Name: analysis of minerals produced by hfob 1.19 and saos-2 cells using transmission electron microscopy with energy dispersive x-ray microanalysis
Uploaded: 2018-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis at JoVE.com

MK en ASK handmatige bewerkingen uitgevoerd en LB bereid tekeningen en maakte de film. ASK schreef het manuscript, LB schreef het script en MK bereid de tabel. SM, RB en SP lezen kritisch in de tabel, het script en het manuscript. De auteurs bedank Hanna Chomontowska voor haar uitstekende hulp bij ultramicrotomie evenals Szymon Suski en Henryk Bilski voor hun uitstekende hulp bij de analyse van de TEM-EDX. De auteurs bedank dr Patrick Groves voor professionele Engelstalige correctie en Barbara Sobiak voor het opnemen van de instructies.
Dit werk werd gesteund door grant N N401 140639 van het Poolse ministerie van Wetenschappen en hoger onderwijs te stellen vragen, door subsidies van de National Science Centre, Polen 2016/23/N/NZ4/03313 LB en 2016/23/N/NZ1/02449 te MK, EU KP7 Project BIOIMAGINE : BIO-IMAGing in onderzoek, innovatie en onderwijs, GA nr. 264173, en door de wettelijke middelen van het Nencki Institute of Experimental Biology, Poolse Academie van Wetenschappen.

1. cultuur en behandeling van de cel
<ol><li>Zet alle noodzakelijke materialen onder de motorkap laminaire flow en steriliseren hen onder UV-licht. De voedingsbodems zijn: een 1:1-mengsel van Ham de F12 en DMEM media met 2.5 mM L-glutamine aangevuld met 100 U/mL penicilline, 100 U/mL streptomycine, 0,3 mg/mL G418 en 10% foetale runderserum (FBS) (v/v) voor menselijke foetus hFOB 1.19 SV40 grote T antigeen transfected Botcellen en McCoy's 5A medium met 1,5 mM L-glutamine aangevuld met 100 U/mL penicilline, 100 U/mL stre...

<ol>
	<li>Buckwalter, J. A., Cooper, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+structure+and+function.">Bone structure and function.</a> Instr. Course Lect. 36, 27-28 (1987).</li><li>Anderson, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+matrix+vesicles.">Molecular biology of matrix vesicles.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 314, 266-280 (1995).</li><li>Anderson, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+vesicles+and+calcification.">Matrix vesicles and calcification.</a> Curr Rheumatol. 5 (3), 222-226 (2003).</li><li>Bolean, M., Sim&#227;o, A. M. S., Barioni, M. B., Favarin, B. Z., Sebinelli, H. G., Veschi, E. A., Janku, T. A. B., Bottini, M., Hoylaerts, M. F., Itri, R., Mill&#225;n, J. L., Ciancaglini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+aspects+of+biomineralization.">Biophysical aspects of biomineralization.</a> Biophys Rev. 9 (5), 747-760 (2017).</li><li>Bottini, M., Mebarek, S., Anderson, K. L., Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Sim&#227;o, A. M. S., Bolean, M., Ciancaglini, P., Bandorowicz Pikula, J., Pikula, S., Magne, D., Volkmann, N., Hanein, D., Mill&#225;n, J. L., Buchet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+vesicles+from+chondrocytes+and+osteoblasts:+Their+biogenesis,+properties,+functions+and+biomimetic+models.">Matrix vesicles from chondrocytes and osteoblasts: Their biogenesis, properties, functions and biomimetic models.</a> Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 532-546 (2018).</li><li>Hessle, L., Johnson, K. A., Anderson, H. C., Narisawa, S., Sali, A., Goding, J. W., Terkeltaub, R., Millan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-nonspecific+alkaline+phosphatase+and+plasma+cell+membrane+glycoprotein-1+are+central+antagonistic+regulators+of+bone+mineralization.">Tissue-nonspecific alkaline phosphatase and plasma cell membrane glycoprotein-1 are central antagonistic regulators of bone mineralization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (14), 9445-9449 (2002).</li><li>Garimella, R., Bi, X., Anderson, H. C., Camacho, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+phosphate+substrate+as+a+major+determinant+of+mineral+type+formed+in+matrix+vesicle-mediated+in+vitro+mineralization:+An+FTIR+imaging+study.">Nature of phosphate substrate as a major determinant of mineral type formed in matrix vesicle-mediated in vitro mineralization: An FTIR imaging study.</a> Bone. 38 (6), 811-817 (2006).</li><li>Thouverey, C., Bechkoff, G., Pikula, S., Buchet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+pyrophosphate+as+a+regulator+of+hydroxyapatite+or+calcium+pyrophosphate+dihydrate+mineral+deposition+by+matrix+vesicles.">Inorganic pyrophosphate as a regulator of hydroxyapatite or calcium pyrophosphate dihydrate mineral deposition by matrix vesicles.</a> Osteoarthr. Cartil. 17, 64-72 (2009).</li><li>Terkeltaub, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+pyrophosphate+generation+and+disposition+in+pathophysiology.">Inorganic pyrophosphate generation and disposition in pathophysiology.</a> Am. J. Phys. 281 (1), 1-11 (2001).</li><li>Guicheux, J., Palmer, G., Shukunami, C., Hiraki, Y., Bonjour, J. P., Caverzasio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+culture+system+for+analysis+of+functional+role+of+phosphate+transport+in+endochondral+ossification.">A novel in vitro culture system for analysis of functional role of phosphate transport in endochondral ossification.</a> Bone. 27 (1), 69-74 (2000).</li><li>Yadav, M. C., Bottini, M., Cory, E., Bhattacharya, K., Kuss, P., Narisawa, S., Sah, R. L., Beck, L., Fadeel, B., Farquharson, C., Mill&#225;n, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+mineralization+deficits+and+impaired+biogenesis+and+function+of+chondrocyte-derived+matrix+vesicles+in+Phospho1(-/-)+and+Phospho1/Pi+t1+double-knockout+mice.">Skeletal mineralization deficits and impaired biogenesis and function of chondrocyte-derived matrix vesicles in Phospho1(-/-) and Phospho1/Pi t1 double-knockout mice.</a> J. Bone Miner. Res. 31 (6), 1275-1286 (2016).</li><li>Thouverey, C., Malinowska, A., Balcerzak, M., Strzelecka-Kiliszek, A., Buchet, R., Dadlez, M., Pikula, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+biogenesis+and+functions+of+matrix+vesicles+released+from+mineralizing+human+osteoblast-like+cells.">Proteomic characterization of biogenesis and functions of matrix vesicles released from mineralizing human osteoblast-like cells.</a> J. Proteome. 74 (7), 1123-1134 (2011).</li><li>Wang, W., Xu, J., Kirsch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin-mediated+Ca2++influx+regulates+growth+plate+chondrocyte+maturation+and+apoptosis.">Annexin-mediated Ca2+ influx regulates growth plate chondrocyte maturation and apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 278 (6), 3762-3769 (2003).</li><li>Nollet, M., Santucci-Darmanin, S., Breuil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+osteoblasts+is+involved+in+mineralization+and+bone+homeostasis.">Autophagy in osteoblasts is involved in mineralization and bone homeostasis.</a> Autophagy. 10 (11), 1965-1977 (2014).</li><li>Boonrungsiman, S., Gentleman, E., Carzaniga, R., Evans, N. D., McComb, D. W., Porter, A. E., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+intracellular+calcium+phosphate+in+osteoblast-mediated+bone+apatite+formation.">The role of intracellular calcium phosphate in osteoblast-mediated bone apatite formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 14170-14175 (2012).</li><li>Genge, B. R., Wu, L. N., Wuthier, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+modeling+of+matrix+vesicle+nucleation:+synergistic+stimulation+of+mineral+formation+by+annexin+A5+and+phosphatidylserine.">In vitro modeling of matrix vesicle nucleation: synergistic stimulation of mineral formation by annexin A5 and phosphatidylserine.</a> J. Biol. Chem. 282 (36), 26035-26045 (2007).</li><li>Jahnen-Dechent, W., Sch&#228;fer, B., Ketteler, M., McKee, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mineral+chaperones:+a+role+for+fetuin-A+and+osteopontin+in+the+inhibition+and+regression+of+pathologic+calcification.">Mineral chaperones: a role for fetuin-A and osteopontin in the inhibition and regression of pathologic calcification.</a> J. Mol. Med. (Berl). 86 (4), 379-389 (2008).</li><li>Suchanek, W., Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+and+properties+of+hydroxyapatite-based+biomaterials+for+use+as+hard+tissue+replacement+implants.">Processing and properties of hydroxyapatite-based biomaterials for use as hard tissue replacement implants.</a> J. Miner. Res. 13 (1), 94-117 (1998).</li><li>Pautke, C., Schieker, M., Tischer, T., Kolk, A., Neth, P., Mutschler, W., Milz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+osteosarcoma+cell+lines+MG-63,+Saos-2+and+U-2+OS+in+comparison+to+human+osteoblasts.">Characterization of osteosarcoma cell lines MG-63, Saos-2 and U-2 OS in comparison to human osteoblasts.</a> Anticancer Res. 24 (6), 3743-3748 (2004).</li><li>Yen, M. -. L., Chien, C. -. C., Chiu, I. -. M., Huang, H. -. I., Chen, Y. -. C., Hu, H. -. I., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+differentiation+and+characterization+of+the+human+fetal+osteoblastic+1.19+cell+line:+a+possible+in+vitro+model+of+human+mesenchymal+progenitors.">Multilineage differentiation and characterization of the human fetal osteoblastic 1.19 cell line: a possible in vitro model of human mesenchymal progenitors.</a> Stem Cells. 25 (1), 125-131 (2007).</li><li>Brittle, S. W., Foose, D. P., O'Neil, K. A., Sikon, J. M., Johnson, J. K., Stahler, A. C., Ryan, J. D., Higgins, S. R., Sizemore, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+raman-based+imaging+method+for+characterizing+the+molecular+adsorption+and+spatial+distribution+of+silver+nanoparticles+to+hydrated+mineral+surfaces.">A raman-based imaging method for characterizing the molecular adsorption and spatial distribution of silver nanoparticles to hydrated mineral surfaces.</a> Environ Sci Technol. , (2018).</li><li>Liu, N., Wang, Y., Ge, F., Liu, S., Xiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+effect+of+nano-ZnO+and+cetyltrimethyl+ammonium+chloride+on+the+growth+of+Chlorella+vulgaris:+Dissolution+and+accumulation+of+nano-ZnO.">Antagonistic effect of nano-ZnO and cetyltrimethyl ammonium chloride on the growth of Chlorella vulgaris: Dissolution and accumulation of nano-ZnO.</a> Chemosphere. 196, 566-574 (2018).</li><li>Tasbihi, M., Ko&#269;&#236;, K., Troppov&#225;, I., Edelmannov&#225;, M., Reli, M., &#268;apek, L., Schom&#228;cker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocatalytic+reduction+of+carbon+dioxide+over+Cu/TiO2+photocatalysts.">Photocatalytic reduction of carbon dioxide over Cu/TiO2 photocatalysts.</a> Environ Sci Pollut Res Int. , (2017).</li><li>Chen, N. X., O'Neill, K. D., Chen, X., Moe, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin-Mediated+Matrix+Vesicle+Calcification+in+Vascular+Smooth+Muscle+Cells.">Annexin-Mediated Matrix Vesicle Calcification in Vascular Smooth Muscle Cells.</a> J. Bone Miner. Res. 23 (11), 1798-1805 (2008).</li><li>Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+minerals+in+vesicles+produced+by+human+osteoblasts+hFOB+1.19+and+osteosarcoma+Saos-2+cells+stimulated+for+mineralization.">Characteristics of minerals in vesicles produced by human osteoblasts hFOB 1.19 and osteosarcoma Saos-2 cells stimulated for mineralization.</a> J. Inorg. Bioch. 171, 100-107 (2017).</li><li>Thouverey, C., Strzelecka-Kiliszek, A., Balcerzak, M., Buchet, R., Pikula, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+vesicles+originate+from+apical+membran&#281;+microvilli+of+mineralizing+osteoblast-like+Saos-2+cells.">Matrix vesicles originate from apical membran&#281; microvilli of mineralizing osteoblast-like Saos-2 cells.</a> J. Cell. Biochem. 106 (1), 127-138 (2009).</li><li>Cazalbou, S., Eichert, D., Ranz, X., Drouet, C., Combes, C., Harmand, M. F., Rey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+exchanges+in+apatites+for+biomedical+application.">Ion exchanges in apatites for biomedical application.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 16 (5), 405-409 (2005).</li><li>Kraus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consolidated+data+analysis+and+presentation+using+an+open-source+add-in+for+the+Microsoft+Excel&#174;+spreadsheet+software.">Consolidated data analysis and presentation using an open-source add-in for the Microsoft Excel&#174; spreadsheet software.</a> Med. Writ. 23 (1), 25-28 (2014).</li><li>Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+in+humans:+making+the+hard+choices+in+life.">Biomineralization in humans: making the hard choices in life.</a> Annu. Rev. Genet. 43, 119-142 (2009).</li><li>Bonucci, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+mineralization.">Bone mineralization.</a> Front. Biosci. 17, 100-128 (2012).</li><li>Veis, A., Dorvee, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+mechanisms:+A+new+paradigm+for+crystal+nucleation+in+organic+matrices.">Biomineralization mechanisms: A new paradigm for crystal nucleation in organic matrices.</a> Calcif. Tissue Int. 93 (4), 307-315 (2013).</li><li>Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A., Sone, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+collagen+biomineralization.">In vitro models of collagen biomineralization.</a> J. Struct. Biol. 183 (2), 258-269 (2013).</li><li>Alliston, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+regulation+of+bone+quality.">Biological regulation of bone quality.</a> Curr. Osteoporos. Rep. 12 (3), 366-375 (2014).</li><li>Wang, W., Kirsch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+stimulates+annexin-mediated+growth+plate+chondrocyte+mineralization.">Retinoic acid stimulates annexin-mediated growth plate chondrocyte mineralization.</a> J. Cell Biol. 157 (6), 1061-1069 (2002).</li><li>Wang, W., Xu, J., Kirsh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+V+and+terminal+differentiation+of+growth+plate+chondrocytes.">Annexin V and terminal differentiation of growth plate chondrocytes.</a> Exp. Cell Res. 305 (1), 156-165 (2005).</li></ol>

In het huidige document, beschreven we de protocollen voor AR-S kleuring, UV licht identificatie van fluorapatiet en TEM-EDX in vitro beeldvorming van MVs uitgebracht door mineralizing cellen en mineralen geproduceerd door MVs. Het is mogelijk om alle methodes hierboven vermeld door sommige gemeenschappelijke stappen voor probleemoplossing te volgen. Met het oog op een optimale resultaten, moeten verschillende kritische stappen zorgvuldig worden uitgevoerd. Eerst, is het beter om toe te voegen AA (die i...

Bot is een soort bindweefsel bestaat uit twee delen: organische (cellen en collageenvezels) en mineralen (calcium en fosfaat verbindingen). De belangrijkste minerale componenten in botten zijn apatites1. Verschillende soorten mineralisatie-bevoegde cellen in bot (botcellen), tanden (odontoblasts) en kraakbeen (chondrocyten) regelen de eerste stappen van mineralisatie door de productie van eiwitten van de extracellulaire matrix (ECM) en het vrijgeven van matrix blaasjes (MVs) (Figuur 1). MVs zijn 100-300 nm diameter blaasjes die zich ophopen van calcium en fosfaat te vergemakkelijken apatiet nucleatie en vervolgens binden aan collageen2,3. Vervolgens desintegreren MVs om apatites aan het extracellulaire medium vrij te geven. De apatites blijven groeien in het contact met de collageenvezels en vormen de bot-matrix. De mineralisatie is opgelopen door de constante aanvoer van Pik en Ca2 + in het extracellulaire medium. Sommige onlangs gepubliceerde gegevens ondersteunen onze model4,5. Zachte weefsels doen niet mineralize onder fysiologische omstandigheden. Ectopische verkalking kan zich echter voordoen onder pathologische omstandigheden zoals vasculaire verkalking3. Vasculaire cellen die het osteoblast fenotype verwerven kunnen produceren MVs dat induceren nucleatie van apatites en initiëren van mineralisatie in de mediale en intima lagen van de wand van de bloedvaten. Sinds ectopische verkalking lijken op normale endochondral mineralisatie3, inzicht in de moleculaire mechanismen van mineralisatie van ossaal cellen en chondrocyten dienen enkele aanwijzingen op ectopische verkalking van de zachte weefsels die gevormd.
De ontwikkeling van het skelet weefsels wordt geregeld door verschillende enzymen, groeifactoren, en initiatiefnemers of remmers van mineralisatie. De antagonistische actie van weefsel-nonspecific alkalisch fosfatase (TNAP) (Figuur 1) en ectonucleotide pyrophosphatase/fosfodiësterase ik (NPP1), samen met ankyrin (ANK), besturingselementen concentratie van de anorganische pyrofosfaat (PPik) 6. PPik, een krachtige remmer van HA formatie, is gehydrolyseerd door TNAP; NPP1 ontstabiel nucleotide trifosfaat tot PPik terwijl ANK uitvoer PPik uit de cel aan de ECM. De Pi/PPi verhouding kan reguleren apatiet vorming7,8 met mogelijke gevolgen van de pathologische9.
De MV membraan is verrijkt met ion vervoer eiwitten die het eerste neerslaan van calcium en fosfaat binnen de MVs tijdens de nucleatie (Figuur 1 vergemakkelijken). De fosfaat transporter 1 (PiT) helpt te nemen Pik gegenereerd in de perivesicular ruimte in de MVs10,11. Annexins kan worden betrokken in het bindende en vervoeren van Ca2 + en de biofysische proces waarmee mineralisatie in de MV lumen12,13. Wij keuren de hypothese, eerder voorgesteld voor mineralisatie binnen intracytoplasmatische blaasjes van interne nucleatie van apatiet binnen de MV voordat de vermeerdering in de ECM14,15. In vitro modellering bevestigd de inductie van Ca2 +/Pik complexen vorming in proteoliposomes gemaakt van PS en AnxA516. Dit kan erop duiden dat accumulatie van Ca2 +, Pi, AnxA5 en PS complexen in lipide vlotten van de microvilli-achtige membranesrepresent de nucleatie kern (NC) van apatiet binnen MVs. Annexins en TNAP bezitten ook collageen-bindende capaciteiten die nuttig zijn in het plaatsen van MVs langs collageenvezels en bij het stimuleren van de verspreiding van mineralisatie in de ECM kunnen zijn. Fetuin A en osteopontin (OPN)17, staan bekend als remmers van apatiet formatie die de verspreiding van mineralisatie op de collagene steiger kan vertragen. Nucleatie en vermeerdering zijn verschillende evenementen, de voormalige voorafgaand aan de laatste, en beide relevant kunnen zijn voor het proces van pathologische mineralisatie.
Om te ontdekken hoe de chemie van calciumfosfaat complexen fysiologische mineralisatie en ectopische verkalking kan veranderen, is het noodzakelijk om te identificeren van de mineralen geproduceerd door cellen. Apatites zijn een groep van calcium en fosfaat met mineralen met de algemene crystal eenheid cel Ca formule10(PO4)6X2, waarbij X = Cl, F, OH. Ze worden geclassificeerd als volgt18: fluorapatiet (FA) Ca10(PO4)6F2, chlorapatite (CA) Ca10(PO4)6Cl2 en hydroxyapatiet (HA) Ca10(PO4 )6(OH)2.
De keuze van osteoblast cellijnen voor het opwekken van minerale vorming is van cruciaal belang, aangezien elke cellijn een duidelijk profiel van mineralisatie vertoont. In dit verslag, vergeleken we de nucleatie van mineralen door twee geselecteerde menselijke cel modellen van mineralisatie: osteoblastic hFOB 1.19 cellen en Osteosarcoom Saos-2 cellen. Osteosarcoom-afgeleide cellen worden vaak gebruikt als osteoblastic modellen en Saos-2 cellen zijn de meest volwassen osteoblastic teken19 bewaard terwijl ongedifferentieerde menselijke foetale hFOB cellen veel als een model voor de normale osteoblastic gebruikt worden differentiatie20. Hun mineralisatie profielen werden geanalyseerd door verschillende methoden: Alizarine Red-S (S-AR) kleuring, ultraviolet (UV) licht visualisatie, Transmissie Electronenmicroscopie (TEM) imaging, energie dispersieve x-stralen Microanalyse (EDX) kwantificatie en ion in kaart brengen. Het voordeel van de TEM-EDX over alternatieve technieken die worden gebruikt in eerdere studies is dat het kwantitatieve en kwalitatieve resultaten van ion vervanging in apatiet kristallen4,5,21geeft. Het algemene doel van het gebruik van de TEM-EDX was te vinden van een eenvoudige methode voor beeldbewerking en kwantificering van de verdeling van de Ca, F en Cl-ionen in verschillende mineralen uit verschillende soorten cellen tijdens de verschillende fasen van het proces van mineralisatie. Deze methode is met succes gebruikt, bijvoorbeeld voor het toezicht op de interactie van zink nanodeeltjes met naast elkaar bestaande chemische stoffen en hun gecombineerde effecten op aquatische organismen22. In een andere studie, een koperen photocatalyst op titanium materialen in waterige oplossing werd uitgebreid gekenmerkt door middel van inductief gekoppeld plasma optische-emissiespectrometrie (ICP-OES), N2 physisorption (inzet), XRD, UV-vis DRS, FT-IR, Raman spectroscopie, TEM-EDX en photoelectrochemical metingen23. Ons doel was om te vergelijken van de herkomst en eigenschappen van blaasjes en mineralen in twee cellijnen te begrijpen van het mechanisme waarmee mineralisatie tijdens werden differentiatie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57423/57423fig1.jpg"> Figuur 1 . Regeling van de eerste stappen van mineralisatie in werden cellen waarbij de synthese van de extracellulaire matrix (ECM) eiwitten en vrijlating van matrix blaasjes (MVs) van de membraan. MVs accumuleren calcium door de werking van calcium bindende proteïnen, annexins en fosfaat, door de werking van een anorganisch fosfaat transporter (PiT) gevolgd door de activiteit van weefsel aspecifieke alkalisch fosfatase (TNAP), die dephosphorylates PPik om Pik, teneinde apatiet nucleatie. Vervolgens MVs desintegreren en vrij van apatites aan het extracellulaire medium. De mineralisatie is opgelopen door de constante aanvoer van Pik en Ca2 + in de extracellulaire middellange4,5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57423/57423fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s DMEM/F12 media mixture</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15-813</td>
			<td>1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#8217;s 5A medium</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E82312-0025</td>
			<td>for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td>100 U/mL each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-418</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68168</td>
			<td>0.3 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5960</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-GP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9422-100G</td>
			<td>7.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Gel HTP Gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>130-0420</td>
			<td>for HA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>synthesized by us</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>synthesized by us</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907/S8282</td>
			<td>0.1 M, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pH 7.0, prepared by us</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AR-S in PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5533-25G</td>
			<td>0.5 g/100 mL, pH 5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2674</td>
			<td>500 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCL buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared by us</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized wather</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>produced by us</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>POCh</td>
			<td>BA6480111</td>
			<td>absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate in 50% ethanol</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>21447-25</td>
			<td>0.25 g/10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pH 7.4, prepared by us</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127/G-6257</td>
			<td>3%:1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post-fixation OsO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75633</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White resin in ethanol</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>17411-MUNC 500g</td>
			<td>1:2, 1:1, 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>CHEMPUR</td>
			<td>111024800</td>
			<td>pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>430487</td>
			<td>1.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096 and 352070</td>
			<td>15 and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes</td>
			<td>Falcon and VWR</td>
			<td>357521 and 612-3700</td>
			<td>1 and 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z688312 and Z628034</td>
			<td>1.5 mL black and 2 mL transparent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0364, 613-0239 and 613-1050</td>
			<td>0.1-10 &#181;L natural, 1-200 &#181;L yellow and 200-1000 &#181;L blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic racks</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A-7055-Z, A-7053-C</td>
			<td>green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Hera Save</td>
			<td>Thermo Scientific Co.</td>
			<td>KS12</td>
			<td>HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubators Hera Cell</td>
			<td>Thermo Scientific Co.</td>
			<td>150</td>
			<td>34&#176;C for hFOB 1.19 and 37&#176;C for Saos-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td>POLON</td>
			<td>WCS-2</td>
			<td>for TEM stainings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottles</td>
			<td>SIMAX</td>
			<td>1632414501050 and 1632414501100</td>
			<td>50 and 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz glass tubes</td>
			<td>SIMAX</td>
			<td>638422010100</td>
			<td>&#216; 10 mm, L 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump</td>
			<td>IBS Integra Biosciences</td>
			<td>VACUSAFE comfort</td>
			<td>for vacuum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UNE 400</td>
			<td>56&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain multi-well plate</td>
			<td>Rosenthal technik</td>
			<td>229/12</td>
			<td>12 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beakers</td>
			<td>SIMAX</td>
			<td>632417010025</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottles</td>
			<td>Pocord</td>
			<td>DIN22</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic box</td>
			<td>Agar Scientific Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>for darkness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap Fit Gelatin Capsules</td>
			<td>Agar Scientific Ltd.</td>
			<td>G3741</td>
			<td>size 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box</td>
			<td>Agar Scientific Ltd.</td>
			<td>S162N3</td>
			<td>film on the shiny side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon cell scraper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SIAL0010-100EA</td>
			<td>size 1.8/25 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with needle</td>
			<td>BogMark</td>
			<td>007</td>
			<td>syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Chirana</td>
			<td>CH005L</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MPW Medical Instruments</td>
			<td>MPW-350R</td>
			<td>130 x g and 500 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV transluminator</td>
			<td>UVP</td>
			<td>M-20</td>
			<td>for visible and UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>LKB</td>
			<td>NOVA</td>
			<td>700&#197; sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block holder</td>
			<td>LKB</td>
			<td>E6711</td>
			<td>round shape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>DiATOME</td>
			<td>Ultra 45&#176;</td>
			<td>size 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>bovine, prepared by us</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2855.1</td>
			<td>antistatic for grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatulas set</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>E286.1</td>
			<td>antistatic for powders</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Light Microscope</td>
			<td>Zeiss with Canon</td>
			<td>AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9</td>
			<td>Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus</td>
			<td>JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera</td>
			<td>magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera body and lenses</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon D7100 
			Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D 
			Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G 
			Nikkor AF 28 mm f/2.8D
</td>
			<td>for movie recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microphone</td>
			<td>MXL Mics</td>
			<td>Tempo</td>
			<td>for voice recordings</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of minerals produced by hfob 1.19 and saos-2 cells using transmission electron microscopy with energy dispersive x-ray microanalysis

Deze video presenteert het gebruik van het transmissie-elektronenmicroscopie met energie dispersieve x-stralen Microanalyse (TEM-EDX) te vergelijken de status van mineralen in blaasjes uitgebracht door twee menselijk bot cellijnen: hFOB 1.19 en Saos-2. Deze cellijnen, na behandeling met ascorbinezuur (AA) en β-glycerophosphate (β-GP), ondergaan van volledige osteogenic transdifferentiatie van proliferatie te mineralisatie en produceren van matrix blaasjes (MVs) die leiden tot apatiet nucleatie in de extracellulaire matrix (ECM).
Gebaseerd op Alizarine Red-S (S-AR) kleuring en analyse van de samenstelling van mineralen in cel lysates met behulp van ultraviolet (UV) licht of blaasjes met behulp van TEM imaging gevolgd door EDX kwantificatie en ion mapping, we kunnen afleiden dat Osteosarcoom Saos-2 en osteoblastic hFOB 1.19 cellen onthullen verschillende mineralisatie profielen. Saos-2 cellen efficiënter dan hFOB 1.19 cellen mineralize en produceren van grotere minerale afzettingen die zijn niet zichtbaar onder UV-licht, maar zijn vergelijkbaar met hydroxyapatiet (HA) in dat ze meer Ca en F vervangingen hebben.
De resultaten verkregen met behulp van deze technieken kunnen we concluderen dat het proces van mineralisatie afhankelijk van het celtype verschilt. Wij stellen voor dat, op het cellulaire niveau, de herkomst en eigenschappen van blaasjes vooraf het type van mineralen bepalen.

TEM-EDX zorgt voor de beeldvorming in vitro van matrix blaasjes (MVs) uitgebracht door mineralizing cellen en mineralen geproduceerd door MVs. de resultaten verkregen met behulp van deze techniek laten zien dat het proces van mineralisatie anders kan gaan in verschillende soorten cellen. De twee cellijnen ontvangen dezelfde osteoblastic transdifferentiatie behandeling, maar gestimuleerd Saos-2 cellen gemineraliseerde efficiënter dan hFOB 1.19 botcellen, zoals blijkt uit...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis at JoVE.com

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

We presenteren een protocol om te vergelijken de status van mineralen in blaasjes uitgebracht door twee menselijk bot cellijnen: hFOB 1.19 en Saos-2. Hun mineralisatie profielen werden geanalyseerd door Alizarine Red-S (S-AR) kleuring, ultraviolet (UV) licht visualisatie, Transmissie Electronenmicroscopie (TEM) beeldvorming en energie dispersieve x-stralen Microanalyse (EDX).

Analyse van mineralen geproduceerd door hFOB 1.19 en Saos-2 cellen met behulp van Transmissie Electronenmicroscopie met energie dispersieve x-stralen Microanalyse

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Het voorbereiden hechtende cellen voor X-stralen fluorescentie beeldvorming door Chemical Fixatie

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

Kwantificeren van Röntgen fluorescentie gegevens met behulp van MAPS

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Liquid-cell Transmission Electron Microscopy for Tracking Self-assembly of Nanoparticles

Vloeistof-cel transmissie-elektronenmicroscopie voor Tracking zelf-assemblage van nanodeeltjes

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully ...

Obtaining 3D Chemical Maps by Energy Filtered Transmission Electron Microscopy Tomography

3D-chemische kaarten door energie verkrijgen gefilterd Transmissie Electronenmicroscopie tomografie

Energy filtered transmission electron microscopy tomography (EFTEM tomography) can provide three-dimensional (3D) chemical maps of materials at a ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips voor In Situ Crystal röntgendiffractie en In Situ Dynamische lichtverstrooiing voor seriële kristallografie

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Elemental-gevoelige detectie van de chemie in batterijen door zachte X-ray Absorptie spectroscopie en Resonant inelastisch X-ray Scattering

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Using Graphene Liquid Cell Transmission Electron Microscopy to Study in Situ Nanocrystal Etching

Using Graphene Liquid Cell Transmission Electron Microscopy to Study in Situ Nanocrystal Etching

Met behulp van grafeen vloeistof cel transmissie-elektronenmicroscopie om te studeren in Situ Nanocrystal etsen

Graphene liquid cell electron microscopy provides the ability to observe nanoscale chemical transformations and dynamics as the reactions are occurring in ...

Preparation of Graphene-Supported Microwell Liquid Cells for In Situ Transmission Electron Microscopy

Preparation of Graphene-Supported Microwell Liquid Cells for In Situ Transmission Electron Microscopy

Bereiding van met grafeen ondersteunde Microwell vloeistof cellen voor in-situ transmissie elektronenmicroscopie

The fabrication and preparation of graphene-supported microwell liquid cells (GSMLCs) for in situ electron microscopy is presented in a stepwise protocol. ...

In situ Grazing Incidence Small Angle X-ray Scattering on Roll-To-Roll Coating of Organic Solar Cells with Laboratory X-ray Instrumentation

In situ Beweiding Incidentie Kleine Hoek Röntgenverstrooiing op Roll-To-Roll Coating van organische zonnecellen met laboratorium röntgeninstrumentatie

We present an in-house, in situ Grazing Incidence Small Angle X-ray Scattering (GISAXS) experiment, developed to probe the drying kinetics of roll-to-roll ...

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Kristallisatie van eiwitten op chip door microdialyse voor in Situ röntgendiffractiestudies

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...