Name: stomata tape-peel: an improved method for guard cell sample preparation
Uploaded: 2018-07-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation at JoVE.com

Daniel Chen üzerinden Dijital Video üretim ekibi, Buchholz lise video düzenleme konusunda yardım almak için teşekkür ederiz. Bu araştırma stomatal gardiyan hücreleri, proteomik ve metabolomics Chen laboratuarında hibe bize Ulusal Bilim Vakfı (0818051, 1158000 ve 1412547) tarafından desteklenmiştir. Wenwen Kong Çin burs Konseyi tarafından desteklenir. Dr. Qiuying Pang Çin burs Konseyi ve Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31570396) tarafından desteklenmektedir.

1. bitki yetiştirme
<ol><li>Karışımı çömlekçilik içinde tohum çimlenme. Bitkilerde büyüme odası ile 140 µmol fotonlar m−2 s – 1 ışık yoğunluğu ve bir photoperiod 8 h ışık 22 ° C ve 16 h 18 ° C'de 2 hafta boyunca karardığını.</li>
	<li>Fidan benzer boyutlarda tek tek toprak içeren 4" çapında tencere nakli ve ek 3 hafta aynı koşullarda 1.1. adımda açıklanan için büyür. Not: musluk suyu ile bitkilerin toprak nemli tutmak için haftada iki kez su.</li>
</o...

<ol>
	<li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone+interactions+in+stomatal+function.">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li><li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+cell+signal+transduction.">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li><li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses.">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li><li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+applications+of+Arabidopsis+thaliana+guard+cell+protoplasts.">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li><li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+Dependence+Of+K++Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts.">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li><li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method.">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10 (2009).</li><li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll,+epidermal+and+vascular+tissues.">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li><li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents,+chaotropes,+dyes,+and+reducing+agents.">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laemmli-SDS-PAGE.">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+A+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS+(vol+75,+pg+1895).">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li></ol>

Gardiyan hücreleri sinyal iletim mekanizmaları tesislerinde çalışmak için bir model sistem ve çalışmada kullanılan örnekleri hazırlanması Biyolojik sorulara cevap için en uygun olduğundan emin olmak önemlidir. Gardiyan hücreleri bitki araştırma topluluğu içinde artan ilgi rağmen nasıl stomatal hareketi ve Fizyoloji sağlayacak stomatal gardiyan hücreleri hazırlamak için evrensel bir yöntem yoktur işte birinde incelenecektir için moleküler değişikliklerinin yanı sıra sistem. Onları ayır...

Stoma bantlı Genel Fizyoloji ve fitness bitkilerin önemli bir rol oynamaktadır. Bu küçük bitki belirli yapılara guard hücreler olarak bilinen iki özel epidermal hücre tarafından kurulur ve en bol yaprakları abaxial yüzeyinde bulunur. Stoma bantlı gazlar terleme ile su kaybı kontrolünü yanı sıra bitki ve atmosfer arasındaki alışverişi için gereklidir. Gardiyan hücreleri düzenleyen stoma bantlı diyafram farklı dış (Örneğin, ışık, nem, patojen iletişim, karbondioksit düzeyleri) tümleştirme yoluyla ve iç (Örn., endojen hormonlar) uyaranlara1,2. Son 20 yıl içinde bu hücre tipi eğitim hücre süreçleri bitkilerde sinyal için bir model sistemi haline gelmiştir. Bu hücreler bir yaprak toplam hücrelerde küçük bir kısmını oluşturur; Böylece, kendi benzersiz cep araştırmak için biyokimyasal ve moleküler özelliklerini bir tek hücreli şekilde bu diğer yaprak hücre türlerinden yalıtmak gereklidir. Geçmişte, guard hücre çalışmaları bu hazırlık guard hücre önceki (GCP)3,4,5kez işe. Bu genellikle hücre duvarı aşağılayıcı enzimler ve/veya karıştırma ile mekanik kesintileri büyük miktarda kullanımı gerektirir ve genellikle GCP örnek kez hazırlamak için saatlerce sürer gibi pahalı ve zaman alıcı olması ile küçük verim kez kanıtlamıştır. Daha da önemlisi, çünkü gardiyan hücreleri stoma bantlı diyafram düzenleyen tam çiftleri olarak hareket, GCP kullanımı guard hücre sinyallemesi eğitimi için yapay bir sistem olarak görülebilir.
Burada, sağlam koruma hücreleri zenginleştirilmiş ve fizyolojik yanıt uyaranlara karşı korumak stoma bantlı hazırlamak için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem mesophyll hücre önceki6,7ayırmak için kullanılan bir yöntem tarafından ilham kaynağı oldu. Bizim Yöntem, stoma bantlı ilk mesophyll hücreleri çoğunluğu ayırmak için bant kaldırım ve nöbetçi hücreleri içeren abaxial katmandan yaprak adaxial katmana bağlı NET kullanılarak hazırlanır. Bu bant yaprak her tarafına bir parçası yapıştırılması ve onları ayrı peeling yapılır. Abaxial katman hücrelerden stoma bantlı-açılış arabellekte ışık altında kurtarmak için izin verilir. Daha sonra kalan kaldırım hücreleri hücre duvarı enzimler, kasette zenginleştirilmiş guard hücre bırakarak aşağılayıcı küçük bir miktar kullanarak kaldırılır.
Basit bu yöntemde, uygun ve duyarlı stomatal gardiyan hücreleri hızlı ve verimli bir şekilde 50 kabukları minimum maliyet ile zenginleştirilmiş stomatal gardiyan hücreleri almak için bir saat almaya hazır olun. İşte Yöntem bitki hücreleri için önceki nerede hazırlanan önceki yöntemlerine göre daha az zarar getirir. Buna ek olarak, malzeme bu yöntem verim arzu protein tutarlardan toplanan. En önemlisi, yaprak karıştırma için tabi tutulur değil veya uzun Sindirim süreleri ve nöbetçi hücreleri korunacak çünkü, çalışmaların sonuçları daha yakından bir muhafız hücrenin doğal biyoloji ilgili olacak. Bu yöntemle, stomatal hareketleri gerçek zamanlı olarak moleküler seviyede değişikliklerle ilişkili olabilir. Böylece, bu hazırlık yöntemi kullanarak çalışmalardan elde bilgi koruma hücre sinyallemesi daha kapsamlı bir anlayış için önemli olacaktır.
Bitki Arabidopsis thaliana bir model olarak kullanılan; Ancak bu iletişim kuralı stomatal guard hücrelerinde diğer bitki türleri Brassica napus gibi küçük değişiklikler ile zenginleştirme sindirim zaman uygulanabilir. Kavramının bir kanıtı olarak stomatal gardiyan hücreleri bu yöntemle zenginleştirilmiş uygun ve floresein diacetate (FDA) tahlil ve bitki hormon Absisik asit (ABA), sırasıyla kullanan çalışmalar tarafından gösterildiği gibi uyaranlara karşı duyarlı olduğunu göstermiştir. Buna ek olarak, yüksek kaliteli protein bu bekçi hücrelerden ayrılmış olabilir göstermiştir. Burada, bu sürecin detaylı bir protokol açıklayın.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:889px;" width="889">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Stainless Steel Surgical Scalpel</td>
			<td style="width:297px;">Feather&#160;</td>
			<td style="width:119px;">&#160;NC9999403</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Scotch Tape (3M)</td>
			<td style="width:297px;">ULINE</td>
			<td style="width:119px;">S-9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:297px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR455701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cellulase (Onozuka R-10)&#160;</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Macerozyme R-10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DM6000B Microscope&#160;</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;PI78443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3119-0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZQ Protein Quantitation Kit</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescein Diacetate (FDA)</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Abscisic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Metro Mix 500</td>
			<td style="width:297px;">BWI Companies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">TX-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Bio-Safe Comassie (G-250)</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microcentrifuge Tube (2mL)</td>
			<td style="width:297px;">USA Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:297px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tweezers&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4017-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">456-1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:297px;">Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stomata tape-peel: an improved method for guard cell sample preparation

Gardiyan hücreleri belirli katkıları bitkilerin genel işlevi için bu hücre tür bilgi için önemli bir çalışmadır. Ancak, genellikle izole etmek zordur ve böylece kez üstlerinde bir meydan okuma sağlar.
Bu çalışmada stomatal guard hücre zenginleştirme yöntemi oluşturur. Protokol bant koruma hücreleri izole ve proteinler hücrelerden ayıklamak için kullanır. Bu yöntem sırasında yalıtım bütünlüğü ve muhafız hücre verimini artırır ve hücre sinyal gönderme süreçleri ve nasıl onlar için stomatal hareketi fenotipleri ilişkilendirmek için güvenilir bir örnek sağlar. Bu yöntemde, bitki yaprakları teyp iki bölümleri arasında bölümlenmiş ve ayrı abaxial yan kaldırmak için soyulmuş. Bu iletişim kuralı Arabidopsis yaprak dokusu ile nöbetçi hücreleri izole etmek için uygulandı. Hücreleri Absisik asit (ABA) stoma bantlı hareketi yanıt ABA olarak değerlendirmek için ile floresein diacetate canlılığı belirlemek için (FDA) ile tedavi edildi. Sonuç olarak, bu iletişim kuralını zenginleştirilmiş stomatal gardiyan hücreleri hazırlama ve protein izole için yararlı olmaktadır. Hücreleri ve protein kalitesini burada etkinleştir fizyolojik ve biyolojik diğer çalışmalar elde.

Bir temsili resim Arabidopsis guard hücre önce ve sonra sindirim mesophyll ve epidermal hücre Şekil 1' de gösterilen. Guard hücre canlılığı önce ve sonra mesophyll ve epidermal hücrelerin enzimatik aktivite ve hücre zarının bütünlüğü (Şekil 1B ve 1 D) ölçmek için FDA kullanarak görülebilmektedir. Şekil 2 Arabidopsis stomatal hareketi yanıt ABA tedavi olara...

Watch this Scientific Journal Video about Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation at JoVE.com

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

Bu iletişim kuralı fizyolojik ve diğer biyolojik araştırmaları için yararlıdır zenginleştirilmiş stomatal gardiyan hücreleri hazırlama yöntemi açıklanır.

Stoma bantlı teyp-kabuğu: Guard hücre numune hazırlama için geliştirilmiş bir yöntem

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Kurul, Yükleme ve Analitik ultrasantrifüjdeki Örnek Hücre Hizalama

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western Blot: Numune Hazırlama Algılama

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Uçuş Performans Doğru ve hızlı ölçüm için geliştirilmiş Yöntemi<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Immünohistokimyasal ve immünofloresan Analizleri için Bağırsak Doku Hazırlama için geliştirilmiş Swiss-haddeleme Tekniği

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Kütle Sitometri Analizi için Numune Hazırlama

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

TEM analizi için düşük Hücre sayısı ile örnek hazırlanması için alternatif bir yaklaşım

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Hibrid-Cut: Dirençli Bir Bitki Doku Örnekleri Bir Geliştirilmiş Kesit Yöntemi

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Numune hazırlama ve transmisyon elektron mikroskobu tarafından Exosomes görüntüleme

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...