Name: stomata tape-peel: an improved method for guard cell sample preparation
Uploaded: 2018-07-15T13:00:00
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Agradecemos a Daniel Chen de la Digital Video producción equipo de Buchholz High School secundaria para la asistencia en la edición de vídeo. Esta investigación sobre las células estomáticos de guardia, la proteómica y la metabolómica en el laboratorio de Chen ha sido apoyada por becas de la Fundación Nacional de ciencia (0818051, 1158000 y 1412547). Wenwen Kong es apoyado por el Consejo de becas de China. Dr. Qiuying Pang es apoyado por el Consejo de becas de China y la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (31570396).

1. cultivo de plantas
<ol><li>Germinar las semillas en macetas la mezcla. Crecen las plantas en una cámara de crecimiento con una intensidad de luz de 140 μmol fotones m−2 s −1 y un fotoperíodo de luz de 8 h a 22 ° C y 16 h oscuro a 18 ° C durante 2 semanas.</li>
	<li>Trasplante de plántulas de tamaños similares individualmente macetas de 4" de diámetro que contiene el suelo y crecer para 3 semanas en las mismas condiciones adicionales describen en el paso 1.1. Nota: Regar plantas c...

<ol>
	<li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone+interactions+in+stomatal+function.">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li><li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+cell+signal+transduction.">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li><li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses.">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li><li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+applications+of+Arabidopsis+thaliana+guard+cell+protoplasts.">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li><li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+Dependence+Of+K++Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts.">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li><li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method.">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10 (2009).</li><li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll,+epidermal+and+vascular+tissues.">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li><li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents,+chaotropes,+dyes,+and+reducing+agents.">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laemmli-SDS-PAGE.">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+A+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS+(vol+75,+pg+1895).">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li></ol>

Protector de las células son un sistema modelo para estudiar los mecanismos de transducción de señal en las plantas y es importante asegurar que la preparación de las muestras utilizadas en el estudio es el más apropiado para responder a cuestiones biológicas. A pesar del creciente interés en las células de guardia dentro de la comunidad de investigación de la planta, no hay ningún método universal de cómo preparar células estomáticos de protector que permita el movimiento estomático y la fisiología así ...

Estomas juegan un papel importante en la fisiología general y la aptitud de plantas. Estas estructuras específicas de la pequeña planta están formadas por dos células epidérmicas especializadas conocidas como células de guardia y se encuentran más abundantemente en la superficie abaxial de las hojas. Estomas son necesarios para el intercambio de gases entre la planta y la atmósfera, así como el control de la pérdida de agua por transpiración. Protector de las células regulan la abertura de estomas a través de la integración de diferentes externo (por ejemplo, luz, humedad, contacto del patógeno, los niveles de dióxido de carbono) e internas (ej., las hormonas endógenas) estímulos1,2. En los últimos 20 años, este tipo de célula se ha convertido en un sistema modelo para estudiar la célula señalización de procesos en plantas. Estas células constituyen una pequeña fracción de las células totales en una hoja; por lo tanto, para investigar su celular único, propiedades bioquímicas y moleculares en forma unicelular, es necesario aislarlos de otros tipos de células de la hoja. En el pasado, protector celular estudios han implicado a menudo la preparación de guardia celular protoplastos (GCP)3,4,5. Esto normalmente requiere el uso de grandes cantidades de enzimas degradantes de la pared celular y o disrupción mecánica mediante mezcla y ha demostrado ser costosa y desperdiciadora de tiempo que generalmente toma muchas horas para preparar una muestra GCP, a menudo veces con poco rendimiento. Más importante aún, porque guarda células actúan como pares completados para regular la abertura de estomas, el uso de BPC puede verse como un sistema artificial para estudiar la señalización de las células del protector.
Aquí, hemos desarrollado un método para preparar los estomas en la que las células intactas de guardia se enriquecen y mantener respuestas fisiológicas a los estímulos. Este método fue inspirado por un método que se utilizó para aislar células de mesófilo protoplastos6,7. En nuestro método, los estomas se preparan con clara cinta Scotch primero separar la mayoría de las células del mesófilo acoplado a la capa adaxial de la hoja de la capa abaxial con el pavimento y las células de guardia. Esto se hace por poner un trozo de cinta a cada lado de la hoja y pelarlos aparte. Las células de la capa abaxial pueden recuperar bajo la luz en un búfer de apertura de estomas. Más tarde se eliminan las células restantes del pavimento con una pequeña cantidad de pared celular, degradación de las enzimas, dejando atrás el protector de la célula que se enriquecen en la cinta.
En este sencillo método, estomáticos protector células viables y sensible puede rápidamente y eficientemente Prepárate, toma menos de una hora para obtener células de guardia estomáticos enriquecidas de 50 cáscaras con un coste mínimo de. El método aquí impone menos daño a las células de la planta que los métodos anteriores donde se preparan los protoplastos. Además, los materiales recogieron de esta cantidad de proteína accesible método rendimiento. Lo más importante, porque la hoja no se somete a fusión o tiempos de digestión larga y protector de las células permanecen intactas, los resultados de estudios más de cerca será relevantes a la biología natural protector de la célula. Con este método, movimientos estomáticos pueden correlacionarse en tiempo real con cambios a nivel molecular. Así, el conocimiento obtenido de los estudios utilizando este método de preparación sería importante para una comprensión más completa de señalización celular de guardia.
Se utilizó la planta thaliana de Arabidopsis como modelo; sin embargo, este protocolo puede aplicarse para el enriquecimiento de células estomáticos de guardia en otras especies de plantas como Brassica napus con pequeñas modificaciones en el tiempo de digestión. Como una prueba de concepto, hemos demostrado que las células de guardia estomáticos enriquecidas a través de este método son viables y en respuesta a estímulos como se muestra por la fluoresceína diacetato (FDA) análisis y estudios de utilización del hormona de la planta el ácido abscísico (ABA), respectivamente. Además, hemos demostrado que las proteínas de alta calidad pueden ser aisladas de estas células del protector. Aquí, describimos un protocolo detallado de este proceso.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:889px;" width="889">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Stainless Steel Surgical Scalpel</td>
			<td style="width:297px;">Feather&#160;</td>
			<td style="width:119px;">&#160;NC9999403</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Scotch Tape (3M)</td>
			<td style="width:297px;">ULINE</td>
			<td style="width:119px;">S-9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:297px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR455701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cellulase (Onozuka R-10)&#160;</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Macerozyme R-10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DM6000B Microscope&#160;</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;PI78443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3119-0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZQ Protein Quantitation Kit</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescein Diacetate (FDA)</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Abscisic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Metro Mix 500</td>
			<td style="width:297px;">BWI Companies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">TX-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Bio-Safe Comassie (G-250)</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microcentrifuge Tube (2mL)</td>
			<td style="width:297px;">USA Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:297px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tweezers&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4017-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">456-1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:297px;">Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stomata tape-peel: an improved method for guard cell sample preparation

El estudio de las células del protector es esencial para el conocimiento de las contribuciones específicas de este tipo de células a la función general de las plantas. Sin embargo, a menudo es difícil aislar y así estudiarlos a menudo proporciona un desafío.
Este estudio establece un método de enriquecimiento de célula estomática de guardia. El protocolo utiliza cinta adhesiva para aislar células de guardia y extracto de proteínas de las células. Este método mejora la integridad y el rendimiento de protector de la célula durante el aislamiento y ofrece una muestra fiable para el estudio de procesos de señalización celular y cómo correlacionan con fenotipos movimiento estomático. En este método, las hojas de la planta fueron repartidas entre dos porciones de la cinta y peladas aparte para quitar el lado abaxial. Este protocolo se aplicó en tejido foliar de Arabidopsis para aislar células del protector. Las células fueron tratadas con fluoresceína diacetato (FDA) para determinar la viabilidad y el ácido abscísico (ABA) para evaluar el movimiento de los estomas en respuesta a ABA. En conclusión, este protocolo resulta útil para la preparación enriquecida de las células de guardia estomáticos y aislamiento de proteínas. La calidad de las células y las proteínas aquí obtenidos permiten fisiológico y otros estudios biológicos.

Una imagen representativa de Arabidopsis protector de las células antes y después de la digestión del mesófilo y las células epidérmicas se muestra en la figura 1. Viabilidad de las células del protector antes y después del retiro del mesófilo y las células epidérmicas puede observarse con la FDA para medir la actividad enzimática y la integridad de la membrana de la célula (figura 1B y 1D). <strong ...

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Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

Este protocolo describe un método de preparación enriquecida de las células de guardia estomáticos que es útil para estudios fisiológicos y otros biológicos.

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