Name: stomata tape-peel: an improved method for guard cell sample preparation
Uploaded: 2018-07-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation at JoVE.com

Vi tackar Daniel Chen från Digital Video produktion Team av Buchholz högstadiet för hjälp med att redigera video. Denna forskning på stomatala guard celler, proteomik och metabolomik i Chen labbet har fått stöd genom bidrag från oss National Science Foundation (0818051, 1158000 och 1412547). Wenwen Kong stöds av Kina stipendium rådet. Dr. Qiuying Pang stöds av Kina stipendium rådet och National Natural Science Foundation Kina (31570396).

1. plantor
<ol><li>Gro fröna i krukväxtjord blandning. Odla växter i en tillväxt kammare med en ljusintensitet 140 µmol fotoner m−2 s −1 och en fotoperiod 8 h ljus vid 22 ° C och 16 h mörkt vid 18 ° C i 2 veckor.</li>
	<li>Fröplantorna av liknande storleksanpassar individuellt 4 ”diameter krukor som innehåller smutsa och växa ytterligare-3 veckor på samma villkor som beskrivs i steg 1,1. Obs: Vatten växter med kranvatten två gånger i veckan för att hålla jorden fuktig.</l...

<ol>
	<li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone+interactions+in+stomatal+function.">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li><li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+cell+signal+transduction.">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li><li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses.">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li><li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+applications+of+Arabidopsis+thaliana+guard+cell+protoplasts.">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li><li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+Dependence+Of+K++Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts.">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li><li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method.">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10 (2009).</li><li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll,+epidermal+and+vascular+tissues.">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li><li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents,+chaotropes,+dyes,+and+reducing+agents.">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laemmli-SDS-PAGE.">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+A+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS+(vol+75,+pg+1895).">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li></ol>

Guard celler är ett modellsystem för att studera signaltransduktion mekanismer i växter och det är viktigt att säkerställa att beredning av prover som används i studien är den mest lämpliga att besvara biologiska frågor. Trots det öka intresset i guard celler inom forskarsamhället växt, finns det ingen universalmetod om hur att förbereda stomatala guard celler som skulle tillåta både stomatala rörelse och fysiologi samt de molekylära förändringarna studeras i en systemet. Utmaningen att isolera dem ka...

Stomata har en viktig roll i den övergripande fysiologi och fitness av växter. Dessa små växt särskilda strukturer bildas av två specialiserade epidermala celler kallas guard celler och finns mest rikligt på den abaxial ytan av bladen. Stomata är nödvändiga för utbyte av gaser mellan anläggningen och atmosfären, samt kontroll av vattenförlust genom transpiration. Guard celler reglerar stomata bländare genom integrering av olika externa (t.ex., ljus, luftfuktighet, patogen kontakt, nivåerna av koldioxid) och inre (t.ex., endogena hormoner) stimuli1,2. Under de senaste 20 åren, har denna celltyp blivit modellsystem för att studera cell signalering processer i växter. Dessa celler bildar en bråkdel av de totala cellerna i ett blad; Således, för att undersöka deras unika cellular, biokemiska och molekylära egenskaper i en enskild cell sätt, är det nödvändigt att isolera dem från andra blad celltyper. I förflutnan handlar guard cellstudier ofta utarbetandet av vakt cell protoplasts (GCP)3,4,5. Detta vanligtvis kräver användning av stora mängder cellväggen förnedrande enzymer och eller mekaniska störningar via blandning och har visat vara kostsamma och tidskrävande som det generellt tar många timmar för att förbereda ett GCP prov, ofta gånger med lite avkastning. Viktigare, eftersom guard celler fungera som komplett par att reglera stomata bländare, kan användning av GCP ses som en konstgjord system för att studera guard cellsignalering.
Här har vi utvecklat en metod för att förbereda stomata där intakt guard celler är berikad och upprätthålla fysiologiska reaktioner på stimuli. Denna metod var inspirerad av en metod som användes för att isolera mesophyll cell protoplasts6,7. I vår metod upprättas stomata med tydliga tejp att först separera flertalet mesophyll celler bifogas det adaxial lagret av blad från det abaxial lagret som innehåller trottoaren och guard celler. Detta görs genom anbringande en bit tejp på vardera sidan av bladet och skalar dem isär. Cellerna från det abaxial lagret får återhämta sig under ljus i en stomata-öppning buffert. Senare avlägsnas de återstående trottoar cellerna med hjälp av en liten mängd cellväggen förnedrande enzymer, lämnar bakom guard cell som är berikad på bandet.
I den här enkla metoden stomatala guard celler som är både lönsamt och lyhörd kan snabbt och vara effektivt beredda, tar mindre än en timme att få berikade stomatala guard celler från 50 peeling med minimal kostnad. Metoden här medför mindre skada på växtcellerna än tidigare metoder där protoplasts tillagas. Dessutom material som samlats in från denna metod avkastning önskvärt protein belopp. Viktigast av allt, eftersom bladet inte utsätts för blandning eller långa matsmältningen gånger och guard celler förbli intakt, kommer resultaten av studier närmare vara relevant som en vakt cellens naturliga biologi. Med den här metoden kan vara korrelerade stomatala rörelser i realtid med förändringar på molekylär nivå. Således skulle den kunskap som erhållits från studier med denna förberedelse metod vara viktigt för en mer omfattande förståelse av vakt cellsignalering.
Vi använde växten Arabidopsis thaliana som en modell; Detta protokoll kan emellertid tillämpas på anrikningen av stomatala guard celler i andra växtarter såsom Brassica napus med små ändringar i koktiden. Som ett bevis på konceptet, har vi visat att stomatala guard celler berikad via denna metod är livskraftig och lyhörda för stimuli som visas av fluorescein diacetat (FDA) analys och studier utnyttjar anläggningen hormon abscisic syran (ABA), respektive. Dessutom har vi visat att högkvalitativa proteiner kan isoleras från dessa guard celler. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll av denna process.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:889px;" width="889">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Stainless Steel Surgical Scalpel</td>
			<td style="width:297px;">Feather&#160;</td>
			<td style="width:119px;">&#160;NC9999403</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Scotch Tape (3M)</td>
			<td style="width:297px;">ULINE</td>
			<td style="width:119px;">S-9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:297px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR455701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cellulase (Onozuka R-10)&#160;</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Macerozyme R-10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DM6000B Microscope&#160;</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;PI78443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3119-0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZQ Protein Quantitation Kit</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescein Diacetate (FDA)</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Abscisic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Metro Mix 500</td>
			<td style="width:297px;">BWI Companies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">TX-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Bio-Safe Comassie (G-250)</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microcentrifuge Tube (2mL)</td>
			<td style="width:297px;">USA Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:297px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tweezers&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4017-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">456-1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:297px;">Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stomata tape-peel: an improved method for guard cell sample preparation

Studien av vakt celler är viktigt att kunskap om de specifika bidrag denna celltyp till den totala funktionen av växter. Men det är ofta svårt att isolera och således studera dem ofta ger en utmaning.
Denna studie fastställs en metod för anrikning av stomatala guard cell. Protokollet använder tredjeparts Scotch tejp för att isolera guard celler och extrahera proteiner från cellerna. Denna metod förbättrar integritet och avkastningen av vakt cell under isolering och ger ett tillförlitligt prov för studien av cell signalering processer och hur de korrelerar till stomatala rörelse fenotyper. I denna metod, var i växtblad delat mellan två delar av tejp och skalade isär för att ta bort den abaxial sidan. Detta protokoll tillämpades Arabidopsis bladvävnad att isolera guard celler. Cellerna behandlades med fluorescein diacetat (FDA) att avgöra lönsamhet och abscisic syra (ABA) att bedöma stomata rörelse som svar på ABA. Sammanfattningsvis visar detta protokoll användbar för att förbereda berikad stomatala guard celler och isolera proteiner. Kvaliteten på de celler och proteiner erhöll här aktivera fysiologiska och andra biologiska studier.

En representativ bild av Arabidopsis guard celler före och efter matsmältningen mesophyll och epidermala celler visas i figur 1. Guard cellviabilitet före och efter borttagning av mesophyll och epidermala celler kan observeras med hjälp av FDA för att mäta enzymaktiviteten och cellmembranet integritet (figur 1B och 1 D). Figur 2 illustrerar stomatala rörelse av Arabidopsis i A...

Watch this Scientific Journal Video about Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation at JoVE.com

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

Det här protokollet beskriver en metod för att förbereda berikad stomatala guard celler som är användbar för fysiologiska och andra biologiska studier.

Stomata Tape-Peel: En förbättrad metod för vakt Cell provberedning

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Provberedning: Ultra tunt lager Metod

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Montering, lastning och Uppriktning av en analytisk ultracentrifugen Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting: provberedning till Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

En förbättrad metod för noggrann och snabb mätning av Flight Performance i<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Provberedning för single virion atomic force mikroskopi och superupplösning fluorescensavbildning

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Förbättrad Swiss-rullande Teknik för tarmvävnad Förberedelse för immunhistokemisk och immunofluorescens Analyser

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Provberedning för Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Ett alternativt tillvägagångssätt för provberedning med låg mobilnummer för TEM-analys

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Hybrid-Cut: En förbättrad Sektione metod för Motsträviga växtvävnadsprover

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Provberedning och avbildning av Exosomes av transmissionselektronmikroskopi

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...