Name: isolation and rna extraction of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains
Uploaded: 2018-04-27T14:00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains at JoVE.com

우리 초기 도움말 및 실험적인 접근 및 QMRI Flow Cytometry 셀 정렬 시설에 대 한 토론에 대 한 박사 클레어 데이비스와 닥터 베로 Miron (여왕의 의료 연구소, 에든버러, 유나이티드 Kingdome) 감사합니다. 이 작품은 박사 더크 Sieger에 암 연구 영국 경력 설립 수상에 의해 지원 되었다.

1. 샘플 및 미디어 준비
<ol><li>6.4 m KCl m, 0.22 m m NaCl, 0.33 m m CaCl2 2 H2O, 0.33 m m MgSO4 7 H2O H2o.에에서 용 해 하 여 배아 매체 (E3)를 준비</li>
	<li>수정 (0 dpf) 후 즉시 zebrafish 태아를 수집 합니다.<ol>
<li>Zebrafish 태아 90 mm 페 트리 접시 당 50 분할. 착 색을 억제 하는 실험의 기간에 대 한 개발 (0 dpf)의 첫번째 날의 끝에서 배아 매체 (E3) 200 µ M 1-페 닐 2-thiourea (PTU), 치료의 50 mL에 28.5 ° C에서 배아를 올립니다.</li>
		<li>변화는 E3 + 실험 기간 동안 매일 통해 매체.</li>
		<li>Mpeg1:eGFP 및 NBT:DsRed 애벌레 2 dpf 긍정적인 transgene 식, GFP+ 세포/microglia 및 DsRed+ 뉴런에 대 한 형광 stereomicroscope를 사용 하 여에서 화면.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모든 미디어, 오염을 피하기 위하여 조직 문화 후드 실험 전날 준비 다음 4 ° c.에서 그들을 저장합니다<ol>
<li>15 mM Hepes, HBSS 1에서에서 25 m m D-포도 당을 용 해 하 여 준비 하는 미디어 A x.</li>
		<li>HBSS 10의 1 볼륨에 밀도 그라데이션 매체의 9 볼륨을 혼합 하 여 밀도 그라데이션 매체 (100%)를 준비 x.</li>
		<li>밀도 그라데이션 매체 (22%)을 준비 하는 DPBS 1의 88 ml에서 밀도 그라데이션 매체 (100%)의 22 mL를 diluting 하 여 x.</li>
		<li>준비 하는 DPBS 1 x.</li>
		<li>E3 매체 + Tricaine 450 μ M으로 E3 매체를 혼합 하 여 준비 Tricaine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 균질
참고: 모든 단계는 수행된 4 ° c.
<ol><li>90 mm 페 트리 요리 E3 배아 매체 200 µ M 말기 그들을 anesthetize를 통해 치료의 50 ml 50 애벌레를 1.5 mL Tricaine (15 m m)를 추가 합니다.<ol>
<li>3 mL 파스퇴르 대량 플라스틱 피 펫과 페 트리 디쉬에서 10 마 취 애벌레 빨 아.</li>
		<li>취 전송 애벌레 55 mm 페 트리 접시에 10 10 얼음 E3 배아 매체 + Tricaine로 가득합니다.</li>
		<li>Stereomicroscope, 아래 10 애벌레 페 트리 접시의 중앙에 맞춥니다. 다음 노 른 자-sac 수술 마이크로-가 위 (수영 방광을 피하기 위해 머리를 부동 제외)를 사용 하 여 위에 애벌레 머리 transect.</li>
		<li>3 mL 파스퇴르 대량 플라스틱 피 펫과 페 트리 디쉬에서 빨 아. 모든 머리 피 펫 팁 내에서 수집 하 고 다음 1 mL 차가운 미디어 A를 포함 하는 유리 균질 화기로 전송 될 때까지 기다립니다 (전송 미디어를 줄이기 위해 최소 볼륨에서 희석 e 3 + Tricaine). 얼음에 유리 균질 화기를 유지. 실험 조건 당 한 균질 화기를 사용 합니다.</li>
		<li>각 작은 페 트리 접시를 포함 하는 얼음 교체 차가운 E3 + Tricaine 새 것으로 그 transection 보장 하기 위해서 모든 30 분 차가운 E3 + Tricaine에서 수행 하는 매체.</li>
		<li>색상 페이딩 시작 유리 균질 화기에 얼음 처럼 차가운 미디어 A를 교체 합니다. 참고: 미디어 A 희석 온도 변화 머리 조직을 변경할 수 있습니다.</li>
		<li>모든 머리 수집 된 일단 (600 머리/조건), 유리 균질 화기에서 미디어의 최대 볼륨을 제거 하 고 신선한 얼음 처럼 차가운 미디어 a 1 mL와 함께 그것을 대체합니다</li>
		<li>얼음 꽉 유리 균질 화기와 뇌 조직 방해. 3-5 dpf 애벌레 및 7 및 8 dpf 애벌레에 대 한 50의 분쇄 40 라운드를 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 현 탁 액에 미디어 A의 2 개 mL를 추가 (1 mL 미디어 A 200 / 머리), 세포를 희석 하 고 수 초 밀도 그라데이션 매체에서 원심 분리 하는 동안 그들의 분리를 촉진 하기 위하여와 그들의 덩어리를 줄이기 위해.<ol>
<li>세포 덩어리를 제거 하려면 얼음에 유지 찬 50 mL 팔 콘 튜브 위에 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 실행 합니다. 3 번이이 작업을 반복 합니다.</li>
		<li>차가운 1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액 1 mL를 전송 및 4 ° c.에서 10 분 300 g에서 그들을 회전합니다</li>
		<li>10 mL 주사기를 사용 하 여 상쾌한 제거 + 바늘 23G x 1'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다시 1 mL의 얼음 처럼 차가운 22% 밀도 그라데이션 부드럽게 차가운 DPBS 1의 0.5 mL에 의해 중첩 된 셀 펠 릿을 일시 중단 (그들, 두 솔루션 사이의 interphase 나타납니다 혼합 하지 마십시오) x.<ol>
<li>4 ° c.에 30 분 동안 느린 가속 및 브레이크 없이 950 g에서 튜브를 회전 참고: 이 단계는 DPBS 1의 interphase에 격리 하 여 다른 셀에서 myelin를 분리 x와 22% 밀도 그라데이션 매체, 반면 셀 튜브의 하단에 작은 것입니다. 수 초 제거 세포 농도가 너무 높은 경우 더 효율적입니다.</li>
		<li>그들의 interphase 10 mL 주사기 + 바늘 23G x 1' 삭제 DPBS, 밀도 그라데이션 매체 및 myelin의 최대 갇혀 사용 하.</li>
		<li>미디어의 0.5 mL + 2% 정상 염소 혈 청 (NGS)의 세포를 씻어 다음 4 ° c.에서 10 분 300 g에서 튜브를 회전</li>
		<li>상쾌한, 최대 삭제 다음 미디어 A + 2%의 동일한 실험 조건 함께 1 mL에서에서 모든 셀 펠 릿 풀 NGS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>관심사의 세포 대 식 세포/microglia mpeg1:eGFP에서 처럼 형광 단백질 또는 NBT:DsRed 유전자 변형 물고기 (유전자 변형 물고기 1.1.3의 심사), 35 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 실행에서 뉴런 뚜껑과에 그들을 전송 하는 경우는 차가운 5 mL FACS 빛 으로부터 보호과 얼음, 튜브. 참고: Microglia의 면역 얼룩을 또는, 수행할 수 있습니다.</li>
</ol>3. Microglia Immuno 얼룩이
참고: 4 ° c.에 모든 단계를 수행
<ol><li>다시 미디어 A + 2%의 0.3 mL와 함께 셀 펠 릿을 일시 중단 NGS. 3 x 1.5 mL 튜브에 그들을 분할: 흠 없는 세포 비 특정 바인딩 microglia 및 세 번째 시험으로 이차 항 체의 측정을 이차 항 체 (1/200)에 대 한 관심의 셀에서 자동 형광 두 번째 측정 한 (4C 4 마우스 단일 클로 널 (해당 microglia)는 항 체 (1/20) + 2 차 항 체 (1/200)).<ol>
<li>낮은, 아 지 드 무료 (잎) 세포 (모든 튜브)를 1%에서 면역 글로불린의 Fc 도메인 CD16/CD32 상호 작용을 차단 하를 추가 합니다. 부드러운 동요 매 5 분으로 10 분에 대 한 셀을 품 어.</li>
		<li>4C 4 추가 항 체 (1/20) 셀 (관 3)와 품 어 부드러운 교 반으로 30 분 마다 10 분.</li>
		<li>4 ° C에서 10 분 300 g에서 튜브를 회전 다음 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>일단 미디어 A + 2 %0.5 mL와 NGS, 다음 4 ° c.에서 10 분 300 g에서 튜브 회전 세척</li>
		<li>미디어 A + 2%의 0.5 ml와 함께 셀 펠 릿 다시 중단 NGS와 부드러운 동요 매 5 분으로 10 분에 대 한 1%에서 잎 세포를 품 어.</li>
		<li>셀 (튜브 2와 3)를 이차 항 체 (1/200)를 추가 합니다. 매 10 분 및 가벼운 보호 부드러운 동요와 30 분에 대 한 셀을 품 어.</li>
		<li>4 ° C에서 10 분 300 g에서 튜브를 회전 한 다음 상쾌한 삭제.</li>
		<li>미디어 A + 2%의 1 mL와 함께 미디어 A + 2%, NGS 다음 다시 일시 중지 셀 펠 릿의 0.5 mL로 두 번 세척 NGS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>35 µ m 셀 스 트레이너 모자를 통해 세포 현 탁 액을 실행 하 고 빛 으로부터 보호 하는 얼음에 차가운 5 mL FACS 튜브로 그들을 전송.</li>
</ol>4입니다. 셀 정렬 (FACS)
참고: 4 ° c.에 모든 단계를 수행
<ol><li>신경 세포, 대 식 세포/microglia 및 microglia를 FACS를 사용 하 여 정렬 합니다. 참고: 이 단계는 일반적으로 FACS 시설의 직원에 의해 수행 하 고 설정을 사용 하는 장비의 유형에 따라 다릅니다.<ol>
<li>죽은 세포를 각 FACS 튜브에 1 µ g/mL의 농도에서 DAPI를 추가 합니다.</li>
		<li>모든 뇌 세포에서 FACS 및 정렬 신경 세포, 대 식 세포/microglia 또는 microglia를 설정 합니다. 그들의 크기, 단위, 그리고 앞으로 분산형 및 사이드 분산형 게이트 단일 세포의 기능에 있는 파편에서 별도 셀. DAPI에서 라이브 셀 라벨에 의해 죽은 세포를 제외 합니다. 그들의 각각 긍정적인 얼룩에 의해 신경 세포, 대 식 세포/microglia 또는 microglia를 식별 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 미디어 A + 2%의 1 mL를 포함 하는 1.5 mL 튜브에 세포를 수집 NGS 얼음에. 다른 튜브를 사용 하 여 각 세포 유형에 대 한.<ol>
<li>4 ° C에서 10 분 300 g에서 튜브를 회전 하 고는 상쾌한 다음 삭제.</li>
		<li>미디어의 0.5 mL로 한 다음 삭제 상쾌한 최대 한 번 씻는 다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. RNA 추출
<ol><li>FACS를 구분 하는 다른 세포 유형에서 RNA를 추출 합니다. RNA 추출에 대 한 특정 키트를 사용 하 고 제조업체의 지침을 따릅니다. 청소 작업 영역 및 RNase 오염 제품 펫 RNase 무료 환경에서 작동 하는 필터 팁을 사용 하 여 확인 합니다.<ol>
<li>갓 50 µ M β-mercaptoethanol 보충 하는 세포의 용 해 버퍼의 1 mL를 준비 합니다. 참고: 여기서, β-mercaptoethanol RNA 저하를 줄이기 위해 추가 됩니다.</li>
		<li>무료 물 70%와 80% 에탄올 솔루션 RNase를 사용 하 여 준비 합니다.</li>
		<li>세포 세포의 용 해 버퍼 50 µ M β-mercaptoethanol 보충의 75 µ L lyse 다음 세포 파쇄를 분쇄기를 사용.</li>
		<li>제조 업체에 따라 RNA 추출의 매뉴얼을 계속 한다.</li>
		<li>프로토콜의 끝에, 충분 한 RNA 농도를 RNase 무료 물 14 µ L로 RNA elute.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chrast, R., Scott, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mouse+Brain+Transcriptome+by+SAGE:+Differences+in+Gene+Expression+between+P30+Brains+of+the+Partial+Trisomy+16+Mouse+Model+of+Down+Syndrome+(Ts65Dn)+and+Normals.">The Mouse Brain Transcriptome by SAGE: Differences in Gene Expression between P30 Brains of the Partial Trisomy 16 Mouse Model of Down Syndrome (Ts65Dn) and Normals.</a> Genome Research. 10 (12), 2006-2021 (2000).</li><li>Beis, D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+biology:+following+the+zebrafish+trend.">In vivo cell biology: following the zebrafish trend.</a> Trends in Cell Biology. 16 (2), 105-112 (2006).</li><li>Shiau, C. E., Kaufman, Z., Meireles, A. M., Talbot, W. 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저자는 공개 없다.

여기에 설명 된 실험 프로토콜 8 dpf에 3에서 zebrafish 애벌레에서 뇌 세포를 분리 하는 강력 하 고 효율적인 방법을 나타냅니다. 중요 한 것은, 이것은 첫 번째 프로토콜에서 애벌레 zebrafish 두뇌 microglia의 특정 격리를 허용입니다. 프로토콜은 세포 막의 무결성을 유지 하 고 처리 하는 동안 발생 하는 유전자 발현의 잠재적인 수정 최소화 하기 위해 설계 되었습니다. 이 마지막 점은 그 고립 된 세포 게놈 프로 파일의 분석에 따라 결과의 관련성에 대 한 중요 한 있습니다. 실제로, microglia 및 macrophage 분극 강하게 그들의 microenvironment에 의해 영향을 받습니다. 37 ° C에서이 세포 실험 조건 (부상 (transection) 응답)에 자신의 유전자 식 프로필을 변경 것입니다. 따라서, 그것은 이전 세포 프로세스 및 신진 대사 활동을 천천히 RNA 추출, 4 ° C에서이 실험을 수행 하는 중요 한 했다. 또한, 기계적 뇌 조직 균질 4 ° C에서 37 ° C에서 효소 조직 소화 대신 유전자 식 프로필에 어떤 영향을 피하기 위해 선정 되었다.
이 메서드는 매우 빠른; 강조 하는 것이 중요 하다 하루 내 여러 뇌 세포 인구는 적어도 두 개의 다른 실험 조건 및 그들의 RNA 추출에서 격리 될 수 있습니다. 프로토콜의 총 길이 애벌레 머리의 transection 제한 단계 (∼ 350 머리/h)으로 각 조건에 대해 사용 하는 애벌레의 수에 따라 달라 집니다. 일반적으로 3에서 microglia를 작업할 5 및 7 dpf이 좋습니다 transect ∼ 600 머리 (표 1)를 추출 하는 충분 한 RNA를 시험 당 하. Microglia 셀 형식을 나타내는 낮은 산출 (7 dpf에 인당 약 112 세포), 대 식 세포 (7 dpf에 인당 약 170 세포)를 포함 하 여 다른 세포 유형 머리의 수를 줄일 수 있습니다.
이 프로토콜의 또 다른 장점은 FACS 정렬 설정이 설정 된 후 동일한 설정을 사용할 수 있는 다양 한 실험에 대 한. 그것은 세포 인구 맞는 완벽 하 게 한 실험에서 다른 이전 설계, 게이츠와 함께이 메서드를 사용 하 여 실험의 재현성을 보여주는 관찰 되었습니다.
이 방법의 약간의 불리는 수확 하는 RNA의 상대적으로 낮은 금액입니다. 그러나,이 제한은 microglia 수로 두뇌 개발 (표 1)의 초기 단계에서 매우 낮은 기술적인 문제 보다는 더 많은 생물 학적 문제입니다. 수집 하는 RNA의이 낮은 양 때문에 증폭 단계 게놈 넓은 유전자 표정 분석을 수행 하기 위해 고려 될 필요가 있다. 다행히도, 이러한 증폭 단계 고품질 cDNA의 충분 한 양을 생산. 따라서, 고립 된 세포의 유전자 식 프로필에 글로벌 변화는 공부 될 수 있다.
결론적으로,이 프로토콜에는 격리 하 고 애벌레 zebrafish 두뇌에서 다양 한 CNS 셀 유형을 공부 강력한 방법을 제공 한다. 이것은 또한 질병에 그들의 역할을 연구로 개발 하는 동안이 세포의 깊은 이해를 얻기 위해 적용할 수 있습니다.

두뇌 개발 및 뇌 질환에 대 한 지식을 마우스 뇌 transcriptomes1의 첫 번째 정량화 이후 지난 10 년간에서 크게 개선 했다. 실제로, 게놈 넓은 유전자 표정 분석 우리에 액세스할 뇌 조직 및 보완 하 고 관측 다른 기술 및 도구를 향상 시킬 수 있는 셀에 대 한 자세한 유전 정보.
제 브라는 쉽게 번 식 하 고 유전자; 수정 강력한 생물 학적 모델 애벌레 단계에서 광학 투명도 라이브 이미징 관찰2수 있습니다. 불행 하 게도, 인간을 비교 하 고 마우스, immuno 얼룩이 수행에 사용할 수 있는 항 체의 수는 오히려 낮은. 이 문제를 해결 하려면 유전자 변형 zebrafish 물고기 라인 쉽게 만들어집니다 유전자 물고기를 수정 하 여 셀 형식 특정 발기인에서 형광 단백질을 표현 하. 유전자 변형 zebrafish 라인 중앙 신경 시스템 (CNS) 개발 및 질병3,4,,56동안 microglia 및 대 식 세포의 역할을 공부 하는 과거에 사용 되었습니다. 그러나, 이러한 프로세스의 상세한 이해를 얻기 위해 우리가 해당 셀 형식에서 유전자 발현에 변화를 이해 해야 합니다. 이 목표를 우리는 특별히 신경 세포, 대 식 세포 및 8 일 3에서 microglia 같은 세포를 분리 하는 실험 방법 개발 후 수정 (dpf) 애벌레 zebrafish 두뇌. 프로토콜의 설립에 대 한 우리 신경 신경 ß-tubulin 아래에 있는 대 식 세포 표현 유전자 발기인 (mpeg1:eGFP) 및 DsRed 세포/microglia에서 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현 하는 유전자 변형 물고기 라인 근무 발기인 (NBT:DsRed)7,,89. 또한, 우리는 immuno 얼룩이 microglia 4C 4, 특별히 zebrafish microglia10,11얼룩 마우스 단일 클론 항 체를 사용 하 여의 수행. 이후에, ribonucleic 산 (RNA) 추가 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 또는 transcriptome 분석에 대 한 이러한 세포에서 추출 됩니다. 이 프로토콜 zebrafish 애벌레;에서 뇌 조직을 효율적으로 균질 하도록 설계 되었습니다. 신경 세포, 세포/microglia 및 그들의 원형질 막 무결성의 변경 없이 microglia를 수집 하 고 마지막으로 높은 품질의 이러한 세포에서 RNA 추출 (린 > 7) 및 게놈 분석을 수행 하는 수량. 뇌 조직12,13소화를 트립 신 처리 37 ° C에서 사용 하는 연구에 대 한 이전 게시, 달리이 프로토콜 RNA 추출 단계를 줄이기 위해 유전자 식 프로필의 수정까지 4 ° C에서 작업을 촉진 합니다. 이 단계는 결정적으로 microglia 및 대 식 세포는 매우 중요 한 세포는 그들의 진 식 프로필과 분극14,15, 를 변경 하 여 즉시 그들의 microenvironment에 있는 변화에 응답 16.
세부 사항에, 여기에 설명 된 프로토콜 신경 세포, 대 식 세포 및 microglia zebrafish 애벌레 두뇌에서 거의 그것의 다른 셀에 적용할 수 있습니다 보여줍니다 뇌-유전자 변형 물고기 라인을 사용 하 여 내 제시 또는 함께 표시 특정 항 체입니다. 이 방법은 그들의 게놈 넓은 유전자 표정 분석을 통해 CNS 세포의 더 나은 특성화 고 개발 및 뇌 질환 중 그들의 역할을 이해 하는 데 도움이 됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:840px;" width="840">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:319px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">P7629</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Hepes</td>
			<td style="width:319px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:319px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">G8644-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HBSS 1X</td>
			<td style="width:319px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">14170-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Percoll</td>
			<td style="width:319px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:103px;">17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HBSS 10X</td>
			<td style="width:319px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">14180-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS 1X</td>
			<td style="width:319px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine (MS222)</td>
			<td style="width:319px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sterilin standard 90mm petri dishes</td>
			<td style="width:319px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:103px;">101VIRR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Surgical micro-scissors</td>
			<td style="width:319px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:103px;">15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">3 mL Pasteur plastic bulk pipette</td>
			<td style="width:319px;">SLS</td>
			<td style="width:103px;">PIP4206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Glass homogenizer</td>
			<td style="width:319px;">Wheaton</td>
			<td style="width:103px;">357538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sterilin standard 55mm petri dishes</td>
			<td style="width:319px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:103px;">P55V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Percoll</td>
			<td style="width:319px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:103px;">17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">40 &#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:319px;">Falcon</td>
			<td style="width:103px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">50 ml polypropylen conical tube</td>
			<td style="width:319px;">Falcon</td>
			<td style="width:103px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:319px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:103px;">5804 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">10 mL syringe</td>
			<td style="width:319px;">BD</td>
			<td style="width:103px;">302188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Needle 23G x 1&#39;&#39;</td>
			<td style="width:319px;">BD</td>
			<td style="width:103px;">300800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Normal goat serum (NGS)</td>
			<td style="width:319px;">Cell Signalling</td>
			<td style="width:103px;">5425S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">35 &#956;m cell strainer cap</td>
			<td style="width:319px;">BD</td>
			<td style="width:103px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">FACS tubes</td>
			<td style="width:319px;">BD</td>
			<td style="width:103px;">352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF)</td>
			<td style="width:319px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">101321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-4C4</td>
			<td colspan="2">Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">FACS sorter FACSAria II</td>
			<td style="width:319px;">BD</td>
			<td colspan="2">QMRI, FACS facility</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td style="width:319px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:103px;">74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:319px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">&#160;31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">QIAshredder</td>
			<td style="width:319px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:103px;">79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td style="width:319px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:103px;">1725271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td style="width:319px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">18080-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">LightCycler 96 Real-Time PCR System&#160;</td>
			<td style="width:319px;">Roche</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Ovation RNA-Seq System V2</td>
			<td style="width:319px;">NuGEN</td>
			<td style="width:103px;">7102-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Agilent RNA 6000 Pico reagents</td>
			<td style="width:319px;">Agilent</td>
			<td style="width:103px;">5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:319px;">Agilent</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNaseZap</td>
			<td style="width:319px;">Ambion</td>
			<td style="width:103px;">AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and rna extraction of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains

개발 또는 설립 중 다른 CNS 세포의 역할에 대 한 상세한 이해 및 두뇌 병 리의 진행을 얻으려면, 그것은 그들의 유전자 식 프로 파일을 변경 하지 않고 이러한 세포를 분리 하는 것이 중요. Zebrafish 모델 제공 많은 유전자 변형 물고기 라인 있는 특정 세포 유형 표시 됩니다; NBT:DsRed 선 또는 대 식 세포/microglia mpeg1:eGFP 라인에서 하는 예를 들어 신경에 대 한 또한, 항 체 개발 되었습니다 microglia 4C 4와 같은 특정 세포를 얼룩이 항 체.
여기, 우리 신경 세포, 대 식 세포에서 애벌레 zebrafish 두뇌 microglia의 설명. 이 프로토콜은 셀룰러 프로필을 수정할 수 있는 37 ° C에서 효소 조직 소화의 회피입니다. 4 ° C에서 조직 균질의 기계 시스템 대신 사용 됩니다. 이 프로토콜 세포 현 탁 액으로 두뇌의 균질, 그들의 immuno 얼룩이 지 고 신경 세포, 대 식 세포 및 FACS에 의해 microglia의 격리를 의미 한다. 이후에, 우리는 그 세포에서 RNA를 추출 하 고 그들의 품질/수량 평가. 우리는 고품질의 RNA를 관리 (RNA 무결성 번호 (린) > 7) 세포/microglia 및 신경, 그리고 transcriptomic microglia 분석에서 정량 수행 하. 이 방법은 개발 및 pathologies에 그들의 역할에 대해 명확 하 게 이해로 서이 세포의 더 나은 특성을 수 있습니다.

설명된 프로토콜은 신경 세포, 대 식 세포 및에서 zebrafish 애벌레 두뇌 microglia 분리 간단 접근 이다. 이들에서 고립 세포, 높은 품질의 상당수 (린 > 7) RNA 추출 되었다. 이 프로토콜의 목표 분석 및 셀 속성 및 기능 특성에 그들의 유전자 식 프로 파일의 최소 수정 CNS에서 다른 종류의 세포를 분리 하는. 따라서, 전체 프로토콜 기계적 뇌 조직 균질 화와 4 ° C에서 수행 됩니다. 이 방법은 실험실에서 수행 하는 두 개의 연구 성공적으로 사용 되었습니다. 첫 번째 연구에서 신경 세포와 대 식 세포/microglia 8 dpf mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+ 애벌레 (그림 1)에서 분리 했다. 그들의 크기의 기능에서 파편에서 셀 분리를 허용 하는 FACS (FSC-A) 및 세분성 (SSC-A) (그림 1A). 단일 셀 다음 남자 또는 세포 응집 체 (그림 1B)에서 분리 되었다. 단일 세포 인구에서 죽은 세포 (DAPI+)를 제거 하는 게이트 그려 했다. 해당 점 플롯으로 죽은 세포의 비율은 26.7% (그림 1C)만이 실험 프로토콜 세포 원형질 막 무결성을 보존 공개 했다. 마지막으로, 신경 (DsRed+)와 대 식 세포/microglia (GFP+) 쉽게 라이브 셀 인구 게이츠에서 차별 했다. 신경 인구 (23.1%) (그림 1D) 뇌 내 세포/microglia 인구 (1.56%) 보다 더 두드러진 것으로 나타났다. 이 프로토콜을 신경 세포와 대 식 세포/microglia 사이 특정 유전자의 표정을 비교할 후속 정량 분석을 수행 하려면 그 세포에서 RNA를 분리를 허용 했다. 그림 2 쇼 신경 고 증식 세포 핵 항 원 (pcna)예를 들어 β-걸 집 지키는 유전자에 대 한의 대 식 세포/microglia 유전자 식 수준.
두 번째 연구에 대 한이 방법은 3, 5, 7 dpf 애벌레 두뇌 microglia 절연에 집중 했다. 위에서 설명한 실험과 달리 세포 면역 염색에 의해 고립 되었다 4C 4, 특히 라벨 microglia (그림 3 A D)는 항 체를 사용 하 여. 앞에서 설명한, microglia (4C 4+) 라이브 셀에서 선정 됐다 고 (그림 3D) 수집. Zebrafish 애벌레 두뇌 내의 Microglia 번호는 변수 (표 1), 3 dpf (물고기 당 25 ∼)에서 매우 낮은. 그 세포에서 추출 된 RNA의 양과 품질 마이크로 모 세관 전기 이동 법 기반 시스템을 사용 하 여 측정 되었다. 결과 5 dpf 애벌레 zebrafish 두뇌 microglia에서 추출 된 RNA의 RNA 분석 (표 1 (5 dpf; 실험 4))의 예를 보여 주기 위해 제공 되었습니다. 그림 4 는 전기 추적 및 리보솜 RNA (28s와 18s)의 명확한 시각화로이 샘플에 대 한 얻은 그것의 그래픽 표현. 이 데이터는 샘플 린 계산 하 고 RNA 농도 결정 하는 데 필요한. 표 1 절연된 microglia 생선과 microglia 당 RNA의 양을 각각 다른 실험 3, 5, 7 dpf에 대해 린 점수 당 수를 요약 합니다. 이 메서드를 사용 하 여 격리 microglia에서 추출 된 RNA의 품질과 양을 키트를 사용 하 여 cDNA로 RNA를 증폭 수 있었습니다. 에 딘 버 러 유전체학에서 제공 하는 품질 및 수량 테스트 증폭된 cDNA 라이브러리 준비 및 후속 시퀀싱에 대 한 충분 한 품질의 확인. 그림 5 는 cDNA 조각 및 전기 이동 시스템을 사용 하 여 측정 하는 그들의 금액의 크기 분포를 보여준다. 이 샘플에는 cDNA 36100의 농도에 299bp의 평균 크기를 했다 pmol/l. 표 2 는 각각 RNA 샘플 (표 1 (5 dpf; 실험 4))에서 증폭 된 cDNA에서 품질과 수량 테스트를 보여 줍니다. 증폭된 cDNA는 시퀀싱을 위해 성공적으로 사용 되었습니다.
실험실에서 수행 하는 여러 연구 확인 품질 신경 세포, 대 식 세포 및 microglia에서 추출 된 RNA의 수량 및 후속 정량 및 게놈 넓은 진 식 분석에 사용할 수 있습니다. 따라서,이 실험 프로토콜 안정적으로 막 무결성을 변경 하 고 그들의 유전자 식 프로 파일의 수정에 제한 하지 않고 CNS 세포의 다른 종류를 분리 사용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig1.jpg"> 그림 1 : 신경 세포와 대 식 세포/microglia mpeg1:GFP+/NBT:DsRed+ 에서 8 dpf zebrafish 애벌레 정렬 FACS. (A-C) 연속 게이팅의 모든 뇌 세포 () 순차 선택, 앞으로 분산형과 측면에 의해 단일 셀 분산형 (B). (C) 죽은 세포 DAPI 라벨에 의해 제외 되었습니다. (D) 신경 세포 및 대 식 세포/microglia 각각 DsRed와 GFP 긍정적인 얼룩에 의해 확인 되었다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig2.jpg"> 그림 2 : 유전자 표정 분석 pcna 및 신경 세포와 대 식 세포/microglia β-말라 . 격리 된 신경 세포와 대 식 세포/microglia RNA 정량 PCR 분석에 사용 하기 위해 cDNA에는 복사할 수 수 있습니다. 격리 된 신경 세포와 대 식 세포/microglia 정량에 의해 결정에서 β-걸 집 지키는 유전자에 대 한 pcna 의 mRNA 식 레벨 (N = 3). 배 변화 비교 (ΔΔCT) 메서드를 사용 하 여 측정 했다. 오차 막대 대표 평균 ± SEM. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig3.jpg"> 그림 3 : FACS microglia 3 dpf zebrafish 애벌레에서에 대 한 정렬. (A-C) 연속 제어 순차 선택 모든 뇌의 세포 (A), 앞으로 분산형과 측면에 의해 단일 셀 분산형 (B). (C) 죽은 세포 DAPI 라벨에 의해 제외 되었습니다. (D) Microglia 4C 4에 의해 확인 되었다 긍정적인 얼룩이 지기. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig4.jpg"> 그림 4 : 5 dpf zebrafish microglia에서 추출 된 RNA의 마이크로 모 세관 전기 이동 법 결과. 두 개의 큰 봉우리는 18와 28S ribosomal RNA. RNA 무결성 번호 (린)은 28S ribosomal 소 단위는 18의 생성된 비율 및 전체 전기 이동 추적의 분석을 사용 하 여 bioanalyzer 소프트웨어에 의해 자동으로 계산 됩니다. Microglia RNA 린 8.6 있다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig5.jpg"> 그림 5 : 5 dpf zebrafish microglia의 RNA 샘플에서 증폭 된 cDNA의 품질과 수량 테스트. 화면은 299의 평균 크기를 가진 cDNA 조각 크기 분포 분석된 샘플의 bp. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>조건</td>
			<td>실험</td>
			<td>물고기 수</td>
			<td>휴대폰 번호</td>
			<td>물고기 당 휴대폰 번호</td>
			<td>RNA 농도 (pg/ul)</td>
			<td>총 RNA (pg)</td>
			<td>셀 (pg) 당 RNA 금액</td>
			<td>린 점수</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>700</td>
			<td>11922</td>
			<td>17.03</td>
			<td>126</td>
			<td>1512</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>22527</td>
			<td>37.55</td>
			<td>253</td>
			<td>3036</td>
			<td>0.13</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>18688</td>
			<td>31.15</td>
			<td>255</td>
			<td>3060</td>
			<td>0.16</td>
			<td>7.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>11121</td>
			<td>18.54</td>
			<td>189</td>
			<td>2268</td>
			<td>0.20</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>15581</td>
			<td>25.97</td>
			<td>131</td>
			<td>1572</td>
			<td>0.10</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>11965</td>
			<td>19.94</td>
			<td>256</td>
			<td>3072</td>
			<td>0.26</td>
			<td>8.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>58629</td>
			<td>97.72</td>
			<td>362</td>
			<td>4344</td>
			<td>0.07</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>32510</td>
			<td>54.18</td>
			<td>348</td>
			<td>4176</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>77884</td>
			<td>129.81</td>
			<td>594</td>
			<td>7128</td>
			<td>0.09</td>
			<td>8.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>50755</td>
			<td>84.59</td>
			<td>305</td>
			<td>3660</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>44967</td>
			<td>74.95</td>
			<td>134</td>
			<td>1608</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>51031</td>
			<td>85.05</td>
			<td>163</td>
			<td>1956</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>60496</td>
			<td>100.83</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>450</td>
			<td>55517</td>
			<td>123.37</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>88897</td>
			<td>148.16</td>
			<td>465</td>
			<td>5580</td>
			<td>0.06</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>63008</td>
			<td>105.01</td>
			<td>356</td>
			<td>4272</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>350</td>
			<td>34956</td>
			<td>99.87</td>
			<td>245</td>
			<td>2940</td>
			<td>0.08</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>63887</td>
			<td>106.48</td>
			<td>341</td>
			<td>4092</td>
			<td>0.06</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: microglia 격리 및 3, 5, 7 dpf zebrafish 애벌레에서 RNA 추출 데이터의 요약.
<table fo:font-size="7" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>내부 샘플 ID</td>
			<td>외부 샘플 ID</td>
			<td>큐 비트 (ng/ul)</td>
			<td>Qubit(ng/ul)</td>
			<td>평균 농도 (ng/ul)</td>
			<td>볼륨 (ul)</td>
			<td>ug 받은</td>
			<td>최소 농도 대 한 합격/불합격</td>
			<td>Minimim 수량에 대 한 합격/불합격</td>
			<td>권장된 수량에 대 한 합격/불합격</td>
		</tr>
<tr>
<td>10907SD0010</td>
			<td>5 dpf (실험 4)</td>
			<td>58.8</td>
			<td>58.4</td>
			<td>58.6</td>
			<td>30</td>
			<td>1.76</td>
			<td>패스</td>
			<td>패스</td>
			<td>패스</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="10">샘플 라이브러리 준비에 대 한 요구 사항:</td>
		</tr>
<tr>
<td>라이브러리 준비</td>
			<td>최소 수량 (ng)</td>
			<td>권장된 수량 (ng)</td>
			<td>최소 농도 ng/uL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>TruSeq 나노 젤 cDNA에서 무료 350 bp 삽입 라이브러리</td>
			<td>600</td>
			<td>1100</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 5의 dpf zebrafish microglia의 RNA 샘플에서 증폭 된 cDNA의 수량 테스트 합니다.

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Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

절연 및 애벌레 Zebrafish 두뇌에서 신경 세포, 대 식 세포 및 Microglia RNA 추출

우리는 신경 세포, 대 식 세포 및에서 생리 및 병 적인 조건 하에서 애벌레 zebrafish 두뇌 microglia 분리 프로토콜을 제시. 절연, 시 RNA 유전자 식 프로필 분석 하이 셀에서 추출 됩니다. 이 프로토콜 정량 및 transcriptomics 같은 다운스트림 분석에 대 한 높은-품질 RNA의 컬렉션에 대 한 수 있습니다.

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

태아 쥐의 Hippocampal 신경 세포의 분리 및 문화

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

연구

신경과학

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

애벌레의 Zebrafish의 Forebrain Electrophysiological 기록

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

병아리 배아에서 분리 및 해리 감각 뉴런의 문화

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

파킨슨 뇌에서, 수용성 알파 시누 클레인의 순차 추출

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

제거<em&gt; 초파리</em감각 뉴런과 표피 세포의 면역 형광 분석을위한 애벌레 필렛에서&gt; 근육 조직

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

신생아 생쥐의 척수 신경 세포 분리 및 배양

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

초파리 melanogaster Larval 및 성인 두뇌의 변화 분석

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...