания конкретного вклада этого типа ячейки для общей функции растений. Однако часто бывает сложно изолировать и таким образом, изучая их часто обеспечивает вызов.
Это исследование определяет метод обогащения устьиц клеток гвардии. Протокол использует Скотч изолировать гвардии клетки и извлечения белков из клеток. Этот метод улучшает целостность и доходность гвардии ячейки во время изоляции и обеспечивает надежную образец для изучения клеточных сигналов процессов и как они связаны с устьичного движение фенотипов. В этом методе листья растений были разделены между двумя частями ленты и очищенные врозь, чтобы удалить abaxial сторону. Этот протокол был применен к листовой ткани Arabidopsis изолировать гвардии клеток. Клетки относились с флуоресцеин диацетат (FDA) для определения жизнеспособности и абсцизовой кислоты (АБА) для оценки движения устьиц в ответ на ABA. В заключение этот протокол окажется полезным для подготовки обогащенного устьиц клеток гвардии и изоляции белков. Качество клеток и белков получил здесь включить физиологические и другие биологические исследования.

Представитель изображение Arabidopsis гвардии клеток до и после переваривание мезофилл и эпидермальных клеток показана на рисунке 1. Жизнеспособность клеток гвардии до и после удаления мезофилл и эпидермальных клеток можно наблюдать с помощью FDA для измер?...

Watch this Scientific Journal Video about Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation at JoVE.com

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

Этот протокол описывает метод подготовки обогащенного устьиц клеток гвардии, которая является полезной для физиологических и биологических исследований.

Устьиц ленты пил: Усовершенствованный метод для пробоподготовки гвардии ячейки

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI пробоподготовки: ультра тонкий слой Метод

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Ассамблея, Загрузка и согласование аналитической сотовый Пример ультрацентрифуге

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Вестерн-блоттинг: Подготовка образцов для обнаружения

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Усовершенствованный метод точного и быстрого Измерение Flight Performance в<em&gt; Дрозофилы</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Подготовка образцов для одной микроскопии атомной силы Virion и флуоресценции супер-разрешения

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Улучшенная техника швейцарско-прокатка для Кишечные Подготовка ткани для иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного анализов

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Подготовка проб для анализа Масс-цитометрии

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Альтернативный подход к Подготовка проб с низкой Количество сотовых для анализа ПЭМ

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Гибрид-Cut: улучшенный Секционирование Метод непокорных растительных образцов тканей

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Подготовка образцов и изображений Exosomes, просвечивающей электронной микроскопии

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...