Name: analysis of minerals produced by hfob 1.19 and saos-2 cells using transmission electron microscopy with energy dispersive x-ray microanalysis
Uploaded: 2018-06-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis at JoVE.com

MK e ASK executadas operações manuais e LB preparou desenhos e fez o filme. ASK escreveu o manuscrito, LB escreveu o roteiro e MK preparou a mesa. SM, RB e SP ler criticamente a tabela, o script e o manuscrito. Os autores gostaria de agradecer a Hanna Chomontowska pela sua excelente assistência com Ultramicrotomia bem como Szymon Suski e Henryk Bilski pela excelente assistência com análise TEM-EDX. Os autores gostaria de agradecer o dr Patrick bosques para correção profissional de língua inglesa e Barbara Sobiak para gravar as instruções.
Este trabalho foi apoiado pela concessão N N401 140639 do Ministério da ciência e do ensino superior polonês ao perguntar, por subvenções do centro nacional de ciência, Polónia 2016/23/N/NZ4/03313 LB e 2016/23/N/NZ1/02449 para MK, UE FP7 projeto BIOIMAGINE : BIO-imagem latente em investigação, inovação e educação, GA n. º 264173 e pelos fundos estatutários do Instituto Nencki Instituto de Biologia Experimental, polonês Academia de Ciências.

1. cultura e tratamento da pilha
<ol><li>Coloque todo o material necessário, sob a capa de fluxo laminar e esterilizá-los sob luz UV. Os meios de cultura são: uma mistura 1:1 de presunto é mídia F12 e DMEM com 2,5 mM L-glutamina suplementado com 100 penicilina U/mL, 100 U/mL estreptomicina, 0,3 mg/mL G418 e 10% de soro Fetal bovino (FBS) (v/v) para antígeno grande do T de feto humano hFOB 1.19 SV40 transfectadas osteoblastos e meio de 5A McCoy com 1,5 mM L-glutamina suplementado com 100 penicilina U/mL, 100 U/mL ...

<ol>
	<li>Buckwalter, J. A., Cooper, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+structure+and+function.">Bone structure and function.</a> Instr. Course Lect. 36, 27-28 (1987).</li><li>Anderson, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+matrix+vesicles.">Molecular biology of matrix vesicles.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 314, 266-280 (1995).</li><li>Anderson, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+vesicles+and+calcification.">Matrix vesicles and calcification.</a> Curr Rheumatol. 5 (3), 222-226 (2003).</li><li>Bolean, M., Sim&#227;o, A. M. S., Barioni, M. B., Favarin, B. Z., Sebinelli, H. G., Veschi, E. A., Janku, T. A. B., Bottini, M., Hoylaerts, M. F., Itri, R., Mill&#225;n, J. L., Ciancaglini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+aspects+of+biomineralization.">Biophysical aspects of biomineralization.</a> Biophys Rev. 9 (5), 747-760 (2017).</li><li>Bottini, M., Mebarek, S., Anderson, K. L., Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Sim&#227;o, A. M. S., Bolean, M., Ciancaglini, P., Bandorowicz Pikula, J., Pikula, S., Magne, D., Volkmann, N., Hanein, D., Mill&#225;n, J. L., Buchet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+vesicles+from+chondrocytes+and+osteoblasts:+Their+biogenesis,+properties,+functions+and+biomimetic+models.">Matrix vesicles from chondrocytes and osteoblasts: Their biogenesis, properties, functions and biomimetic models.</a> Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 532-546 (2018).</li><li>Hessle, L., Johnson, K. A., Anderson, H. C., Narisawa, S., Sali, A., Goding, J. W., Terkeltaub, R., Millan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-nonspecific+alkaline+phosphatase+and+plasma+cell+membrane+glycoprotein-1+are+central+antagonistic+regulators+of+bone+mineralization.">Tissue-nonspecific alkaline phosphatase and plasma cell membrane glycoprotein-1 are central antagonistic regulators of bone mineralization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (14), 9445-9449 (2002).</li><li>Garimella, R., Bi, X., Anderson, H. C., Camacho, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+phosphate+substrate+as+a+major+determinant+of+mineral+type+formed+in+matrix+vesicle-mediated+in+vitro+mineralization:+An+FTIR+imaging+study.">Nature of phosphate substrate as a major determinant of mineral type formed in matrix vesicle-mediated in vitro mineralization: An FTIR imaging study.</a> Bone. 38 (6), 811-817 (2006).</li><li>Thouverey, C., Bechkoff, G., Pikula, S., Buchet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+pyrophosphate+as+a+regulator+of+hydroxyapatite+or+calcium+pyrophosphate+dihydrate+mineral+deposition+by+matrix+vesicles.">Inorganic pyrophosphate as a regulator of hydroxyapatite or calcium pyrophosphate dihydrate mineral deposition by matrix vesicles.</a> Osteoarthr. Cartil. 17, 64-72 (2009).</li><li>Terkeltaub, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+pyrophosphate+generation+and+disposition+in+pathophysiology.">Inorganic pyrophosphate generation and disposition in pathophysiology.</a> Am. J. Phys. 281 (1), 1-11 (2001).</li><li>Guicheux, J., Palmer, G., Shukunami, C., Hiraki, Y., Bonjour, J. P., Caverzasio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+culture+system+for+analysis+of+functional+role+of+phosphate+transport+in+endochondral+ossification.">A novel in vitro culture system for analysis of functional role of phosphate transport in endochondral ossification.</a> Bone. 27 (1), 69-74 (2000).</li><li>Yadav, M. C., Bottini, M., Cory, E., Bhattacharya, K., Kuss, P., Narisawa, S., Sah, R. L., Beck, L., Fadeel, B., Farquharson, C., Mill&#225;n, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+mineralization+deficits+and+impaired+biogenesis+and+function+of+chondrocyte-derived+matrix+vesicles+in+Phospho1(-/-)+and+Phospho1/Pi+t1+double-knockout+mice.">Skeletal mineralization deficits and impaired biogenesis and function of chondrocyte-derived matrix vesicles in Phospho1(-/-) and Phospho1/Pi t1 double-knockout mice.</a> J. Bone Miner. Res. 31 (6), 1275-1286 (2016).</li><li>Thouverey, C., Malinowska, A., Balcerzak, M., Strzelecka-Kiliszek, A., Buchet, R., Dadlez, M., Pikula, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+biogenesis+and+functions+of+matrix+vesicles+released+from+mineralizing+human+osteoblast-like+cells.">Proteomic characterization of biogenesis and functions of matrix vesicles released from mineralizing human osteoblast-like cells.</a> J. Proteome. 74 (7), 1123-1134 (2011).</li><li>Wang, W., Xu, J., Kirsch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin-mediated+Ca2++influx+regulates+growth+plate+chondrocyte+maturation+and+apoptosis.">Annexin-mediated Ca2+ influx regulates growth plate chondrocyte maturation and apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 278 (6), 3762-3769 (2003).</li><li>Nollet, M., Santucci-Darmanin, S., Breuil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+osteoblasts+is+involved+in+mineralization+and+bone+homeostasis.">Autophagy in osteoblasts is involved in mineralization and bone homeostasis.</a> Autophagy. 10 (11), 1965-1977 (2014).</li><li>Boonrungsiman, S., Gentleman, E., Carzaniga, R., Evans, N. D., McComb, D. W., Porter, A. E., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+intracellular+calcium+phosphate+in+osteoblast-mediated+bone+apatite+formation.">The role of intracellular calcium phosphate in osteoblast-mediated bone apatite formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 14170-14175 (2012).</li><li>Genge, B. R., Wu, L. N., Wuthier, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+modeling+of+matrix+vesicle+nucleation:+synergistic+stimulation+of+mineral+formation+by+annexin+A5+and+phosphatidylserine.">In vitro modeling of matrix vesicle nucleation: synergistic stimulation of mineral formation by annexin A5 and phosphatidylserine.</a> J. Biol. Chem. 282 (36), 26035-26045 (2007).</li><li>Jahnen-Dechent, W., Sch&#228;fer, B., Ketteler, M., McKee, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mineral+chaperones:+a+role+for+fetuin-A+and+osteopontin+in+the+inhibition+and+regression+of+pathologic+calcification.">Mineral chaperones: a role for fetuin-A and osteopontin in the inhibition and regression of pathologic calcification.</a> J. Mol. Med. (Berl). 86 (4), 379-389 (2008).</li><li>Suchanek, W., Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+and+properties+of+hydroxyapatite-based+biomaterials+for+use+as+hard+tissue+replacement+implants.">Processing and properties of hydroxyapatite-based biomaterials for use as hard tissue replacement implants.</a> J. Miner. Res. 13 (1), 94-117 (1998).</li><li>Pautke, C., Schieker, M., Tischer, T., Kolk, A., Neth, P., Mutschler, W., Milz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+osteosarcoma+cell+lines+MG-63,+Saos-2+and+U-2+OS+in+comparison+to+human+osteoblasts.">Characterization of osteosarcoma cell lines MG-63, Saos-2 and U-2 OS in comparison to human osteoblasts.</a> Anticancer Res. 24 (6), 3743-3748 (2004).</li><li>Yen, M. -. L., Chien, C. -. C., Chiu, I. -. M., Huang, H. -. I., Chen, Y. -. C., Hu, H. -. I., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+differentiation+and+characterization+of+the+human+fetal+osteoblastic+1.19+cell+line:+a+possible+in+vitro+model+of+human+mesenchymal+progenitors.">Multilineage differentiation and characterization of the human fetal osteoblastic 1.19 cell line: a possible in vitro model of human mesenchymal progenitors.</a> Stem Cells. 25 (1), 125-131 (2007).</li><li>Brittle, S. W., Foose, D. P., O'Neil, K. A., Sikon, J. M., Johnson, J. K., Stahler, A. C., Ryan, J. D., Higgins, S. R., Sizemore, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+raman-based+imaging+method+for+characterizing+the+molecular+adsorption+and+spatial+distribution+of+silver+nanoparticles+to+hydrated+mineral+surfaces.">A raman-based imaging method for characterizing the molecular adsorption and spatial distribution of silver nanoparticles to hydrated mineral surfaces.</a> Environ Sci Technol. , (2018).</li><li>Liu, N., Wang, Y., Ge, F., Liu, S., Xiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+effect+of+nano-ZnO+and+cetyltrimethyl+ammonium+chloride+on+the+growth+of+Chlorella+vulgaris:+Dissolution+and+accumulation+of+nano-ZnO.">Antagonistic effect of nano-ZnO and cetyltrimethyl ammonium chloride on the growth of Chlorella vulgaris: Dissolution and accumulation of nano-ZnO.</a> Chemosphere. 196, 566-574 (2018).</li><li>Tasbihi, M., Ko&#269;&#236;, K., Troppov&#225;, I., Edelmannov&#225;, M., Reli, M., &#268;apek, L., Schom&#228;cker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocatalytic+reduction+of+carbon+dioxide+over+Cu/TiO2+photocatalysts.">Photocatalytic reduction of carbon dioxide over Cu/TiO2 photocatalysts.</a> Environ Sci Pollut Res Int. , (2017).</li><li>Chen, N. X., O'Neill, K. D., Chen, X., Moe, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin-Mediated+Matrix+Vesicle+Calcification+in+Vascular+Smooth+Muscle+Cells.">Annexin-Mediated Matrix Vesicle Calcification in Vascular Smooth Muscle Cells.</a> J. Bone Miner. Res. 23 (11), 1798-1805 (2008).</li><li>Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+minerals+in+vesicles+produced+by+human+osteoblasts+hFOB+1.19+and+osteosarcoma+Saos-2+cells+stimulated+for+mineralization.">Characteristics of minerals in vesicles produced by human osteoblasts hFOB 1.19 and osteosarcoma Saos-2 cells stimulated for mineralization.</a> J. Inorg. Bioch. 171, 100-107 (2017).</li><li>Thouverey, C., Strzelecka-Kiliszek, A., Balcerzak, M., Buchet, R., Pikula, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+vesicles+originate+from+apical+membran&#281;+microvilli+of+mineralizing+osteoblast-like+Saos-2+cells.">Matrix vesicles originate from apical membran&#281; microvilli of mineralizing osteoblast-like Saos-2 cells.</a> J. Cell. Biochem. 106 (1), 127-138 (2009).</li><li>Cazalbou, S., Eichert, D., Ranz, X., Drouet, C., Combes, C., Harmand, M. F., Rey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+exchanges+in+apatites+for+biomedical+application.">Ion exchanges in apatites for biomedical application.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 16 (5), 405-409 (2005).</li><li>Kraus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consolidated+data+analysis+and+presentation+using+an+open-source+add-in+for+the+Microsoft+Excel&#174;+spreadsheet+software.">Consolidated data analysis and presentation using an open-source add-in for the Microsoft Excel&#174; spreadsheet software.</a> Med. Writ. 23 (1), 25-28 (2014).</li><li>Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+in+humans:+making+the+hard+choices+in+life.">Biomineralization in humans: making the hard choices in life.</a> Annu. Rev. Genet. 43, 119-142 (2009).</li><li>Bonucci, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+mineralization.">Bone mineralization.</a> Front. Biosci. 17, 100-128 (2012).</li><li>Veis, A., Dorvee, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+mechanisms:+A+new+paradigm+for+crystal+nucleation+in+organic+matrices.">Biomineralization mechanisms: A new paradigm for crystal nucleation in organic matrices.</a> Calcif. Tissue Int. 93 (4), 307-315 (2013).</li><li>Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A., Sone, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+collagen+biomineralization.">In vitro models of collagen biomineralization.</a> J. Struct. Biol. 183 (2), 258-269 (2013).</li><li>Alliston, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+regulation+of+bone+quality.">Biological regulation of bone quality.</a> Curr. Osteoporos. Rep. 12 (3), 366-375 (2014).</li><li>Wang, W., Kirsch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+stimulates+annexin-mediated+growth+plate+chondrocyte+mineralization.">Retinoic acid stimulates annexin-mediated growth plate chondrocyte mineralization.</a> J. Cell Biol. 157 (6), 1061-1069 (2002).</li><li>Wang, W., Xu, J., Kirsh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+V+and+terminal+differentiation+of+growth+plate+chondrocytes.">Annexin V and terminal differentiation of growth plate chondrocytes.</a> Exp. Cell Res. 305 (1), 156-165 (2005).</li></ol>

No jornal atual, descrevemos os protocolos de coloração, identificação de luz UV de fluorapatita AR-S e TEM-EDX em vitro imagem de MVs lançados pela mineralização de células e de minerais produzidos por MVs. É possível abordar todos os métodos mencionados acima, seguindo algumas etapas de solução de problemas comuns. A fim de obter resultados óptimos, vários passos críticos devem ser realizados com cuidado. Primeiro, é melhor adicionar AA (que é ácida) seguido por β-GP (que é alcali...

Osso é um tipo de tecido conjuntivo composto de duas partes: orgânico (células e fibras colágenas) e mineral (compostos de cálcio e fosfato). Os principais componentes minerais nos ossos são apatites1. Diferentes tipos de células competentes de mineralização no osso (osteoblastos), dentes (odontoblastos) e cartilagem (condrócitos) regulam os passos iniciais da mineralização através da produção de proteínas da matriz extracelular (ECM) e liberando a matriz vesículas (MVs) (Figura 1). MVs são vesículas de diâmetro de nm de 100-300 que acumulam cálcio e fosfato, facilitando a nucleação de apatita e posteriormente vincular a colágeno2,3. Em seguida, MVs desintegrar-se para liberar apatites para o meio extracelular. Os apatites continuam a crescer em contato com as fibras de colágeno e formam a matriz óssea. A mineralização é sustentada pela oferta constante de Peu e Ca2 + no meio extracelular. Alguns dados publicados recentemente apoiar nosso modelo4,5. Tecidos moles não mineralize sob condições fisiológicas. No entanto, calcificação ectópica pode ocorrer sob condições patológicas como calcificação vascular3. Células vasculares que adquirem o fenótipo de osteoblastos podem produzir MVs que induzem a nucleação de apatites e iniciar a mineralização nas camadas da parede medial e da íntima dos vasos sanguíneos. Desde calcificação ectópica se assemelham a endocondral normal mineralização3, compreender os mecanismos moleculares da mineralização das células ósseas e condrócitos devem fornecer algumas pistas sobre gravidez ectópica calcificação dos tecidos moles que são formada.
O desenvolvimento dos tecidos esqueléticos é regulado por diversas enzimas, fatores de crescimento e promotores ou inibidores de mineralização. A ação antagonista de tecido-inespecíficos da fosfatase alcalina (TNAP) (Figura 1) e ectonucleotide pyrophosphatase/fosfodiesterase eu (NPP1), juntamente com ankyrin (ANK), controla a concentração de pirofosfato inorgânico (PPeu) 6. PPeu, um potente inibidor da formação de HA, é hidrolisado por TNAP; NPP1 hidrolisa trifosfatos de nucleotídeos para formar PPeu enquanto ANK exporta-PPeu da célula para o ECM. A proporção de Pi/PPi pode regular apatita formação7,8 , com possíveis consequências patológicas9.
A membrana de MV é rico em proteínas de transporte de íons que facilitam a precipitação inicial do cálcio e fosfato dentro os MVs durante o processo de nucleação (Figura 1). O transportador de fosfato 1 (PiT) ajuda a incorporar Peu gerados no espaço perivesicular para o MVs10,11. Anexinas podem estar envolvidas na ligação e transporte de Ca2 + e no processo de Biofísica que inicia a mineralização na MV lúmen12,13. Favorecemos a hipótese, sugerida anteriormente, para mineralização dentro de vesículas intracitoplasmática de nucleação interna de apatita dentro o MV antes de sua propagação na ECM14,15. Modelagem em vitro confirmou a indução de Ca2 +/ peu complexos formação em proteoliposomes feitas de PS e AnxA516. Isso pode indicar que a acumulação de Ca2 +, Peu, AnxA5 e PS complexos em balsas lipídicas de membranesrepresent microvilli-como o núcleo de nucleação (NC) de apatita dentro Mvs anexinas e TNAP também possuem ligação de colágeno capacidades que podem ser úteis na colocação de MVs ao longo de fibras de colagénio e, para estimular a propagação da mineralização em ECM. Fetuin A e osteopontin (OPN)17, são conhecidos como inibidores da formação de apatita que pode abrandar a propagação de mineralização no cadafalso colágenas. Nucleação e propagação são eventos distintos, o primeiro anterior a último, e ambos podem ser relevantes para o processo de mineralização patológica.
Para descobrir como a química de complexos de fosfato de cálcio pode alterar mineralização fisiológica e calcificação ectópica, é necessário identificar os minerais produzidos por células. Apatites são um grupo de cálcio e fosfato contendo minerais com cristal geral unidade célula fórmula Ca10(PO4)6X2, onde X = Cl, F, OH. Eles são classificados como segue18: fluorapatita (FA) Ca10(PO4)6F2, chlorapatite (CA) Ca10(PO4)6Cl2 e hidroxiapatita (HA) Ca10(PO4 )6(OH)2.
A escolha de linhas de células osteoblast para induzir a formação de minerais é crucial, pois cada linha celular apresenta um perfil distinto de mineralização. Neste relatório, nós comparamos a nucleação de minerais por dois modelos de célula selecionada humana de mineralização: células osteoblásticas hFOB 1.19 e osteossarcoma Saos-2 células. Osteossarcoma-derivado de células são comumente usadas como modelos osteoblásticas e Saos-2 células têm preservado o caráter osteoblástica mais maduro19 enquanto células indiferenciadas hFOB fetal humano são amplamente utilizadas como um modelo para o normal osteoblástica diferenciação de20. Seus perfis de mineralização foram analisados por métodos diferentes: coloração vermelho de alizarina-S (AR-S), ultravioleta (UV) luz visualização, imagem de microscopia eletrônica (TEM) de transmissão, energia dispersiva raio-x (EDX) de microanálise quantificação da e íon mapeamento. A vantagem da temperatura-EDX sobre alternativas técnicas utilizadas em estudos anteriores é que dá resultados quantitativos e qualitativos de substituição iônica em cristais de apatita a4,5,21. O objetivo geral de usar TEM-EDX foi encontrar um método simples para geração de imagens e quantificação da distribuição dos íons Ca, F e Cl em vários minerais de diferentes tipos de células durante estágios distintos do processo de mineralização. Este método tem sido utilizado com sucesso, por exemplo, para monitorar a interação de nanopartículas de zinco com produtos químicos coexistentes e seus efeitos combinados em organismos aquáticos22. Em outro estudo, um photocatalyst cobre em materiais de titânio em solução aquosa foi extensivamente caracterizado por espectrometria de emissão óptica de plasma indutivo (ICP-OES), physisorption N2 (BET), XRD, DRS UV-vis, FT-IR, Raman espectroscopia, TEM-EDX e photoelectrochemical medidas23. Nosso objetivo foi comparar a origem e propriedades de vesículas e minerais em duas linhas de celular para entender o mecanismo que controla a mineralização durante a diferenciação óssea.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57423/57423fig1.jpg"> Figura 1 . Esquema das etapas iniciais de mineralização em células ósseas envolvendo a síntese de proteínas da matriz extracelular (ECM) e a liberação das vesículas de matriz (MVs) da membrana. MVs acumulam cálcio através da ação de proteínas de ligação de cálcio, anexinas e fosfato, através da ação do transportador de fosfato inorgânico (PiT) seguido pela actividade de tecido não-específica da fosfatase alcalina (TNAP), que dephosphorylates PPeu Peu, facilitando assim a nucleação de apatita. Em seguida, MVs desintegrar-se e liberar apatites para o meio extracelular. A mineralização é sustentada pela oferta constante de Peu e Ca2 + no meio extracelular4,5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57423/57423fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s DMEM/F12 media mixture</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15-813</td>
			<td>1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#8217;s 5A medium</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E82312-0025</td>
			<td>for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ML</td>
			<td>100 U/mL each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-418</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68168</td>
			<td>0.3 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5960</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-GP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9422-100G</td>
			<td>7.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Gel HTP Gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>130-0420</td>
			<td>for HA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>synthesized by us</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>synthesized by us</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907/S8282</td>
			<td>0.1 M, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pH 7.0, prepared by us</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AR-S in PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5533-25G</td>
			<td>0.5 g/100 mL, pH 5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2674</td>
			<td>500 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCL buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared by us</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized wather</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>produced by us</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>POCh</td>
			<td>BA6480111</td>
			<td>absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate in 50% ethanol</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>21447-25</td>
			<td>0.25 g/10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>pH 7.4, prepared by us</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127/G-6257</td>
			<td>3%:1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post-fixation OsO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75633</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White resin in ethanol</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>17411-MUNC 500g</td>
			<td>1:2, 1:1, 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>CHEMPUR</td>
			<td>111024800</td>
			<td>pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>430487</td>
			<td>1.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096 and 352070</td>
			<td>15 and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes</td>
			<td>Falcon and VWR</td>
			<td>357521 and 612-3700</td>
			<td>1 and 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z688312 and Z628034</td>
			<td>1.5 mL black and 2 mL transparent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0364, 613-0239 and 613-1050</td>
			<td>0.1-10 &#181;L natural, 1-200 &#181;L yellow and 200-1000 &#181;L blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic racks</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A-7055-Z, A-7053-C</td>
			<td>green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Hera Save</td>
			<td>Thermo Scientific Co.</td>
			<td>KS12</td>
			<td>HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubators Hera Cell</td>
			<td>Thermo Scientific Co.</td>
			<td>150</td>
			<td>34&#176;C for hFOB 1.19 and 37&#176;C for Saos-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td>POLON</td>
			<td>WCS-2</td>
			<td>for TEM stainings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottles</td>
			<td>SIMAX</td>
			<td>1632414501050 and 1632414501100</td>
			<td>50 and 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz glass tubes</td>
			<td>SIMAX</td>
			<td>638422010100</td>
			<td>&#216; 10 mm, L 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump</td>
			<td>IBS Integra Biosciences</td>
			<td>VACUSAFE comfort</td>
			<td>for vacuum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UNE 400</td>
			<td>56&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain multi-well plate</td>
			<td>Rosenthal technik</td>
			<td>229/12</td>
			<td>12 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beakers</td>
			<td>SIMAX</td>
			<td>632417010025</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottles</td>
			<td>Pocord</td>
			<td>DIN22</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic box</td>
			<td>Agar Scientific Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>for darkness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap Fit Gelatin Capsules</td>
			<td>Agar Scientific Ltd.</td>
			<td>G3741</td>
			<td>size 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box</td>
			<td>Agar Scientific Ltd.</td>
			<td>S162N3</td>
			<td>film on the shiny side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon cell scraper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SIAL0010-100EA</td>
			<td>size 1.8/25 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with needle</td>
			<td>BogMark</td>
			<td>007</td>
			<td>syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Chirana</td>
			<td>CH005L</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>MPW Medical Instruments</td>
			<td>MPW-350R</td>
			<td>130 x g and 500 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV transluminator</td>
			<td>UVP</td>
			<td>M-20</td>
			<td>for visible and UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>LKB</td>
			<td>NOVA</td>
			<td>700&#197; sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block holder</td>
			<td>LKB</td>
			<td>E6711</td>
			<td>round shape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>DiATOME</td>
			<td>Ultra 45&#176;</td>
			<td>size 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>bovine, prepared by us</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>2855.1</td>
			<td>antistatic for grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatulas set</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>E286.1</td>
			<td>antistatic for powders</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Light Microscope</td>
			<td>Zeiss with Canon</td>
			<td>AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9</td>
			<td>Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus</td>
			<td>JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera</td>
			<td>magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera body and lenses</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon D7100 
			Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D 
			Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G 
			Nikkor AF 28 mm f/2.8D
</td>
			<td>for movie recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microphone</td>
			<td>MXL Mics</td>
			<td>Tempo</td>
			<td>for voice recordings</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of minerals produced by hfob 1.19 and saos-2 cells using transmission electron microscopy with energy dispersive x-ray microanalysis

Este vídeo apresenta o uso da microscopia eletrônica de transmissão com microanálise de raios-x energia dispersiva (EDX-TEM) para comparar o estado de minerais em vesículas lançadas por duas linhas de células de osso humano: hFOB 1.19 e Saos-2. Estas linhas de celular, após o tratamento com ácido ascórbico (AA) e β-glicerofosfato (β-GP), submetido a completa transdiferenciação celular osteogênico de proliferação de mineralização e produzir vesículas de matriz (MVs) que desencadeiam a nucleação de apatita na matriz extracelular (ECM).
Com base na coloração de vermelho de alizarina-S (AR-S) e análise da composição dos minerais em lisados celulares usando luz ultravioleta (UV) ou em vesículas utilizando imagens TEM seguida por íon mapeamento e quantificação de EDX, podemos inferir que osteossarcoma Saos-2 e osteoblásticas células hFOB 1.19 revelaram perfis distintos de mineralização. SAOS-2 células mineralize mais eficientemente do que as células hFOB 1.19 e produzem maiores depósitos minerais que não são visíveis sob luz UV, mas são semelhantes a hidroxiapatita (HA), em que eles têm mais Ca e F substituições.
Os resultados obtidos com estas técnicas nos permitem concluir que o processo de mineralização difere dependendo do tipo de célula. Propomos que, a nível celular, a origem e as propriedades das vesículas predeterminar o tipo de minerais.

Temperatura-EDX permite obter a imagem em vitro das vesículas de matriz (MVs) lançadas pela mineralização de células e de minerais produzidos por Mvs. os resultados obtidos usando esta técnica demonstram que o processo de mineralização pode proceder de forma diferente em vários tipos de células. As linhas de duas células receberam o mesmo tratamento de transdiferenciação celular osteoblástica, ainda estimulados Saos-2 células mais eficientemente do que hFO...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis at JoVE.com

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

Apresentamos um protocolo para comparar o estado de minerais em vesículas lançadas por duas linhas de células de osso humano: hFOB 1.19 e Saos-2. Seus perfis de mineralização foram analisados por alizarina Red-S (AR-S) coloração, visualização de luz ultravioleta (UV), imagem de microscopia eletrônica (TEM) de transmissão e microanálise de raios-x energia dispersiva (EDX).

Análise de minerais produzidos por hFOB 1.19 e Saos-2 células usando microscopia eletrônica de transmissão com energia dispersiva microanálise de raios-x

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Preparando células aderentes para fluorescência de raios-X Imagem por Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Química

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

Quantificação dos dados de fluorescência de raios-x usando mapas

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Liquid-cell Transmission Electron Microscopy for Tracking Self-assembly of Nanoparticles

Microscopia eletrônica de transmissão de líquido-celular para rastreamento auto-montagem de nanopartículas

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully ...

Obtaining 3D Chemical Maps by Energy Filtered Transmission Electron Microscopy Tomography

Obtenção de mapas 3D de químicos por energia filtrada tomografia computadorizada de microscopia eletrônica de transmissão

Energy filtered transmission electron microscopy tomography (EFTEM tomography) can provide three-dimensional (3D) chemical maps of materials at a ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Chips microfluídicos por difração de raio x de cristal In Situ e In Situ Difusão dinâmica da luz de cristalografia de Serial

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Elemental-sensíveis à deteção da química em baterias através de espectroscopia de absorção de raios-x moles e espalhamento inelástico de raios-x ressonante

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Using Graphene Liquid Cell Transmission Electron Microscopy to Study in Situ Nanocrystal Etching

Using Graphene Liquid Cell Transmission Electron Microscopy to Study in Situ Nanocrystal Etching

Usando Graphene líquido celular microscopia eletrônica de transmissão para estudar em Situ Nanocrystal gravura

Graphene liquid cell electron microscopy provides the ability to observe nanoscale chemical transformations and dynamics as the reactions are occurring in ...

Preparation of Graphene-Supported Microwell Liquid Cells for In Situ Transmission Electron Microscopy

Preparation of Graphene-Supported Microwell Liquid Cells for In Situ Transmission Electron Microscopy

Preparação de células líquidas de micropoços suportadas por grafeno para microscopia eletrônica de transmissão in situ

The fabrication and preparation of graphene-supported microwell liquid cells (GSMLCs) for in situ electron microscopy is presented in a stepwise protocol. ...

In situ Grazing Incidence Small Angle X-ray Scattering on Roll-To-Roll Coating of Organic Solar Cells with Laboratory X-ray Instrumentation

In situ Pastando Incidência Pequeno Ângulo de Raio-X Dispersão em Revestimento Roll-To-Roll de Células Solares Orgânicas com Instrumentação de raios-X de laboratório

We present an in-house, in situ Grazing Incidence Small Angle X-ray Scattering (GISAXS) experiment, developed to probe the drying kinetics of roll-to-roll ...

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Cristalização de proteínas no chip por microdiálise para estudos de difração de raios-X in situ

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...