Name: automated slide scanning and segmentation in fluorescently-labeled tissues using a widefield high-content analysis system
Uploaded: 2018-05-03T14:00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System at JoVE.com

Prosjektet ble finansiert av en bevilgning fra kanadiske institutter for helseforskning og Alberta fornyer - helse løsninger/Alberta Cancer Foundation. Forfatterne ønsker å erkjenne gjenfødelse enheten i nevrobiologi kjernen anlegg for bruk av utstyret sitt, et verk av Paula Gedraitis bygge grunnlaget som lysbildet skanning av WHCAS ble gjort mulig og skaperen av produkter nevnt i denne artikkelen, molekylær enheter.

Svulst eksemplarer ble innhentet etter protokollen godkjent av lokale institusjonelle gjennomgang styret og etikk og gjennomført i henhold til nasjonale forskrifter. WHCAS og tilknyttede programvaren brukes i denne artikkelen er oppført i Tabellen for materiale.
1. import journalene
<ol><li>Åpne den tilknyttede programvaren.</li>
	<li>Last ned journal suiten i Tabellen for materiale.</li>
	<li>Importere journal suiten i en egnet mappe ved å klikke på hovedmenyen vei Journal, velge Importer Journal Suite...og klikke Importer.</li>
</ol>2. opprette innstillinger for forhåndsvisning skanne oppkjøp
<ol><li>I dialogboksen Plate oppkjøpet oppsett , gå til kategorien mål og kameraet velger 4 X som forstørrelsen, 1 som kameraet binning og 2 som gevinst.</li>
	<li>Angi innstillingene i figur 1A under kategorien Plate-Slidescanning. Merk: Disse innstillingene har blitt opprettet for å tillate brukeren å se på og navigere til 3 lysbilder. Hvert lysbilde er delt i 3 tilstøtende brønner for enkel navigering og "live" visualisering av vev skiver eller celler.</li>
	<li>I kategorien steder å besøke , fylle brønnene jevnt med nettstedene.</li>
	<li>Klikk på Rediger Plate nederst innstillinger... og angi verdiene som vises i figur 1B.</li>
	<li>Angi ønsket bølgelengdeområdet (noen kjernefysisk flekken i dette eksemplet) på forhåndsvisning skanning under kategorien Oppkjøpet Loop . Det best kontrasten og bildebasert fokus, bruke lyse fluorescerende signal (f.eks, ofte en kjernefysisk flekk). Merk: Farging vev med en lyse flekker som en kjernefysisk flekk anbefales da dette gir en høy kontrast sammenlignet med bakgrunnen. Ikke bare vil dette hjelpe på eksempel sted, men når imaging flere fluorophore i følgende forstørring Kjøp lyseste fargen brukes basere tenkelig forskyvningen av andre farger på.</li>
	<li>Aktivere Skyggelegging korreksjon i Plate vinningen måte å sette bildene sammen.</li>
	<li>Lagre disse innstillingene som innstillingen A.</li>
</ol>3. opprette innstillinger for lysbilde oppkjøp på forstørring
<ol><li>I dialogboksen Plate oppkjøpet oppsett , gå til kategorien mål og kameraet velger 40 X som forstørrelsen, 1 som kameraet binning (for den høyeste digital oppløsningen), og 2 gevinst (for å øke signalet og lysstyrke bilder). Merk: En lavere objektive forstørrelse innstilling kan brukes, men forfatterne funnet 40 X være den optimale innstillingen for analyse av menneskelig microglia og makrofager i hjernen tumor vev ved hjelp av Flere bølgelengde celle Scoring modulen.</li>
	<li>Kontroller alle innstillingene for kategoriene Plate-Slidescanning og Redigere Plate bunn innstillinger... er den samme som for innstillingen A (se trinn 2).</li>
	<li>Hvis bilder innhentet ikke skarpe, endre dybde, Plate høydeog Plate bunn innstillinger for å justere avstanden. Hvis det er fortsatt et problem med fokus, velge Image Recovery med Laser under delen autofokus .</li>
	<li>Angi antall bølgelengder i eksemplet under kategorien Oppkjøpet Loop . Kontroller alternativene aktiverer laser-basert fokus og aktiverer bildebasert fokus (for oppkjøp eller laser gjenoppretting) .</li>
	<li>Velg fokus på plate og godt nederstpå kategorien autofokus .</li>
	<li>Velg alternativene i kategorien journaler som vist i figur 2, sikre forhindre asynkron maskinvare flytter velges også.</li>
	<li>Lagre disse innstillingene som innstillingen B.</li>
</ol>4. å plassere lysbildet i Widefield høyt innhold analyse systemet
<ol><li>Trykk F4 for å få Hovedmenyen. Velg Skyv skanning. Klikk åpne døren-kaste ut lysbildet og sette inn lysbildene og skyve kortet (som kan inneholde opptil tre lysbilder) i WHCAS (figur 3A og 3B). Plasser lysbildet med dekkglassvæske vendt nedover og etiketten på siden av hakket i lysbildet kortet (figur 3A). Merk: Lysbildene som brukes i dette eksperimentet var standard 25 x 75 x 1 mm lysbilder.</li>
	<li>Klikk på Lukk døren-Load lysbildet.</li>
</ol>5. å anskaffe forhåndsvise før skanning
<ol><li>Under overskriften Screening Velg Plate og kontroll... og Plate oppkjøpet oppsett... og laste innstilling A.</li>
	<li>Under kategorien brønner besøk Flytt til den også inneholder utvalget, ved hjelp av knappen Høyreklikk på musen. Under fanen steder å besøke , flytter du til forskjellige områder med Live bildet fangst til cellene er plassert. Manuelt fokus på prøven eller bruk autofokus. Bruk snapper for å ta bildet. Merk: Utvalget er enklere å finne flere nettsteder, og ved å montere webområdene til brønnen (se trinn 2.3).</li>
	<li>På hovedmenyen velger du Forhåndsvisning lysbilder.</li>
	<li>I dialogboksen som automatisk dukker opp, velger du alternativet som gjenspeiler hvor mange lysbilder skal skannes. Skanne ett lysbilde om gangen. Trykk på OK. Velg 4 X som forstørrelsen. Trykk på OK. Velg dekkglassvæske ned (0,17 mm) som lysbilderetning (bruk en korreksjon krage hvis forskjellige dekkglassvæske tykkelse). Trykk på OK. Klikk Fortsett. Merk: Hvis brukeren ønsker å erverve forhåndsvisning skanner for 2 eller flere lysbilder, har hver skanne åpnes individuelt før anskaffelsen av tilsvarende forstørring bildet.</li>
	<li>Last skanne Skyv innstillingensikre boksene oppkjøpet innstillinger og kalibreringer kontrolleres. Trykk Avbryt. Når boksen Skyv skanneinnstillinger vises, velger du Fortsett.</li>
	<li>Når dialogboksen Scan lysbildet vises, justere innstillingene som foreslått i figur 4A-4 C. Velg Lukk når du er ferdig. Merk: Øke kameraet binning og redusere inn kameraet eksponeringstid vil resultere i raskere skanning, om enn på en lavere digital oppløsning og dynamisk område, henholdsvis, derav redusere bildekvaliteten. Skyggelegging korreksjon vil sikre en jevn intensitet over en enkelt synsfelt. Slå på maskinvare og bilde autofokus sikrer skanningen er i fokus, men vil avta skanning. Av hensyn til sparer tid, anbefales det å ha skyggelegging korreksjon og maskinvare og bilde autofokus av samtidig tilegne seg lav forstørrelse skanningen, men å ha disse alternativene aktivert for trinn 6 under forstørring avbilding. Den lave forstørrelse skanneoppløsningen påvirker ikke den høyere skanneoppløsningen.</li>
	<li>Velg en mappe for lysbildet skanning data. Klikk på OK. Angi et navn for filen. Klikk på OK.</li>
	<li>Dialogboksen Trekke regionen vises automatisk. Bruk verktøyet rektangel (figur 5A) å velge regionen hele forhåndsvisning skanning som vist i figur 5B. Klikk Fortsett.</li>
	<li>I dialogboksen vises. Velg Fortsett. Merk: Forhåndsvisning lysbildet skanningen vil nå starte.</li>
	<li>Når forhåndsvisningen er fullført, vises dialogboksen Skanning fullført . Velg Fortsett. Ikke Lukk vinduet Forhåndsvisning skanning (i dette vinduet DAPI Scan ; se figur 6). Merk: Oppsett- og lavt forstørrelse skanning oppkjøpet vil ta ca 20 min. Etterfølgende forstørring bilde oppkjøpet tid avhenger av antallet områder velge eksponeringstider for hver kanal.</li>
</ol>6. forstørring skanning
<ol><li>Laste innstilling B.</li>
	<li>Bestemme hvilke brønner skal avbildes. Under kategorien brønner besøk Flytt til den også inneholder utvalget, ved hjelp av knappen Høyreklikk på musen. Merk: Teknikken er demonstrert her av imaging vel 1.</li>
	<li>Flytt til ulike steder med Live -funksjonen til cellene eller vev ligger under kategorien steder å besøke . Manuelt fokus på prøven eller bruk autofokus. Bruk snapper for å ta bildet. NOTE for å hjelpe å finne prøven på en høy forstørrelse, Bruk dialogboksen Plate oppkjøp og kontroll for å justere trinn størrelsen alt fra 5 til 100 µm å finne prøven hvis autofokus kan ikke.</li>
	<li>Klikk Auto utsetteunder kategorien W1 DAPI . Kontroller Platen oppkjøpet fest - DAPI bildet er skarp.</li>
	<li>Klikk på Journal å vise rullegardinmenyen under hovedmenyen. Velg Kjør Journal....</li>
	<li>Dobbeltklikk på journalen Skyv regionen oppkjøpet installasjonsprogrammet å starte den. Når dialogboksen Oppsett Skyv regionen oppkjøpet vises, velger du Fortsett.</li>
	<li>Når instruert, velge riktig de DAPI søke å velge lav forstørrelse lysbildet. Trykk på OK. Tilsvarende markere platen oppkjøpet fest - DAPI da bedt om plate oppkjøpet fest. Klikk på OK.</li>
	<li>Når boksen opprette eller laste områder vises, kan du bruke verktøyet rektangulære området for å velge (a) områdene rundt på DAPI Scan (figur 6). Trykk på Fortsett. NOTE Det maksimale området som kan velges på 40 X er 45 kolonner ved 35 rader. Hvis flere områder av interesse er valgt, vil områdene endres til boksen med det største området. Boksene kan plasseres etter skalering.</li>
	<li>Velg Nei under dialogboksen Last regioner . Merk: Hvis du velger Ja lagret laster tidligere områder for grupper med lysbilder med samme område av interesse steder.</li>
	<li>Bruke verktøyet Locator , Merk den største regionen rundt og trykk Fortsett under dialogboksen Velg regionen . Når boksen Bekreft områder vises, velger du Fortsett. Bestemme om området skal lagres når dialogboksen Lagre områder vises.</li>
	<li>Den neste dialogboksen, Nettstedet avstand, kan brukeren velge side ved side, som resulterer i et bilde uten overlapping eller 10% overlapper. Velg et alternativ og klikker OK. Forfatterne valgte side ved side.</li>
	<li>Tre dialogbokser vises nå. Oppsett fullført -boksen kan bli avvist ved å trykke på Fortsett. Hold boksen Oppkjøpet side oppsett for 40 X (figur 7A) åpen for nå siden det gjør klart hvor mange kolonner og rader må angis i boksen Plate oppkjøpet Setup (figur 7B). Hold WellPositions boksen (figur 7C) som vises nederst til venstre åpne for varigheten av avbilding.</li>
	<li>I boksen Plate oppkjøpet oppsett under brønner besøk, samme antall brønner som områder rundt valgte må være merket (figur 7 d). Merk: Forfatterne utviklet denne protokollen for maksimalt ni regionene i renter per lysbilde. Hvis det er flere, bare øke antallet kolonner eller rader i kategorien Plate - SlideScanning å gjenspeile antallet områder av interesse. Disse brønnene romlig representerer ikke plasseringen av områdene rundt på noen måte, men riktig må være uthevede (venstre).</li>
	<li>Gå til kategorien steder å besøke angi foreslåtte kolonnene og radene (figur 7B) i boksen Plate oppkjøpet oppsett . Husk å klikke på fliser nettsteder.</li>
	<li>For å eliminere gjetting for å finne områder som inneholder utvalget, trykker du Erverve Plate under kategorien Sammendrag å posisjonere scenen forhåndsvalgt regionen rundt. Når kameraet pans over et nettsted som inneholder celler, trykker du Avbryt nederst i høyre hjørne stoppe bilde oppkjøpet. Scenen er nå plassert over utvalget.</li>
	<li>Optimalisere bølgelengde innstillingene for å sikre at det oppnås et fokusert og et HDR-bilde. Når fornøyd, klikker du på kategorien Sammendrag og Kjøpe platen.</li>
</ol>7. bildeanalyser
<ol><li>Velg ønskede egendefinerte modulen. Merk: Forfatterne valgte modulen Multi bølgelengde celle Scoring å demonstrere en automatisert segmentering hjerne svulst lysbildene.</li>
	<li>Kjør analysen på alle områder. Hvis analyseparametrene er likt for mange lysbilder, kan analysen inkluderes i boksen Plate oppkjøpet oppsett under kategorien Innlegget oppkjøpet .</li>
	<li>Når analysen er fullført, utelukke alle områder av dårlig bildekvalitet for ikke å påvirke resultatene. Siden målet for denne analysen er å kvantifisere microglia og makrofager i svulst parenchyma, Velg område av interesse i svulst utvalgenes kanter. Videre ekskludere nettsteder som er ute av fokus og/eller inneholder vev kaster eller bobler og tårer i vevet. Hvis en demonstrasjon, kan du se Representant resultater. Alternativt bruke Laser fokus poeng generert for hvert område avhengig av amplituden til laser refleksjon som en terskel under hvilke nettsteder er skal utelates (terskelen kan tilpasses og avhenger av parametre som eksponeringstid og type media brukes). Merk: Forstørring bildene gjør det mulig å spesifikt ekskludere strukturer, for eksempel store blodkar og områder av nekrose, om nødvendig. Det er også mulig å inkludere bare områder av interesse, slik som de som er hypercellular. Slik kan spesifisitet og nøyaktigheten av analysene økes.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hua, Y., Shun, T. Y., Strock, C. J., Johnston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+positional+biosensor+screening+assay+for+compounds+to+prevent+or+disrupt+androgen+receptor+and+transcriptional+intermediary+factor+2+protein-protein+interactions.">High-content positional biosensor screening assay for compounds to prevent or disrupt androgen receptor and transcriptional intermediary factor 2 protein-protein interactions.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (7), 395-418 (2014).</li><li>Rishal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WIS-NeuroMath+enables+versatile+high+throughput+analyses+of+neuronal+processes.">WIS-NeuroMath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes.</a> Developmental Neurobiology. 73 (3), 247-256 (2013).</li><li>Kanungo, J., Lantz, S., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+changes+in+axon+length+using+transgenic+zebrafish+embryos.">In vivo imaging and quantitative analysis of changes in axon length using transgenic zebrafish embryos.</a> Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 618-623 (2011).</li><li>Schurmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+illumina+gene+expression+microarray+data+from+different+tissues:+methodological+aspects+of+data+analysis+in+the+MetaXpress+Consortium.">Analyzing illumina gene expression microarray data from different tissues: methodological aspects of data analysis in the MetaXpress Consortium.</a> PLoS ONE. 7 (12), e50938 (2012).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e1900 (2010).</li><li>Bravo-San Pedro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantification+of+GFP-LC3++dots+by+automated+fluorescence+microscopy.">High-throughput quantification of GFP-LC3+ dots by automated fluorescence microscopy.</a> Methods in Enzymology. , 71-86 (2017).</li><li>Varga, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multichannel+fluorescent+whole+slide+imaging+and+its+application+for+cytometry.">Automated multichannel fluorescent whole slide imaging and its application for cytometry.</a> Cytometry Part A. 75 (12), 1020-1030 (2009).</li><li>Narayan, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+fibrinogen+extravasation+into+Alzheimer's+disease+brain+using+high-content+screening+of+brain+tissue+microarrays.">Assessing fibrinogen extravasation into Alzheimer's disease brain using high-content screening of brain tissue microarrays.</a> Journal of Neuroscience Methods. 247, 41-49 (2015).</li><li>Du, Y., Budman, H. M., Duever, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation+and+quantitative+analysis+of+apoptosis+of+Chinese+hamster+ovary+cells+from+fluorescence+microscopy+images.">Segmentation and quantitative analysis of apoptosis of Chinese hamster ovary cells from fluorescence microscopy images.</a> Microscopy and Microanalysis. 23 (3), 569-583 (2017).</li><li>Mueller, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+segmentation+of+fluorescence+microscopy+images+of+heterogeneous+tissue:+application+to+the+detection+of+residual+disease+in+tumor+margins.">Quantitative segmentation of fluorescence microscopy images of heterogeneous tissue: application to the detection of residual disease in tumor margins.</a> PLoS One. 8 (6), e66198 (2013).</li><li>Donnelly, D. J., Gensel, J. C., Ankeny, D. P., van Rooijen, N., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+reproducible+method+for+quantifying+macrophages+in+different+experimental+models+of+central+nervous+system+pathology.">An efficient and reproducible method for quantifying macrophages in different experimental models of central nervous system pathology.</a> Journal of Neuroscience Methods. 181 (1), 36-44 (2009).</li><li>Kozlowski, C., Weimer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+method+to+quantify+microglia+morphology+and+application+to+monitor+activation+state+longitudinally+in+vivo.">An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo.</a> PLoS One. 7 (2), e31814 (2012).</li><li>Fish, K. N., Sweet, R. A., Deo, A. J., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+segmentation+methodology+for+quantifying+immunoreactive+puncta+number+and+fluorescence+intensity+in+tissue+sections.">An automated segmentation methodology for quantifying immunoreactive puncta number and fluorescence intensity in tissue sections.</a> Brain Research. 1240, 62-72 (2008).</li><li>Zock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+high+content+screening+in+life+science+research.">Applications of high content screening in life science research.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 12 (9), 870-876 (2009).</li></ol>

Forfatterne har ingen økonomiske interesser i produktene som er beskrevet i dette manuskriptet og har ikke noe annet å avsløre.

Et vanlig problem fremdeles hindrer effektiviteten av biologisk forskning er utviklingen av protokoller for objektiv, nøyaktig og presis kvantifiseringen fluorescently-merket vev og deres strukturer i. Betydelige mengder tid og krefter er rettet mot å finne måter å analysere vev lysbilder når de har blitt avbildet. Mange eksisterende metoder gir algoritmer for brukernes å gjenskape i programmer12,13,14. Disse metodene er akseptable, men betydningen av denne rapporten er at den lar brukeren raskt og enkelt opprette en helhetlig bildeopptak og analyse protokollen hvis brukeren har tilgang til en WHCAS. Analyser som skille celletyper og kvantifisere flere strukturer og prosesser, celle syklus analyse og kjernefysiske translokasjon, for eksempel, er allerede tilgjengelig i den tilknyttede programvaren.
Oppsettet innebærer noen viktige skritt. Spatial parametere av lysbildet defineres først som om det var en plate. Dernest opprettes en lav forstørrelse oversikt skanning som regioner av interesse er valgt for forstørring bildebehandling. Til slutt, nettsteder som påvirker nøyaktighet og presisjon av påfølgende analyser er utelukket. Den største begrensningen for denne teknikken er at brukbarheten avhenger av om brukeren har tilgang til en WHCAS. Men med det økende behovet for høyt innhold analyse systemer gir mange institusjoner disse forskere å være konkurransedyktig15. Feilsøking er nødvendig oftest når vev deler ikke har samme tykkelse. Hvis flere områder av interesse er valgt, vil noen være i fokus mens andre ikke vil. Ideelt sett under snitting, ville brukeren ta seg for å opprette homogene prøver. Men hvis prøvene er inkonsekvent, kan fokus på kjernefysiske flekken bølgelengde (eller brukerens smarteste fluorophore), som brukes til å fokusere, justeres for ute av fokus områder av interesse og selv for hver synsfelt. Som andre bølgelengdene er bare forskjøvet fra kjernefysiske flekken bølgelengde, trenger bare denne bølgelengde omstilling.
I denne rapporten detalj vi skanne og analysere lysbilder ved hjelp av en WHCAS og tilhørende programvare. Flere bølgelengde celle Scoring modulen lar brukeren automatisk telle alle kjernefysiske eller cytoplasmatiske markører fluorescently merket. Etter innstillingene i fokus og definere mobilnettet egenskapene for eksempel bredde og området tilpasse modulen til vev fotografert, er det ikke lenger behov for brukertilsyn fotografert lysbilder og kvantitative data. Opptil tre lysbilder kan avbildes samtidig, og flere områder av interesse kan defineres. Denne protokollen kan WHCAS brukere som trenger å analysere lysbilder dra nytte av passelig, multifunksjonelle, automatiserte arbeidsflyter som krever lite eller ingen optimalisering og kan brukes i alle prosjekter i fremtiden som involverer histologiske analyse av vev.

Nøyaktig og presis kvantifisering av fluorescently-merket vev på lysbilder er en svært ettertraktet teknikk i mange vitenskapelige felt. Men forskere ofte manuelt teller prøver eller tilbringe store mengder tid utvikle esoteriske automatisert teknikker for å oppnå dette. Her gir vi en protokoll for automatisert lysbildet skanning og kvantifisering av celler ved hjelp av en WHCAS og tilhørende programvaren, med medfødte immunceller i frosne menneskelige hjerne svulst delene som et eksempel. Den tilknyttede programvaren tilbyr en rekke innebygde passelig moduler fra neurite utvekst opptellingen å differensiering av cellen typer1,2,3,4,5, 6. målet med denne metoden er å gi forskerne en start-til-avslutning, å reprodusere protokollen hente bilder av og quantitate fluorescently-merket enheter i noen lysbilde montert vev.
I denne protokollen brukes hovedsakelig til WHCAS for imaging plater for senere analyse på den tilknyttede programvaren selv om et lysbilde-kort og grunnleggende for å skyve skanning7 var tilgjengelig. Det var uoverkommelige bilde lysbildene fordi forsiktig romlige kalibrering av oppkjøpet området, valg av riktige journalene, etableringen av skreddersydd loadouts og et samarbeid med produktet representanter var nødvendig. I selve bredere litteratur, i stedet for kjøpe en dedikert lysbilde-imaging og analyse apparat8, omgås en tidligere teknologiske rapport med tilgang til denne programvaren bilde oppkjøpet av lysbildene i WHCAS helt9. Utføre bildeanalyser anskaffelse eller bildet på forskjellige plattformer nødvendiggjør ekstra arbeid for å sikre hver er kompatibel med den andre.
Muligheten til å bruke WHCAS og programvaren for bildebehandling ville unngå unødvendige komplikasjoner av søker eller utvikle en arbeidsflyt fremmed for disse verktøyene. I denne artikkelen trinnene nødvendig for å opprette en lav forstørrelse oversikt skanning og tilsvarende høy forstørrelse bilder ved å behandle lysbildet som en plate og påfølgende analysene bruker flere bølgelengde celle Scoring segmentering modulen tillater det gjenbruk av WHCAS. Denne lett brukbare protokollen gir en fordel over alternative teknikker fordi det er ikke nødvendig å utvikle algoritmer eller flere trinn telling protokoller10,11 når bildene er ervervet på WHCAS. Denne protokollen reduserer tiden det tar å optimalisere en kvantifisering teknikk, er mer presis12 og effektiv enn manuelt teller og maksimerer bruk av WHCAS. Denne protokollen kan mye og enkelt brukes siden det gjør den bildebehandling og analyse av alle fluorescently-merket vev på lysbilder.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1640">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">ImageXpress MicroXLS</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td style="width:1087px;">Apparatus for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">MetaXpress 5.1</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td>Associated software for ImageXpress MicroXL (runs on a PC with the Windows operating system).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Slide adapter</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td>Metal slide holder that fits into ImageXpress MicroXL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide_Region_Acquisition_revA.jzp</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td>The journal can be obtained from metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&#38;highlight=slide or from contacting a Molecular Devices representative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Slide_Region_Acquisition_Setup.JNL</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td>Select this journal in Step 6.6.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated slide scanning and segmentation in fluorescently-labeled tissues using a widefield high-content analysis system

Automatisert lysbildet skanning og segmentering av fluorescently-merket vev er den mest effektive måten å analysere hele lysbilder eller store vev deler. Dessverre, mange forskere tilbringe store mengder tid og ressurser utvikle og optimalisere arbeidsflyter som er bare relevant for egne eksperimenter. I denne artikkelen beskriver vi en protokoll som kan brukes av dem med adgang å en widefield høyt innhold analysesystem (WHCAS) til bilde noen lysbilde montert vev, med alternativer for tilpasning i pre-bygget moduler finnes i den tilknyttede programvaren. Ikke opprinnelig ment for lysbildet skanning, gjør trinnene i denne artikkelen det mulig å kjøpe lysbildet skanne bilder i WHCAS som kan importeres til den tilknyttede programvaren. Automatisert oppdeling av hjerne svulst lysbilder er demonstrert i dette eksemplet, men automatisert oppdeling av noen fluorescently-merket kjernefysiske eller cytoplasmatiske markør er mulig. Videre finnes det en rekke andre kvantitative programvaremoduler inkludert analyser for protein lokalisering/translokasjon og mobilnettet spredning/levedyktighet/apoptose angiogenese som kan kjøres. Denne teknikken vil spare forskere tid og opprette en automatisert protokoll for lysbildet analyse.

Bildene kan vises i WHCAS programvaren. Figur 8 viser forstørring miniatyrbildene for alle områdene i det definerte området av interesse. Gå gjennom hvert område for å identifisere de som skal ekskluderes fra analyse (eksempler er vist ved lav og høy forstørrelse i Figur 8 og figur 9, henholdsvis). For eksempel nettstedet 149 er ute av fokus (figur 9A) nettstedet 219 har bobler (figur 9B) og området 54 inneholder en fold (figur 9C) og bør utelukkes. Det er vanlig å ekskludere 10-15% av alle steder fotografert. I eksemplet gitt 15.3% av nettstedene ble utelatt (25/300 hadde bobler, 17/300 var ute av fokus, 3/300 ble kastet og 1/300 var på kanten). Figur 10A er et representativt bilde valgt for analyse (miniatyrbildet for tilsvarende lav forstørrelse er vist i Figur 8). Her, de tilsvarende overleggene generert av modulen multi bølgelengde celle Scoring viser resultatene av automatiserte segmenteringen utført på nettstedet 59, tilpasset forfatternes spesifikasjoner (kjerner minimumsbredden = 2,5 µm, maksimal bredde = 7,5 µm, og intensitet over lokale bakgrunn = 35 graylevels; CD11b-positive cellenes minimumsbredden = 4 µm, maksimal bredde = 18 µm, minimum farget området = 15 µm2og intensitet over lokale bakgrunn = 310 graylevels; og CD45-positive cellenes minimumsbredden = 4 µm, maksimal bredde = 18 µm, minimum farget området = 15 µm2og intensitet over lokale bakgrunn = 50 graylevels). Etter segmentering, kvantitative data på andelen av celler flekker positivt for hver merketråd (6.2 ± 5.1% og 3,8 ± 2,1% av CD11b+ og CD45+ celler, henholdsvis), begge merkene (3,5 ± 2,1% CD11b+CD45+ celler), uten dataindikatorer (86.6 ± 9.0% CD11b-CD45- celler. Figur 10B), mener farget område (40,0 ± 9.2 µm og 36.7 ± 7.6 µm av CD11b+ og CD45+ celler, henholdsvis; Figur 10C), og mener fluorescens intensitet (408.9 ± 40.3 relative fluorescens enheter og 373.9 ± oppe i 38,1 relative fluorescens enheter av CD11b+ og CD45+ celler, henholdsvis; Figur 10D) kan skaffes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig1.jpg"> Figur 1: innstillinger for lysbilde kjøp på lav forstørrelse. A. dette bildet viser plate innstillinger. B. her plate nederst innstillingene vises. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig2.jpg"> Figur 2: innstillinger for lysbilde kjøp på forstørring. Denne figuren viser utvalget av de aktuelle journalene. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig3.jpg"> Figur 3: demonstrasjon av hvordan laste lysbilder lysbildet adapteren. A. lysbildet plasseres dekkglassvæske ned med etiketten på siden av lysbildet kortet hakket. B. lysbilde kortet er lastet inn i widefield høyt innhold analysesystem. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig4.jpg"> Figur 4: lysbildet forhåndsvisningsinnstillingene. A. dette tallet viser parametere for oppkjøpet. B. her verdiene for Hoescht/DAPI bølgelengde innstillinger vises. C. dette bildet viser journal-innstillinger. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig5.jpg"> Figur 5: tegning et lysbilde område. A. rektangel verktøyet (andre tegneverktøy kan ikke brukes) brukes til å velge Forhåndsvisning skanneområdet og opprette områder av interesse på DAPI skanningen. B. teal disposisjonen i denne illustrasjonen viser hvordan hele området av lysbildet (inkludert etiketten) skal velges. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig6.jpg"> Figur 6: opprette områder av interesse på forhåndsvisning skanningen. Forhåndsvisning eller DAPI søk representerer hele lysbildeområdet. I dette eksemplet finnes det tre serielle hjernen vev deler (solid hvite rektangulære konturene). Området over disse delene representerer de sirkulære etikettene på lysbildet. Annen del ordninger vil ikke begrense etterfølgende utvalget områder av interesse. Regionen rundt i dette eksempelet vises med en stiplet hvite rektangulære konturen. Scalebar = 1 mm. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig7.jpg"> Figur 7: nødvendige windows for forstørring image vinningen. A. The oppkjøpet nettsted oppsett vil vise hvor mange kolonner og rader er innenfor områdene rundt. B. sikre riktig antall kolonner og rader som er angitt i figur 7A er angitt i boksen Plate oppkjøpet oppsett og nettsteder er flislagt. C. er det nødvendig å holde vinduet WellPositions åpen for hele bildet oppkjøpet selv om det er tomt. D. riktig antall områder av interesse må være uthevet. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig7large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig8.jpg"> Figur 8: representativt bilde av regionen rundt. Hvert område kan vises i et sammensatt miniatyrbilde i regionen rundt. Representative områdene som er utelatt (merket med røde bokser) og et eksempel på en inkludert nettsted (merket med en grønn) vises på en høyere forstørrelse. Det anbefales å vurdere hvert område slik det er av tilstrekkelig kvalitet for analyse. Scalebar = 1 mm. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig8large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig9.jpg"> Figur 9: eksempler på områder som skal ekskluderes fra analyse. A. delene menneskelige hjerne svulst har blitt farget med CD11b (grønn) og CD45 (rød), markører for microglia og makrofager. Dette bildet er uskarpt og har blitt ekskludert fra analyse. B. er bobler i dette bildet som er utelatt fra den endelige analysen. C. Dette nettstedet ble ekskludert fra analysen på grunn av fold i vevet. Skala barer er 20 µm. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig9large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig10.jpg"> Figur 10: representant bilder og analyse. A. hvert bilde vises ved siden av overlegg som representerer resultatet av automatiserte segmenteringen. I overlegg, kjerner er vises i hvitt og positivt farget celler vises i grønt for CD11b og røde for CD45. Etter eksklusive områdene med utilstrekkelig kvalitet fra analysen og kombinerer resultatene av alle gjenstående områder, B. den gjennomsnittlige andelen antall celler i hvert område som farget positivt for hver indikator og co merket for begge merkene, C. gjennomsnittlig farget området og D. gjennomsnittlig celle intensiteten representeres grafisk. RFU = relativ fluorescens enheter. Dataene uttrykkes som gjennomsnittlig ± standardavvik. Skala barer er 20 µm. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig10large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System at JoVE.com

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Her beskriver vi en protokoll for automatisk segmentering av fluorescently merket vev på lysbilder ved hjelp av en widefield høyt innhold analysesystem (WHCAS). Denne protokollen har omfattende programmer i alle felt som innebærer kvantifisering av fluorescerende markører i biologisk vev inkludert biologi, medisinsk engineering og helsefag.

Automatisert lysbildet skanning og segmentering i Fluorescently-merket vev bruker Widefield høyt innhold analysesystem

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Prøven Forberedelse, Imaging, og analyse protokoller for Knife-edge Scanning Mikroskopi

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematisk analyse av<em&gt; In Vitro</em&gt; Cell Rolling Ved hjelp av en multi-brønn Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Bestilling av enkeltceller og enkelt Embryoet i 3D Confinement: En ny enhet for høyt innhold Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generering av en Tredimensjonal Full Tykkelse hudekvivalent og Automated såret

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Stor-området skanning sonde Nanolithography tilrettelagt av automatiserte justering og dens anvendelse til underlaget fabrikasjon for cellen kulturstudier

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Stivhet måling av myk silikon underlag for Mechanobiology studier med Widefield fluorescens mikroskop

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live celle analyse av skjæring Stress på Pseudomonas aeruginosa bruker en automatisert høyere gjennomstrømming Microfluidic System

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Rensing og analyse av en monoklonale antistoff fra kinesisk hamster eggstokk celler ved hjelp av en automatisert Microbioreactor system

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Elektriske og magnetiske feltenheter for stimulering av biologisk vev

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...