Name: automated slide scanning and segmentation in fluorescently-labeled tissues using a widefield high-content analysis system
Uploaded: 2018-05-03T14:00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System at JoVE.com

Dette projekt blev finansieret af et tilskud fra den canadiske institutter for sundhedsforskning og Alberta innoverer - sundhed løsninger/Alberta Cancer Foundation. Forfatterne vil gerne anerkende regenerering enhed i neurobiologi core facilitet for brugen af deres udstyr, Paula Gedraitis arbejde i bygge fundamentet, hvorpå diasscanning på WHCAS blev muliggjort, og skaberen af produkterne nævnt i denne artikel, molekylære enheder.

Tumor prøver blev indhentet ifølge protokollen godkendt af den lokale institutionelle review board og etik og gennemføres i overensstemmelse med nationale bestemmelser. WHCAS og dens tilhørende software, der anvendes i denne artikel er angivet i Tabel af materialer.
1. import af tidsskrifter
<ol><li>Åbne det tilknyttede programmel.</li>
	<li>Download journal suite angivet i Tabel af materialer.</li>
	<li>Importere journal suite til en egnet mappe ved at klikke på hovedmenuen overskrift Journal, at vælge Import Journal Suite..., og klikke på Importer.</li>
</ol>2. oprette indstillinger til forhåndsvisning Skan erhvervelse
<ol><li>I dialogboksen Plade erhvervelse Setup gå til den objektive og kamera tab. Vælg 4 X som forstørrelsen, 1 som kamera binning, og 2 som en fortjeneste.</li>
	<li>Indtaste indstillingerne i figur 1A under fanen plade-Slidescanning. Bemærk: Disse indstillinger er blevet oprettet for at tillade brugeren at se og navigere i op til 3 dias. Hvert dias er blevet opdelt i 3 tilstødende brønde for nem navigation og 'live' visualisering af væv skiver eller celler.</li>
	<li>I fanen steder at besøge fylde brøndene ensartet med websteder.</li>
	<li>Klik på Rediger plade bunden indstillinger... og Indtast de værdier, der vises i figur 1B.</li>
	<li>Angiv den ønskede bølgelængde (enhver nukleare pletten i dette eksempel) for eksempelscanning under fanen Erhvervelse Loop . For de bedste kontrast og billed-baserede fokus, brug den lyseste fluorescerende signal (f.eks., ofte en nuklear plet). Bemærk: Farvning væv med en lyse pletter såsom en nuklear pletten anbefales, da dette giver en høj kontrast i forhold til baggrunden. Ikke blot vil denne støtte i stikprøven placering, men når imaging mere end én fluorophore i følgende høj forstørrelse erhvervelse, den lyseste farve vil blive brugt til at basere den imaging opveje af andre farver på.</li>
	<li>Aktiver Skygge korrektion i plade erhvervelse mode at sammenhæfte billeder.</li>
	<li>Gemme disse indstillinger som indstilling A.</li>
</ol>3. at oprette indstillinger for dias erhvervelse ved høj forstørrelse
<ol><li>I dialogboksen Plade erhvervelse Setup gå til den objektive og kamera tab. Vælg 40 X som forstørrelsen, 1 som kamera binning (for den højeste digital opløsning), og 2 som gevinst (at øge signal og lysstyrken på billeder). Bemærk: En lavere objektive forstørrelse indstilling kan bruges, men forfatterne fandt 40 X skal være den optimale indstilling til analyse af menneskelige mikroglia og makrofager i hjernen tumor væv ved hjælp af modulet Multi bølgelængde celle Scoring .</li>
	<li>Sikre alle indstillinger for fanerne plade – Slidescanning og Redigere plade bunden indstillinger... er den samme som for indstilling A (Se trin 2).</li>
	<li>Hvis billeder fås ikke sprød, ændre godt dybde, plade højdeog Plade bunden indstillinger for at justere fokus. Hvis der er stadig et problem med fokus, skal du vælge Laser med Image Recovery under afsnittet autofokus .</li>
	<li>Angiv antallet af bølgelængder til stede i prøven under fanen Erhvervelse Loop . Kontroller indstillingerne for aktiverer laser-baseret med fokus og aktiverer image-baseret med fokus (for erhvervelse eller laser recovery) .</li>
	<li>Vælg fokus på pladen og godt nederstunder fanen autofokus .</li>
	<li>Vælg indstillinger i fanen kladder som angivet i figur 2, at sikre forebyggelse asynkron hardware flytter vælges også.</li>
	<li>Gemme disse indstillinger som indstilling B.</li>
</ol>4. indlagringen diaset Widefield High-indhold analysesystem
<ol><li>Tryk på F4 for at få Hovedmenuen. Vælg dias Scanning. Klik på åben dør – skub Slide og indsætte dias og slide-adapteren (der kan rumme op til tre dias) i WHCAS (figur 3A og 3B). Orientere diaset med coverslip nedad og label på siden af kærven i dias adapter (figur 3A). Bemærk: De dias, som bruges i dette eksperiment var standard 25 x 75 x 1 mm dias.</li>
	<li>Klik på Luk døren – belastning dias.</li>
</ol>5. erhverve en eksempelscanning
<ol><li>Under overskriften Screening Vælg plade erhvervelse og kontrol... og Plade erhvervelse opsætning... og indlæse indstilling A.</li>
	<li>Under fanen brønde til besøg flytte til de godt indeholdende prøve, ved hjælp af knappen Højreklik på musen. Under fanen steder at besøge Flyt til forskellige steder med Live billedoptagelse indtil cellerne er placeret. Manuelt fokus på prøve eller bruge autofokus. Bruge Snap til at indfange billedet. Bemærk: Eksemplet er nemmere at finde med flere steder, og ved at montere websteder til brønden (Se trin 2.3).</li>
	<li>I hovedmenuen skal du vælge Preview dias.</li>
	<li>I den viste dialogboks automatisk popper op, skal du vælge indstillingen afspejler hvor mange dias vil blive scannet. Skan ét dias ad gangen. Tryk på OK. Vælg 4 X forstørrelse. Tryk på OK. Vælg Coverslip ned (0,17 mm) som diasformat (brug en korrektion krave anvendes forskellige coverslip tykkelse). Tryk på OK. Klik på Fortsæt. Bemærk: Hvis brugeren ønsker at erhverve preview scanninger for 2 eller flere dias, hver eksempelscanning har åbnes individuelt forud for erhvervelsen af tilsvarende høj forstørrelse billedet.</li>
	<li>Under Belastning scanne dias indstilling, sikre boksene erhvervelse indstillinger og kalibreringer er kontrolleret. Tryk på Annuller. Når boksen Scanningsindstillinger skub igen, skal du vælge Fortsæt.</li>
	<li>Når dialogboksen Scanne dias vises, skal du justere indstillingerne som foreslået i figur 4A-4 C. Vælg tæt når du er færdig. Bemærk: Øge kameraet binning og faldende kamera eksponeringstid vil resultere i hurtigere scanning, omend på en lavere digital opløsning og dynamikområde, henholdsvis, dermed reducere billedkvaliteten. Skygge korrektion vil sikre en ensartet intensitet på tværs af en enkelt synsfelt. Tænde Hardware og billede autofokus sikrer scanningen er i fokus, men vil bremse den scanning. I sparer tid, anbefales det, at have skygge korrektion og Hardware og billede autofokus off mens erhverve lav forstørrelse scanningen, men at have disse indstillinger slået til trin 6 under høj forstørrelse imaging. Opløsning af lav forstørrelse scanning vil ikke påvirke løsningen af høj forstørrelse scanningen.</li>
	<li>Vælg en mappe til diasscanning data. Klik på OK. Angiv et navn til filen. Klik på OK.</li>
	<li>Tegne Region dialogboksen vises automatisk. Brug værktøjet Rektangulært Region (figur 5A) til at vælge hele preview scan region som vist i figur 5B. Klik på Fortsæt.</li>
	<li>Setup komplet dialogboksen vises. Vælg Fortsæt. Bemærk: Slide eksempelscanning påbegyndes nu.</li>
	<li>Når preview er fuldført, vises dialogboksen til Scanning komplet . Vælg Fortsæt. Luk ikke vinduet Vis scanning (i dette eksempel vinduet DAPI Skan ; Se figur 6). Bemærk: Opsætning og lav forstørrelse scan erhvervelse processen vil tage ca 20 min. Efterfølgende høj forstørrelse billede erhvervelse tid vil afhænge af antallet af websteder valgt samt eksponering gange for hver kanal.</li>
</ol>6. høj forstørrelse Scanning
<ol><li>Indlæse indstilling B.</li>
	<li>Bestemme hvilken brønde skal være afbildet. Under fanen brønde til besøg flytte til de godt indeholdende prøve, ved hjælp af knappen Højreklik på musen. Bemærk: Teknikken er vist her, af imaging godt 1.</li>
	<li>Under fanen steder at besøge Flyt til forskellige steder med funktionen Live indtil celler eller væv er placeret. Manuelt fokus på prøve eller bruge autofokus. Bruge Snap til at indfange billedet. Bemærk: For at støtte i at lokalisere prøven på en høj forstørrelse, bruge dialogboksen plade erhvervelse og kontrol til at justere størrelsen skridt hvor som helst fra 5 til 100 µm at finde prøven hvis autofokus ikke.</li>
	<li>Klik på Auto afsløreunder fanen W1 DAPI . Sikre Plade erhvervelse Snap - DAPI billedet er knivskarp.</li>
	<li>Under hovedmenuen, skal du klikke på Journal til at afsløre pull-down. Vælg Kør Journal....</li>
	<li>Dobbeltklik på kladden Skub Region erhvervelse Setup hen til indlede sig. Når Installationsprogrammet skub Region erhvervelse dialogboks vises, skal du vælge Fortsæt.</li>
	<li>Når du får besked, korrekt skal du vælge den DAPI Skan at vælge lav forstørrelse diasbilledet. Tryk på OK. Ligeledes fremhæve plade erhvervelse Snap - DAPI når bad om pladen erhvervelse snap. Klik på OK.</li>
	<li>Når boksen Opret eller belastning regioner vises, skal du bruge værktøjet Rektangulært Region for at vælge (en) region(er) af interesse på DAPI Scan (figur 6). Tryk på Fortsæt. Bemærk: Det maksimale areal, der kan vælges på 40 X er 45 kolonner af 35 rækker. Hvis flere regioner af interesse er valgt, skaleres regionerne til boksen med den største område. Boksene kan flyttes efter den resizing.</li>
	<li>Vælg Nej under dialogboksen Belastning regioner . Bemærk: Hvis du vælger Ja gemte masser tidligere regioner for partier af dias med samme region af interesse steder.</li>
	<li>Du bruger værktøjet Locator , fremhæve den største område af interesse og trykke på Fortsæt i dialogboksen Vælg Region . Når boksen Bekræft regioner vises, skal du vælge Fortsæt. Beslutte, om regionen skal gemmes, når dialogboksen Gem regioner vises.</li>
	<li>Den næste dialogboks, Websted afstand, tillader brugeren at vælge flise, hvilket resulterer i et billede med ingen overlapning, eller 10% overlap. Vælg en indstilling og klikke på OK. Forfatterne valgte flise.</li>
	<li>Tre dialogbokse vises nu. Komplet opsætning boksen kan afskediges ved at trykke på Fortsæt. Holde Erhvervelse Site Setup for 40 X box (figur 7A) åben for nu da det gør klart, hvor mange kolonner og rækker skal indtastes i boksen Plade erhvervelse Setup (figur 7B). Hold feltet WellPositions (figur 7C) der vises i nederste venstre hjørne åben for varigheden af imaging.</li>
	<li>I boksen Plade erhvervelse Setup under brønde til besøg, det samme antal brønde som regioner af interesse tidligere valgte skal være fremhævet (figur 7 d). Bemærk: Forfatterne udviklet denne protokol for maksimalt ni regioner af interesse pr. slide. Hvis der er flere, skal i blot forøge antallet af kolonner eller rækker under fanen plade - SlideScanning at afspejle antallet af regioner af interesse. Disse brønde rumligt repræsenterer ikke placeringen af regioner af interesse på nogen måde, men det relevante nummer skal være fremhævet (Venstreklik).</li>
	<li>Gå til fanen steder at besøge Angiv i boksen Plade erhvervelse Setup foreslåede kolonner og rækker (figur 7B). Husk at klikke på flise websteder.</li>
	<li>For at eliminere gætterier om at finde de steder, der indeholder eksemplet, skal du trykke på Erhverve plade under fanen Oversigt til at placere scenen på det forud valgte område af interesse. Når kameraet pander over et websted, der indeholder celler, skal du trykke på Annuller på det nederste højre hjørne til at stoppe billede erhvervelse. Sikre, at scenen er nu placeret over prøven.</li>
	<li>Optimere indstillingerne bølgelængde for at sikre, at en fokuseret og en høj dynamisk rækkevidde billede opnås. Når tilfreds, klik på Oversigt tab og Erhverve plade.</li>
</ol>7. billedanalyse
<ol><li>Vælg den ønskede brugerdefinerede modul. Bemærk: Forfatterne valgte modulet Multi bølgelængde celle Scoring til at demonstrere en automatiseret segmentering af hjernen tumor dias.</li>
	<li>Køre analysen på alle websteder. Hvis analyseparametrene er den samme for mange dias, kan analysen medtages i Plade erhvervelse opsætning boksen under fanen Post erhvervelse .</li>
	<li>Når analysen er færdig, udelukke nogen steder af dårlig billedkvalitet for ikke at bias resultaterne. Da målet med denne analyse er at kvantificere mikroglia og makrofager i tumor parenkym, Vælg region af interesse inden for eksemplet tumor kanter. Endvidere udelukke de websteder, der er ude af fokus og/eller indeholde væv folder eller bobler og tårer i vævet. For en demonstration, se Repræsentant resultater. Alternativt kan du bruge Laser fokus score genereret for hvert websted, afhængigt af amplituden af laser refleksion som en tærskel nedenfor hvilke websteder er udelukket (tærsklen er tilpasselig og afhænger af parametre som eksponeringstiden og den type af medier bruges). Bemærk: Høj forstørrelse billeder gør det muligt at specifikt udelukke strukturer, såsom store blodkar og områder af nekrose, hvis nødvendigt. Det er også muligt at medtage kun områder af interesse, såsom dem, der er hypercellular. Denne måde, kan specificitet og nøjagtighed af analyserne øges.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hua, Y., Shun, T. Y., Strock, C. J., Johnston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+positional+biosensor+screening+assay+for+compounds+to+prevent+or+disrupt+androgen+receptor+and+transcriptional+intermediary+factor+2+protein-protein+interactions.">High-content positional biosensor screening assay for compounds to prevent or disrupt androgen receptor and transcriptional intermediary factor 2 protein-protein interactions.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (7), 395-418 (2014).</li><li>Rishal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WIS-NeuroMath+enables+versatile+high+throughput+analyses+of+neuronal+processes.">WIS-NeuroMath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes.</a> Developmental Neurobiology. 73 (3), 247-256 (2013).</li><li>Kanungo, J., Lantz, S., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+changes+in+axon+length+using+transgenic+zebrafish+embryos.">In vivo imaging and quantitative analysis of changes in axon length using transgenic zebrafish embryos.</a> Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 618-623 (2011).</li><li>Schurmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+illumina+gene+expression+microarray+data+from+different+tissues:+methodological+aspects+of+data+analysis+in+the+MetaXpress+Consortium.">Analyzing illumina gene expression microarray data from different tissues: methodological aspects of data analysis in the MetaXpress Consortium.</a> PLoS ONE. 7 (12), e50938 (2012).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e1900 (2010).</li><li>Bravo-San Pedro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantification+of+GFP-LC3++dots+by+automated+fluorescence+microscopy.">High-throughput quantification of GFP-LC3+ dots by automated fluorescence microscopy.</a> Methods in Enzymology. , 71-86 (2017).</li><li>Varga, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multichannel+fluorescent+whole+slide+imaging+and+its+application+for+cytometry.">Automated multichannel fluorescent whole slide imaging and its application for cytometry.</a> Cytometry Part A. 75 (12), 1020-1030 (2009).</li><li>Narayan, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+fibrinogen+extravasation+into+Alzheimer's+disease+brain+using+high-content+screening+of+brain+tissue+microarrays.">Assessing fibrinogen extravasation into Alzheimer's disease brain using high-content screening of brain tissue microarrays.</a> Journal of Neuroscience Methods. 247, 41-49 (2015).</li><li>Du, Y., Budman, H. M., Duever, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation+and+quantitative+analysis+of+apoptosis+of+Chinese+hamster+ovary+cells+from+fluorescence+microscopy+images.">Segmentation and quantitative analysis of apoptosis of Chinese hamster ovary cells from fluorescence microscopy images.</a> Microscopy and Microanalysis. 23 (3), 569-583 (2017).</li><li>Mueller, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+segmentation+of+fluorescence+microscopy+images+of+heterogeneous+tissue:+application+to+the+detection+of+residual+disease+in+tumor+margins.">Quantitative segmentation of fluorescence microscopy images of heterogeneous tissue: application to the detection of residual disease in tumor margins.</a> PLoS One. 8 (6), e66198 (2013).</li><li>Donnelly, D. J., Gensel, J. C., Ankeny, D. P., van Rooijen, N., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+reproducible+method+for+quantifying+macrophages+in+different+experimental+models+of+central+nervous+system+pathology.">An efficient and reproducible method for quantifying macrophages in different experimental models of central nervous system pathology.</a> Journal of Neuroscience Methods. 181 (1), 36-44 (2009).</li><li>Kozlowski, C., Weimer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+method+to+quantify+microglia+morphology+and+application+to+monitor+activation+state+longitudinally+in+vivo.">An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo.</a> PLoS One. 7 (2), e31814 (2012).</li><li>Fish, K. N., Sweet, R. A., Deo, A. J., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+segmentation+methodology+for+quantifying+immunoreactive+puncta+number+and+fluorescence+intensity+in+tissue+sections.">An automated segmentation methodology for quantifying immunoreactive puncta number and fluorescence intensity in tissue sections.</a> Brain Research. 1240, 62-72 (2008).</li><li>Zock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+high+content+screening+in+life+science+research.">Applications of high content screening in life science research.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 12 (9), 870-876 (2009).</li></ol>

Forfatterne har ingen økonomiske interesser i de produkter, der er beskrevet i dette håndskrift og har ikke andet at videregive.

En fælles problem stadig hæmme effektiviteten af biologisk videnskabsforskning er udviklingen af protokoller for saglig, nøjagtig og præcis kvantificering af fluorescently mærket væv og deres strukturer inden for. Betydelige mængder af tid og indsats er rettet mod at finde måder at analysere væv dias, når de har blevet afbildet. Mange eksisterende metoder giver algoritmer nemlig brugernes hen til genskabe inden for programmer12,13,14. Disse metoder er acceptabel, men betydningen af denne betænkning er, at det gør det muligt for brugeren at hurtigt og nemt oprette et holistisk billede erhvervelse og analyse protokol hvis brugeren har adgang til en WHCAS. Assays, at differentiere celletyper og kvantificering flere strukturer og processer, celle cyklus analyse og nukleare translokation, for eksempel, er allerede til rådighed i det tilknyttede programmel.
Opsætningen omfatter et par kritiske trin. For det første, de rumlige parametre af diaset er defineret som om det var en plade. For det andet oprettes en lav forstørrelse oversigt scanning, hvorfra regioner af interesse er valgt for høj forstørrelse billeddannelse. Endelig, websteder, der påvirker nøjagtighed og præcision af efterfølgende analyser er udelukket. Den største begrænsning af denne teknik er, at dens anvendelighed afhænger af hvis brugeren har adgang til en WHCAS. Dog med det stigende behov for høj-indholdsanalyse systemer, der mange institutioner leverer disse til deres forskere at forblive konkurrencedygtige15. Fejlfinding er nødvendig oftest når væv sektioner ikke har samme tykkelse. Hvis flere regioner af interesse er markeret, vil nogle være i fokus, mens andre ikke vil. Ideelt set ved skæring, ville brugeren tage sig for at skabe homogene prøver. Men hvis prøverne er inkonsekvent, fokus på den nukleare pletten bølgelængde (eller brugerens lyseste fluorophore), som bruges til at fokusere, kan justeres for hver out-of-fokus område af interesse og selv for hver synsfelt. Som de andre bølgelængder er simpelthen forskudt fra den nukleare pletten bølgelængde, brug kun denne bølgelængde omstilling.
I denne betænkning detaljer vi hvordan man kan scanne og analysere dias ved hjælp af en WHCAS og tilhørende software. Modulet flere bølgelængde celle Scoring tillader bruger hen til automatisk tælle alle nukleare eller cytoplasmatisk markører, der betegnes fluorescently. Efter justering af fokus indstillingerne og cellulære kendetegn, såsom bredde og område til at tilpasse modulet til væv afbildet, er der ikke længere behov for indgriben fra brugeren at skaffe de afbildede dias og kvantitative data. Op til tre dias kan være afbildet på et tidspunkt og flere regioner af interesse kan defineres. Denne protokol giver mulighed for WHCAS brugere, som skal analysere dias drage fordel af tilpasselig, MP, automatiserede arbejdsprocesser, der kræver lidt eller ingen optimering og kan anvendes i alle projekter i fremtiden, der involverer den histologiske analyse af væv.

Den nøjagtige og præcise kvantitering af fluorescently mærket væv på dias er et yderst eftertragtede teknik inden for mange forskningsområder. Men forskere ofte manuelt tælle prøver eller bruge betydelige mængder af tid på at udvikle esoteriske automatiseret teknikker for at opnå dette. Heri, giver vi en protokol for automatiseret diasscanning og kvantitering af celler ved hjælp af en WHCAS og dens tilhørende software, med medfødte immun celler i frosne menneskelige hjerne tumor sektioner som eksempel. Den tilhørende software tilbyder en bred vifte af indbyggede tilpasselig moduler fra neurite udvækst tælle til differentiering af celle typer1,2,3,4,5, 6. Målet med denne metode er at give forskere med en start-til-finish, let at reproducere protokol at erhverve billeder af og kvantificere fluorescently mærket enheder i enhver slide-monteret væv.
I denne protokol bruges WHCAS primært til imaging plader til efterfølgende analyse på det tilknyttede programmel, selvom et dias adapter og grundlæggende til dias scanning7 var til rådighed. Det var uoverkommelige til billede dias fordi forsigtig rumlige kalibrering af området erhvervelse, udvælgelse af relevante kladder, oprettelse af skræddersyede loadouts og en forbindelsesofficer med produkt repræsentanter var påkrævet. I den bredere krop af litteratur, i stedet for at købe en dedikeret slide-billedbehandling og analyse apparater8, omgås en teknologisk betænkning med adgang til denne software image erhvervelse af dias på WHCAS helt9. Udføre image erhvervelse eller billede analyse på forskellige platforme kræver ekstra arbejde for at sikre hver er kompatibel med den anden.
Evnen til at bruge WHCAS og dets software til billedoptagelse ville undgå de unødvendige komplikationer af søger eller udvikle en arbejdsproces fremmede til disse værktøjer. I denne artikel, foranstaltninger krævede hen til oprette en lav forstørrelse oversigt scanning og de tilsvarende høj forstørrelse billeder ved at behandle diasset som en plade og de efterfølgende analyser ved hjælp af modulet multi bølgelængde celle Scoring segmentering giver mulighed for at nyorientering af WHCAS. Denne let anvendelige protokol giver en fordel frem for alternative teknikker, fordi der er ingen grund til at udvikle algoritmer eller Multi-trins tælle protokoller10,11 , når billederne er erhvervet på WHCAS. Denne protokol afbøder tidsforbruget til at optimere en kvantitering teknik, er mere præcis12 og effektiv end manuel optælling og maksimerer anvendelsen af WHCAS. Denne protokol kan anvendes bredt og nemt da det muliggør billedbehandling og analyse af enhver fluorescently mærket væv på dias.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1640">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">ImageXpress MicroXLS</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td style="width:1087px;">Apparatus for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">MetaXpress 5.1</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td>Associated software for ImageXpress MicroXL (runs on a PC with the Windows operating system).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Slide adapter</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td>Metal slide holder that fits into ImageXpress MicroXL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide_Region_Acquisition_revA.jzp</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td>The journal can be obtained from metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&#38;highlight=slide or from contacting a Molecular Devices representative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Slide_Region_Acquisition_Setup.JNL</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td>Select this journal in Step 6.6.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated slide scanning and segmentation in fluorescently-labeled tissues using a widefield high-content analysis system

Automatiseret diasscanning og segmentering af fluorescently mærket væv er den mest effektive måde at analysere hele dias eller store væv sektioner. Desværre, mange forskere bruger store mængder af tid og ressourcer at udvikle og optimere arbejdsgange, der er kun relevante for deres egne eksperimenter. I denne artikel vil beskrive vi en protokol, der kan bruges af personer med adgang til en widefield høj-indhold analysesystem (WHCAS) til billede slide-monteret væv, med muligheder for tilpasning inden for præfabrikerede moduler findes i den tilhørende software. Ikke oprindeligt beregnet til dias scanning, gør trinene i denne artikel i det muligt at erhverve diasscanning billeder i den WHCAS, som kan importeres til det tilknyttede programmel. Automatiseret segmenteringen af hjernen tumor dias er vist i dette eksempel, men den automatiserede segmentering af enhver fluorescently mærket nukleare eller cytoplasmatisk markør er muligt. Derudover er der en række andre kvantitative softwaremoduler herunder assays til protein lokalisering/translokation, cellulære spredning/levedygtighed/apoptose og angiogenese, der kan køres. Denne teknik vil spare forskere tid og kræfter og skabe en automatiseret protokol for dias analyse.

Billederne kan ses inden for WHCAS software. Figur 8 viser høj forstørrelse miniaturer af alle steder inden for det definerede område af interesse. Gennemgå hvert websted for at identificere dem, der bør udelukkes fra analysen (eksempler vises ved lav og høj forstørrelse i figur 8 og figur 9, henholdsvis). For eksempel, Site 149 er ude af fokus (figur 9A), Site 219 har bobler (figur 9B), og Site 54 indeholder en fold (figur 9 c) og bør udelukkes. Det er typisk at udelukke 10-15% af alle websteder afbildet. I eksemplet forudsat, 15,3% af websteder blev udelukket (25/300 havde bobler, 17/300 var ude af fokus, 3/300 blev foldet og 1/300 var på kanten). Figur 10A er et repræsentativt billede udvalgt til analyse (miniaturen tilsvarende lav forstørrelse er vist i figur 8). Her, de tilsvarende overlays genereret af modulet multi bølgelængde celle Scoring vise resultaterne af automatiseret segmenteringen udføres på webstedet 59, tilpasset til forfatternes specifikationer (kerner minimum bredde = 2,5 µm, maksimal bredde = 7,5 µm, og intensitet over lokale baggrund = 35 graylevels; CD11b-positive celler minimum bredde = 4 µm, maksimal bredde = 18 µm, minimum farves område = 15 µm2og intensitet over lokale baggrund = 310 graylevels; og CD45-positive celler minimum bredde = 4 µm, maksimal bredde = 18 µm, minimum farves område = 15 µm2og intensitet over lokale baggrund = 50 graylevels). Efter opdeling, de kvantitative data for andelen af celler farvning positive for hver markør (6,2 ± 5,1% og 3,8 ± 2,1% af CD11b+ og CD45+ celler, henholdsvis), begge markører (3,5 ± 2,1% CD11b+CD45+ celler), ingen markører (86.6 ± 9,0% CD11b-CD45- celler; Figur 10B), betyder farvet område (40.0 ± 9.2 µm og 36.7 ± 7,6 µm af CD11b+ og CD45+ celler, henholdsvis; Figur 10C), og betyde fluorescens intensitet (408.9 ± 40.3 relative fluorescens enheder og 373.9 ± 38.1 relative fluorescens enheder af CD11b+ og CD45+ celler, henholdsvis; Figur 10D) kan opnås.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig1.jpg"> Figur 1: indstillinger for dias erhvervelse ved lav forstørrelse. A. dette billede viser indstillingerne for plade. B. her, plade bunden indstillinger vises. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig2.jpg"> Figur 2: indstillinger for dias erhvervelse ved høj forstørrelse. Denne figur viser udvælgelse af de relevante tidsskrifter. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig3.jpg"> Figur 3: Demonstration af, hvordan man indlæse dias ved hjælp af slide adapter. A. diaset er placeret coverslip ned med etiket på siden af dias adapter notch. B. Skub adapteren er indlæst i widefield high-indhold analysesystem. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig4.jpg"> Figur 4: eksempel slide indstillinger. A. denne figur viser parametre for erhvervelsen. B. her, at værdierne for Hoescht/DAPI bølgelængde indstillinger vises. C. dette billede viser indstillingerne for kladde. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig5.jpg"> Figur 5: tegne en slide region. A. værktøjet Rektangulært region (andre tegneværktøjer kan ikke bruges) bruges til at vælge scan eksempelområdet og oprette regioner af interesse på DAPI scanningen. B. krikand dispositionen i denne figur viser, hvordan hele området af diaset (herunder etiketten) skal være markeret. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig6.jpg"> Figur 6: oprettelse af regioner af interesse på en eksempelscanning. Preview eller DAPI scan repræsenterer hele diasområdet. I dette eksempel er der tre serielle hjernen væv sektioner (de solide hvide rektangulære konturer). Området over disse afsnit repræsenterer de cirkulære etiketter på diaset. Forskellige afsnit ordninger vil ikke begrænse efterfølgende udvælgelse af regioner af interesse. Det pågældende område i dette eksempel er vist med en stiplet hvid rektangulær kontur. Scalebar = 1 mm. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig6large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig7.jpg"> Figur 7: væsentlige vinduer for høj forstørrelse billed tilegnelse. A. erhvervelse Site Setup vinduet vil vise, hvor mange kolonner og rækker er inden for det eller de områder af interesse. B. sikre det korrekte antal kolonner og rækker angivet i figur 7A er indtastet i boksen plade erhvervelse Setup og steder er flisebelagte. C. det er nødvendigt at holde vinduet WellPositions åben for varigheden af image erhvervelse, selvom det er tomt. D. det passende antal regioner af interesse skal fremhæves. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig7large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig8.jpg"> Figur 8: repræsentativt billede af det pågældende område,. Hvert websted kan vises i en sammensat miniaturebillede af det pågældende område. De repræsentative steder, der er blevet udelukket (markeret med røde bokse) og et eksempel på en medfølgende websted (markeret med en grøn boks) er vist på en højere forstørrelse. Det anbefales, at gennemgå hvert enkelt websted for at sikre det er af tilstrækkelig kvalitet for analysen. Scalebar = 1 mm. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig8large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig9.jpg"> Figur 9: eksempler på steder, der skal udelades fra analyse. A. menneskelige hjerne tumor sektioner er blevet farvet med CD11b (grøn) og CD45 (rød), markører for mikroglia og makrofager. Dette billede er ude af fokus og er blevet udelukket fra analysen. B. bobler er til stede i dette billede, som er blevet udelukket fra den endelige analyse. C. Dette websted blev udelukket fra analysen på grund af fold i vævet. Skala barer er 20 µm. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig9large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig10.jpg"> Figur 10: repræsentative billeder og analyse. A. hvert billede vises ud for de overlejringer, der repræsenterer resultaterne af den automatiserede segmentering. I overlay, kerner vises i hvidt og positivt farvede celler er vist i grøn for CD11b og rød for CD45. Efter undtagen websteder af utilstrækkelig kvalitet fra analysen og kombinere resultaterne af alle de resterende sites, B. det samlede antal celler i hvert websted, der farves positive for hver markør og co mærket for begge markører, Cgennemsnitlig proportioner. gennemsnitlige farves område, og D. den gennemsnitlige celle intensitet repræsenteres grafisk. RFU = relativ fluorescens enheder. Dataene, der er udtrykt i gennemsnit ± standardafvigelse. Skala barer er 20 µm. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig10large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System at JoVE.com

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Her beskriver vi en protokol til den automatiserede segmentering af fluorescently mærket væv på dias ved hjælp af en widefield høj-indhold analysesystem (WHCAS). Denne protokol har omfattende programmer på ethvert område, der involverer kvantitering af fluorescerende markører i biologisk væv, herunder biologiske videnskaber, medicinsk teknik og Sundhedsvidenskab.

Automatiseret dias Scanning og segmentering i Fluorescently mærket væv ved hjælp af en Widefield høj-indhold analysesystem

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Prøvepræparation, Imaging, og Analyse protokoller for knivsæg Scanning Mikroskopi

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematisk analyse af<em&gt; In Vitro</em&gt; Cell Rolling Ved hjælp af en multi-brønds plade Mikrofluid System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Bestilling enkelte celler og Single Embryoner i 3D Indespærring: En ny enhed for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generation af en tre-dimensionel fuld tykkelse Skin Equivalent og Automated Anskydning

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Store område Scanning Probe Nanolithography lettes ved automatisk justering og dens anvendelse til substrat Fabrication for celle kultur studier

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Stivhed måling af blød silikone underlag for Mechanobiology undersøgelser ved hjælp af en Widefield fluorescens mikroskop

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live celle analyse af Shear Stress på Pseudomonas aeruginosa ved hjælp af en automatiseret højere overførselshastighed mikrofluid System

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Rensning og analyse af et monoklonalt antistof fra ovarieceller fra kinesiske hamster ved hjælp af et automatiseret Mikrobioreaktor system

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Elektriske og magnetiske feltenheder til stimulering af biologisk væv

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...