Name: automated slide scanning and segmentation in fluorescently-labeled tissues using a widefield high-content analysis system
Uploaded: 2018-05-03T14:00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System at JoVE.com

Detta projekt har finansierats av anslaget från den kanadensiska institut för hälsa forskning och Alberta utvecklar - Health Solutions/Alberta Cancer Foundation. Författarna vill uppmärksamma den regenereringsenhet i neurobiologi core facilitet för användning av sin utrustning, Paula Gedraitis arbete i byggnaden stiftelsen som diabilder på WHCAS blev möjlig och skaparen av produkterna nämns i denna artikel, molekylär enheter.

Tumör exemplar erhölls enligt protokollet lokala institutionella granskning styrelsen och etik har antagit och genomfört i enlighet med nationella bestämmelser. WHCAS och dess tillhörande programvara som används i denna artikel listas i Tabell för material.
1. Importera journalerna
<ol><li>Öppna den tillhörande programvaran.</li>
	<li>Ladda ner journalen suite anges i Tabell för material.</li>
	<li>Importera tidning sviten till en lämplig katalog genom att klicka på huvudmenyn rubrik Journal, välja Importera tidning Suite...och klicka på Importera.</li>
</ol>2. skapa inställningar för förhandsgranskning Scan förvärv
<ol><li>I plattan förvärv dialogrutan som visas, gå till fliken mål och kamera Välj 4 X som förstoringen, 1 som den kamera binning och 2 som vinst.</li>
	<li>Mata in inställningarna i figur 1A under fliken plattan – Slidescanning. Obs: Dessa inställningar har skapats för att tillåta användaren att visa och navigera upp till 3 bilder. Varje bild har delats in i 3 närliggande brunnar för lätt navigering och 'live' visualisering av vävnad skivor eller celler.</li>
	<li>Fyll brunnarna i fliken platser att besöka till jämnt med webbplatser.</li>
	<li>Klicka på Redigera platta botten inställningar... och ange värdena som visas i figur 1B.</li>
	<li>Ange önskad våglängd (någon nukleär fläcken i det här exemplet) för förhandsgranska skanningen under fliken Förvärv Loop . För bästa kontrast och bildbaserade fokusering, använda den ljusaste fluorescerande signalen (t.ex., ofta en nukleär fläck). Obs: Färgning vävnader med en ljus fläck såsom en nukleär fläck rekommenderas eftersom detta ger en hög kontrast jämfört med bakgrunden. Inte bara kommer detta stöd på prov plats, men när imaging mer än en fluorophore i följande hög förstoring förvärvet, den ljusaste färgen används för att basera imaging förskjutningen av andra färger på.</li>
	<li>Aktivera Skuggning korrigering i plattan förvärv läge att sy bilder ihop.</li>
	<li>Spara dessa inställningar som inställningen A.</li>
</ol>3. skapa inställningar för bild förvärv vid hög förstoring
<ol><li>I plattan förvärv dialogrutan som visas, gå till fliken mål och kamera Välj 40 X som förstoringen, 1 som den kamera binning (för högsta digital upplösning) och 2 som vinst (att öka signal och ljusstyrkan i bilder). Obs: En lägre objektiva förstoringen inställning kan användas, men författarna fann 40 X vara den optimala inställningen för analys av mänskliga mikroglia och makrofager i tumören hjärnvävnad med Flera våglängder Cell Scoring -modulen.</li>
	<li>Se till att alla inställningar för flikarna plattan – Slidescanning och Redigera platta botten inställningar... är densamma som för inställningen A (se steg 2).</li>
	<li>Om de bilder som erhållits inte är skarpa, ändra väl djup, höjdoch Platta botten inställningar för att justera fokus. Om det finns fortfarande ett problem med fokus, välja Laser med Image Recovery under avsnittet autofokus alternativ .</li>
	<li>Under fliken Förvärv Loop , ange antalet våglängder i provet. Kontrollera alternativen Aktivera laser-baserad fokusering och Aktivera image-baserad fokusering (för förvärv eller laser återvinning) .</li>
	<li>Välj fokus på plattan och väl bottenunder fliken autofokus .</li>
	<li>I den journaler fliken, Välj alternativ som anges i figur 2, att förhindra asynkron hårdvara flyttar också är markerat.</li>
	<li>Spara dessa inställningar som inställningen B.</li>
</ol>4. Placera bilden i systemet Widefield High-innehåll analys
<ol><li>Tryck på F4 för att komma till Huvudmenyn. Välj Skjut skanning. Klicka på öppna dörren – mata ut bild och infoga diabild(er) och bild adaptern (som rymmer upp till tre bilder) i WHCAS (figur 3A och 3B). Orientera i bilden med den täckglas nedåt och etiketten på sidan av skåran i bild adaptern (figur 3A). Obs: De bilder som används i detta experiment var standard 25 x 75 x 1 mm-diabilder.</li>
	<li>Klicka på Stäng lucka – belastning Slide.</li>
</ol>5. Skaffa en skannerbild
<ol><li>Under rubriken Screening , Välj plattan förvärv och kontroll... och Plattan förvärv inställningar... och ladda inställningen A.</li>
	<li>Flytta till den brunn innehållande provet med knappen Högerklicka på musen under fliken brunnar för ett besök . Flytta till olika platser med Live bild fånga tills cellerna finns under fliken platser att besöka . Manuellt fokus på prov eller använda autofokus. Använd Snap för att fånga bilden. Obs: Urvalet är lättare att hitta med fler platser, och genom att montera webbplatser till brunnen (se steg 2.3).</li>
	<li>På huvudmenyn väljer du Förhandsvisning bilder.</li>
	<li>I dialogrutan som automatiskt dyker upp, Välj alternativet avspeglar hur många bilder kommer att scannas. Skanna en bild i taget. Tryck på OK. Välj 4 X som förstoringen. Tryck på OK. Välj täckglas ner (0.17 mm) som bildorientering (Använd en korrigering krage om en olika täckglas tjocklek används). Tryck på OK. Klicka på Fortsätt. Obs: Om användaren önskar att förvärva förhandsgranska skanningar för 2 eller fler bilder, har varje skannerbild öppnas individuellt före förvärvet av motsvarande hög förstoring bilden.</li>
	<li>Under Belastning Skanna bild inställning, se rutorna förvärv inställningar och kalibreringar kontrolleras. Tryck på Avbryt. När rutan Skjut skanningsinställningar visas igen väljer du Fortsätt.</li>
	<li>När dialogrutan Skanna bild visas, justera inställningar som föreslås i figur 4A-4 C. Välj Stäng när du är klar. Obs: Öka kameran binning och minskar kameran exponeringstiden kommer att resultera i snabbare skanning, om än på en lägre digital upplösning och dynamiskt omfång, respektive, därmed minskar bildkvaliteten. Skuggning korrigering kommer att säkerställa en enhetlig intensitet över en enda synfält. Slå på hårdvara och bild autofokus kommer att säkerställa genomsökningen är i fokus men kommer att sakta ner skanning. Intresse sparar tid, rekommenderas det att ha skuggning korrigering och hårdvara och bild autofokus off samtidigt förvärva låg förstoring genomsökningen, men att ha dessa alternativ aktiverat för steg 6 under hög förstoring bildtagning. Upplösningen på låg förstoring skanningen kommer inte att påverka upplösningen av hög förstoring genomsökningen.</li>
	<li>Välj en katalog för bilden Skanna data. Klicka på OK. Ange ett namn för filen. Klicka på OK.</li>
	<li>Dialogrutan Rita Region visas automatiskt. Använd verktyget Rektangulärt område (figur 5A) att välja hela förhandsvisning scan regionen som visas i figur 5B. Klicka på Fortsätt.</li>
	<li>Dialogrutan Installationen slutförd visas. Välj Fortsätt. Obs: Förhandsgranska bilden skanningen påbörjas nu.</li>
	<li>När förhandsgranskningen är klar, visas dialogrutan Skanna slutförd . Välj Fortsätt. Stäng inte fönstret Förhandsgranska skanning (i detta exempel fönstret DAPI Skanna ; se figur 6). Observera: Inställning och låg förstoring scan förvärvsprocessen tar ca 20 min. Den efterföljande hög förstoring bild förvärv tid beror på antalet platser som valt samt exponeringstider för varje kanal.</li>
</ol>6. hög förstoring skanning
<ol><li>Ladda inställning B.</li>
	<li>Bestämma vilka brunnar skall avbildas. Flytta till den brunn innehållande provet med knappen Högerklicka på musen under fliken brunnar för ett besök . Obs: Tekniken demonstreras här av imaging väl 1.</li>
	<li>Flytta till olika platser med funktionen Live tills de celler eller vävnad ligger under fliken platser att besöka . Manuellt fokus på prov eller använda autofokus. Använd Snap för att fånga bilden. Obs: För att underlätta att hitta provet vid hög förstoring, använda dialogrutan plattan förvärv och kontroll steg storleken någonstans från 5 till 100 µm ta provet om autofokus inte kan justeras.</li>
	<li>Klicka på Auto exponeraunder fliken W1 DAPI . Se till att Plattan förvärv Snap - DAPI bilden är skarp.</li>
	<li>Klicka på Journal att avslöja nedrullningsbara under huvudmenyn. Välj Kör Journal....</li>
	<li>Dubbelklicka på journalen Skjut regionen förvärv installationsprogrammet att starta den. När dialogrutan Inställningar Skjut regionen förvärv visas, väljer du Fortsätt.</li>
	<li>När du får instruktionen korrekt Markera på DAPI Skanna att välja låg förstoring bild bilden. Tryck på OK. På samma sätt belysa den plattan förvärv nafsa - DAPI när bad om plattan förvärv fäst. Klicka på OK.</li>
	<li>När rutan skapa eller belastning regioner visas, Använd verktyget rektangulär Region för att välja (a) region(er) dröjsmålsränta på DAPI Scan (figur 6). Tryck på Fortsätt. Obs: Det maximala område som kan väljas på 40 X är 45 kolumner 35 rader. Om flera områden av intresse är markerade kommer regioner att ändras till rutan med det största området. Rutorna kan flyttas efter storleksändring.</li>
	<li>Välj Nej under dialogrutan Load regioner . Obs: Att välja Ja sparade massor tidigare regioner för partier av bilder med samma område i intresse platser.</li>
	<li>Med verktyget Locator , regionen största sevärdheter och trycker på Fortsätt i dialogrutan Välj Region . När rutan Bekräfta regioner visas, väljer du Fortsätt. Besluta om regionen måste sparas när dialogrutan Spara regioner visas.</li>
	<li>Nästa dialogruta, Webbplatsen radavstånd, tillåter användaren att välja sida vid sida, vilket resulterar i en bild utan överlappning, eller 10% överlappning. Välj ett alternativ och klicka på OK. Författarna valde sida vid sida.</li>
	<li>Tre dialogrutor visas nu. Rutan Installationen är slutförd kan avfärdas genom att trycka på Fortsätt. Hålla rutan Förvärv platsinställning för 40 X (figur 7A) öppna för nu på eftersom det gör klart hur många kolumner och rader måste anges i rutan Plattan förvärv Setup (figur 7B). Hålla WellPositions rutan (figur 7 c) som visas i det nedre vänstra hörnet öppen för varaktigheten av imaging.</li>
	<li>I rutan Plattan förvärv Setup enligt Wells till besök, samma antal brunnar som områden av intresse som tidigare valts måste vara markerat (figur 7 d). Obs: Författarna utvecklat detta protokoll för högst nio regioner av intresse per bild. Om det finns fler, helt enkelt öka antalet kolumner eller rader i fliken tallrik - SlideScanning motsvarar antalet regioner av intresse. Dessa brunnar rumsligt representerar inte platsen för regionerna av intresse på något sätt, men lämpligt antal måste vara markerade (vänsterklick).</li>
	<li>Gå till fliken platser att besöka ange i rutan Plattan förvärv Setup föreslagna kolumnerna och raderna (figur 7B). Kom ihåg att klicka på kakel platser.</li>
	<li>För att eliminera bort gissningsleken att hitta webbplatser som innehåller provet, tryck Förvärva plattan under fliken Sammanfattning ståndpunkten scenen på förvalda regionen av intresse. När kameran panorerar över en webbplats som innehåller celler, tryck på Avbryt längst ner i högra hörnet att stoppa bild förvärv. Se till scenen nu ligger över provet.</li>
	<li>Optimera våglängd inställningarna för att säkerställa att en fokuserad och ett stort dynamiskt omfång bild erhålls. När du är nöjd, klicka på fliken Sammanfattning och Förvärva plattan.</li>
</ol>7. bildanalys
<ol><li>Välj önskad anpassade modulen. Obs: Författarna valde Flera våglängder Cell Scoring modulen att demonstrera en automatiserad segmentering av hjärnan tumör bilder.</li>
	<li>Köra analysen på alla webbplatser. Om parametrarna analys är samma för många bilder, kan analysen inkluderas i den Plattan förvärv inställningar under fliken Post förvärv .</li>
	<li>När analysen är klar, utesluta alla webbplatser av dålig bildkvalitet så att inte bias resultaten. Eftersom målet för denna analys är att kvantifiera mikroglia och makrofager i tumör parenkymet, Välj region av intresse inom tumör provets kanter. Dessutom utesluta webbplatser som är ur fokus och/eller innehåller vävnad veck eller bubblor och tårar i vävnaden. För en demonstration, se Representativa resultat. Alternativt kan du använda Laser fokus Poäng genereras för varje plats beroende på amplituden av laser reflektion som tröskelvärde under vilka webbplatser som är att vara utesluten (tröskeln är anpassningsbara och beror på parametrar såsom exponeringstiden och typ av media som används). Obs: Hög förstoring bilder gör det möjligt att särskilt utesluta strukturer, såsom stora blodkärl och områden av nekros, om nödvändigt. Det är också möjligt att inkludera endast områden av intresse, såsom de som är hypercellular. På så sätt kan den specificitet och noggrannhet av analyserna ökas.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hua, Y., Shun, T. Y., Strock, C. J., Johnston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+positional+biosensor+screening+assay+for+compounds+to+prevent+or+disrupt+androgen+receptor+and+transcriptional+intermediary+factor+2+protein-protein+interactions.">High-content positional biosensor screening assay for compounds to prevent or disrupt androgen receptor and transcriptional intermediary factor 2 protein-protein interactions.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (7), 395-418 (2014).</li><li>Rishal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WIS-NeuroMath+enables+versatile+high+throughput+analyses+of+neuronal+processes.">WIS-NeuroMath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes.</a> Developmental Neurobiology. 73 (3), 247-256 (2013).</li><li>Kanungo, J., Lantz, S., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+changes+in+axon+length+using+transgenic+zebrafish+embryos.">In vivo imaging and quantitative analysis of changes in axon length using transgenic zebrafish embryos.</a> Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 618-623 (2011).</li><li>Schurmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+illumina+gene+expression+microarray+data+from+different+tissues:+methodological+aspects+of+data+analysis+in+the+MetaXpress+Consortium.">Analyzing illumina gene expression microarray data from different tissues: methodological aspects of data analysis in the MetaXpress Consortium.</a> PLoS ONE. 7 (12), e50938 (2012).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e1900 (2010).</li><li>Bravo-San Pedro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantification+of+GFP-LC3++dots+by+automated+fluorescence+microscopy.">High-throughput quantification of GFP-LC3+ dots by automated fluorescence microscopy.</a> Methods in Enzymology. , 71-86 (2017).</li><li>Varga, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multichannel+fluorescent+whole+slide+imaging+and+its+application+for+cytometry.">Automated multichannel fluorescent whole slide imaging and its application for cytometry.</a> Cytometry Part A. 75 (12), 1020-1030 (2009).</li><li>Narayan, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+fibrinogen+extravasation+into+Alzheimer's+disease+brain+using+high-content+screening+of+brain+tissue+microarrays.">Assessing fibrinogen extravasation into Alzheimer's disease brain using high-content screening of brain tissue microarrays.</a> Journal of Neuroscience Methods. 247, 41-49 (2015).</li><li>Du, Y., Budman, H. M., Duever, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation+and+quantitative+analysis+of+apoptosis+of+Chinese+hamster+ovary+cells+from+fluorescence+microscopy+images.">Segmentation and quantitative analysis of apoptosis of Chinese hamster ovary cells from fluorescence microscopy images.</a> Microscopy and Microanalysis. 23 (3), 569-583 (2017).</li><li>Mueller, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+segmentation+of+fluorescence+microscopy+images+of+heterogeneous+tissue:+application+to+the+detection+of+residual+disease+in+tumor+margins.">Quantitative segmentation of fluorescence microscopy images of heterogeneous tissue: application to the detection of residual disease in tumor margins.</a> PLoS One. 8 (6), e66198 (2013).</li><li>Donnelly, D. J., Gensel, J. C., Ankeny, D. P., van Rooijen, N., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+reproducible+method+for+quantifying+macrophages+in+different+experimental+models+of+central+nervous+system+pathology.">An efficient and reproducible method for quantifying macrophages in different experimental models of central nervous system pathology.</a> Journal of Neuroscience Methods. 181 (1), 36-44 (2009).</li><li>Kozlowski, C., Weimer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+method+to+quantify+microglia+morphology+and+application+to+monitor+activation+state+longitudinally+in+vivo.">An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo.</a> PLoS One. 7 (2), e31814 (2012).</li><li>Fish, K. N., Sweet, R. A., Deo, A. J., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+segmentation+methodology+for+quantifying+immunoreactive+puncta+number+and+fluorescence+intensity+in+tissue+sections.">An automated segmentation methodology for quantifying immunoreactive puncta number and fluorescence intensity in tissue sections.</a> Brain Research. 1240, 62-72 (2008).</li><li>Zock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+high+content+screening+in+life+science+research.">Applications of high content screening in life science research.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 12 (9), 870-876 (2009).</li></ol>

Författarna har inga ekonomiska intressen i de produkter som beskrivs i detta manuskript och har inget annat att avslöja.

En gemensam problem fortfarande hindrar effektiviteten i biologisk vetenskap forskning är utvecklingen av protokoll för opartisk, korrekt och exakt kvantifiering av fluorescently-märkta vävnader och deras strukturer inom. Betydande mängder av tid och ansträngning är inriktade på att hitta sätt att analysera vävnad bilder när de har varit avbildad. Många befintliga metoder ge algoritmer för användare att återskapa inom program12,13,14. Dessa metoder är acceptabelt, men betydelsen av detta betänkande är att det möjliggör för användaren att snabbt och enkelt etablera en holistisk bild förvärv och analys protokoll om användaren har tillgång till en WHCAS. Analyser som skiljer celltyper och kvantifiera flera strukturer och processer, cellcykeln analys och translokationen i cellkärnan, exempelvis finns redan tillgängliga i den tillhörande programvaran.
Installationen omfattar några kritiska steg. För det första definieras rumsliga parametrarna för bilden som om det vore en tallrik. För det andra, en låg förstoring översikt scan skapas som regioner av intresse väljs för hög förstoring bildhantering. Slutligen, platser som påverkar den noggrannhet och precision av efterföljande analyser är undantagna. Den största begränsningen av denna teknik är att dess tillämplighet beror på om användaren har tillgång till en WHCAS. Dock med det ökande behovet för hög-innehållsanalys system tillhandahåller många institutioner dessa till sina forskare att förbli konkurrenskraftiga15. Felsökning behövs oftast när vävnadssnitt inte har samma tjocklek. Om flera områden av intresse är markerade, kommer några vara i fokus medan andra inte. Helst vid snittning, skulle användaren ta hand för att skapa homogena prover. Om proverna är inkonsekvent, kan fokus på kärn fläcken våglängden (eller användarens ljusaste fluorophore), som används för att fokus, dock justeras i varje out-of-fokus område av intresse och även för varje synfält. Som de andra våglängderna är helt enkelt Väggavstånd nukleära fläcken våglängden, behöver endast denna våglängd omställning.
I betänkandet detalj vi hur du skannar och analysera bilder med hjälp av en WHCAS och tillhörande programvara. Flera våglängder Cell Scoring modulen tillåter användaren att automatiskt räkna alla kärn- eller cytoplasmisk markörer som kallas fluorescently. Efter justerar fokus och definiera de cellulära egenskaperna såsom bredd och område att anpassa modulen i vävnad som avbildas, behövs det ingen ytterligare för användaren att få avbildad bilder och kvantitativa data. Upp till tre bilder kan avbildas i taget och flera regioner av intresse kan definieras. Detta protokoll kan WHCAS användare som behöver analysera bilderna dra nytta av anpassningsbara, multipurpose, automatiserade arbetsflöden som kräver lite till ingen optimering och kan användas i alla projekt i framtiden som berör den histologiska analysen av vävnad.

Korrekt och exakt kvantitering av fluorescently-märkta vävnader på bilderna är en mycket eftertraktad teknik inom många vetenskapliga områden. Dock forskare ofta manuellt räkna exemplar eller spenderar avsevärda mängder tid att utveckla esoteriska automatiserade tekniker för att uppnå detta. Häri, tillhandahåller vi ett protokoll för automatiserad diabilder och kvantifiering av celler med en WHCAS och dess tillhörande programvara, med innate immuna celler i frysta mänskliga hjärnan tumören sektioner som ett exempel. Den tillhörande mjukvaran erbjuder ett brett utbud av inbyggda anpassningsbara moduler från neurite utväxt räkna till differentiering av cell typer1,2,3,4,5, 6. målet med denna metod är att förse forskare med ett start-till-avslut och enkelt reproducerbar protokoll att förvärva bilder av och kvantifiera fluorescently-märkt enheter i någon bild-monterad vävnader.
I detta protokoll används främst i WHCAS för imaging plattor för efterföljande analys på tillhörande programvara även om en bild-adapter och grunderna för att glida skanning7 fanns tillgängliga. Det var oöverkomliga bild bilder för noggrann spatial kalibrering av området förvärv, val av lämpliga journaler, skapandet av skräddarsydda loadouts och en förbindelse med produkten företrädare krävs. I den bredare kroppen av litteratur, i stället för köpa en dedikerad slide-imaging och analys apparater8, kringgås en tidigare tekniska rapport med tillgång till denna programvara bild förvärv av bilderna på WHCAS alldeles9. Utföra bildanalys förvärv eller bild på olika plattformar kräver extra arbete för att säkerställa varje är kompatibel med den andra.
Möjligheten att använda WHCAS och dess programvara för Bildinsamling skulle undvika de onödiga komplikationerna letar eller utveckla ett arbetsflöde främmande för dessa verktyg. I denna artikel, stegen krävs för att skapa en låg förstoring översikt scan och motsvarande hög förstoring bilder genom att behandla bilden som en platta och de efterföljande analyser med hjälp av flera våglängder Cell Scoring segmentering modul möjliggör den syftesförändring av WHCAS. Detta lätt användbara protokoll ger en fördel över alternativa tekniker eftersom det finns ingen anledning att utveckla algoritmer eller flerstegs räkna protokoll10,11 när bilderna förvärvas på WHCAS. Detta protokoll mildrar tid att optimera en kvantifiering teknik, är mer exakt12 och effektiv än manuell räknar och maximerar användningen av WHCAS. Detta protokoll kan allmänt och enkelt användas eftersom det möjliggör avbildning och analys av alla fluorescently-märkt vävnader på bilderna.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1640">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">ImageXpress MicroXLS</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td style="width:1087px;">Apparatus for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">MetaXpress 5.1</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td>Associated software for ImageXpress MicroXL (runs on a PC with the Windows operating system).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Slide adapter</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td>Metal slide holder that fits into ImageXpress MicroXL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide_Region_Acquisition_revA.jzp</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td>The journal can be obtained from metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&#38;highlight=slide or from contacting a Molecular Devices representative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Slide_Region_Acquisition_Setup.JNL</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td>Select this journal in Step 6.6.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated slide scanning and segmentation in fluorescently-labeled tissues using a widefield high-content analysis system

Automatiserad diabilder och segmentering av fluorescently-märkta vävnader är det mest effektiva sättet att analysera hela bilder eller stora vävnadssnitt. Tyvärr, många forskare spendera stora mängder tid och resurser utveckla och optimera arbetsflöden som endast är relevanta för egna experiment. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll som kan användas av de med tillgång till ett widefield hög-innehållsanalys system (WHCAS) till bild alla slide-monterad vävnader, med alternativ för anpassning inom färdiga moduler som finns i den tillhörande programvaran. Inte ursprungligen tänkt för skanning av bilden, gör de steg som beskrivs i denna artikel det möjligt att förvärva diabilder bilder i den WHCAS som kan importeras till den tillhörande programvaran. I det här exemplet automatiserad segmentering av hjärnan tumör bilder demonstreras, men automatiserad segmentering av någon fluorescently-märkt kärn- eller cytoplasmisk markör är möjligt. Dessutom finns det en mängd andra kvantitativa programmoduler inklusive analyser för protein lokalisering/flyttning, cellulär proliferation/livskraft/apoptos och angiogenes som kan köras. Denna teknik kommer att spara forskare tid och ansträngning och skapa en automatiserad protokoll för bild analys.

Bilderna kan ses i programmet WHCAS. Figur 8 visar hög förstoring miniatyrer av alla platser inom regionen definierad av intresse. Granska varje plats för att identifiera de som bör undantas från analysen (exempel visas vid låg och hög förstoring i figur 8 och figur 9, respektive). Till exempel webbplats 149 är ur fokus (figur 9A), plats 219 har bubblor (figur 9B) och plats 54 innehåller ett veck (figur 9 c) och bör uteslutas. Det är typiskt att utesluta 10-15% av alla platser avbildade. I exemplet, 15,3% av platserna var uteslutna (25/300 hade bubblor, 17/300 var ur fokus, 3/300 veks och 1/300 var på kanten). Figur 10A är en representativ bild som valts ut för analys (dess motsvarande låg förstoring miniatyrbild visas i figur 8). Här, de motsvarande överlägg som genereras av flera våglängder Cell Scoring modulen visar resultaten av automatiserad segmentering utförs på plats 59, anpassade till författarnas specifikationer (kärnor minsta bredd = 2,5 µm, maximal bredd = 7,5 µm, och intensitet över lokala bakgrund = 35 graylevels; CD11b-positiva celler minsta bredd = 4 µm, maximal bredd = 18 µm, minsta målat område = 15 µm2och intensitet över lokala bakgrund = 310 graylevels; och CD45-positiva celler minsta bredd = 4 µm, maximal bredd = 18 µm, minsta målat område = 15 µm2och intensitet över lokala bakgrund = 50 graylevels). Efter segmentering, kvantitativa uppgifter om andelen celler färgning positivt för varje markör (6,2 ± 5,1% och 3,8 ± 2,1% av CD11b+ och CD45+ celler, respektive), båda markörer (3,5 ± 2,1% CD11b+CD45+ celler), inga markörer (86,6 ± 9,0% CD11b–CD45– celler; Figur 10B), menar målat område (40,0 ± 9,2 µm och 36,7 ± 7,6 µm av CD11b+ och CD45+ celler, respektive; Figur 10C), och menar fluorescensintensiteten (408.9 ± 40,3 relativa fluorescens enheter och 373,9 ± 38,1 relativa fluorescens CD11b+ och CD45+ celler, respektive; Figur 10D) kan erhållas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig1.jpg"> Figur 1: inställningar för bild förvärv vid låg förstoring. A. denna bild visar inställningarna för plattan. B. här, de platta botten inställningarna visas. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig2.jpg"> Figur 2: inställningar för bildspel anskaffningsvärde vid hög förstoring. Denna siffra visar urvalet av lämpliga journaler. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig3.jpg"> Figur 3: Demonstration av hur du placerar diabilder med bild adaptern. A. bilden placeras täckglas ner med etiketten på sidan av bilden adapter skåran. B. bild adaptern laddas in i widefield hög-innehållsanalys systemet. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig4.jpg"> Figur 4: inställningar för förhandsgranskning bild. A. denna siffra visar parametrar för förvärvet. B. här, värdena för Hoescht/DAPI våglängd inställningar visas. C. denna bild visar i journal-inställningar. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig5.jpg"> Figur 5: Rita en bild region. A. verktyget Rektangulärt område (andra ritverktyg kan inte användas) används för att välja förhandsgranska skanningsområdet och skapa regioner av intresse på DAPI Skanna. B. teal dispositionen i denna figur visar hur hela området i bilden (inklusive etiketten) bör väljas. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig6.jpg"> Figur 6: skapa regioner av intresse på förhandsgranskningen genomsökningen. Den förhandsvisningen eller DAPI scan representerar hela bildområdet. I det här exemplet finns det tre seriella hjärnan vävnadssnitt (de fasta vita rektangulära konturerna). Området ovanför dessa avsnitt representerar cirkulär etiketterna på bilden. Olika avsnitt arrangemang kommer inte begränsa det efterföljande urvalet av regioner av intresse. Regionen av intresse i detta exempel visas med en streckad vit rektangulär kontur. Scalebar = 1 mm. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig6large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig7.jpg"> Figur 7: grundläggande windows för hög förstoring bild förvärv. A. The förvärv webbplats Setup fönstret kommer att visa hur många kolumner och rader är inom regionerna av intresse. B. säkerställa rätt antal kolumner och rader som anges i figur 7A införs i rutan plattan förvärv Setup och platserna är kaklade. C. det är nödvändigt att hålla fönstret WellPositions öppen för varaktigheten av förvärvet bild även om den är tom. D. lämpligt antal regioner av intresse måste lyftas fram. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig7large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig8.jpg"> Figur 8: representativ bild av regionen sevärdheter. Varje webbplats kan visas i en sammansatt miniatyrbild av regionen av intresse. De representativa platser som har undantagits (markerade med röda rutor) och ett exempel på en medföljande webbplats (markerad med en grön ruta) visas vid en högre förstoring. Det rekommenderas att granska varje plats för att säkerställa att det är av tillräcklig kvalitet för analys. Scalebar = 1 mm. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig8large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig9.jpg"> Figur 9: exempel på webbplatser som bör undantas från analys. A. avsnitten mänskliga hjärnan tumören har färgats med CD11b (grön) och CD45 (röd), markörer av mikroglia och makrofager. Denna bild är ur fokus och har uteslutits från analysen. B. bubblor finns i denna bild som har uteslutits från den slutliga analysen. C. Denna webbplats uteslöts från analysen på grund av luckan i vävnaden. Skala barerna är 20 µm. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig9large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig10.jpg"> Figur 10: representativa bilder och analys. A. varje bild visas bredvid de overlayer som representerar resultatet av den automatiska segmenteringen. Överlägget, kärnor visas i vitt och positivt färgade celler visas i grönt för CD11b och röda för CD45. Efter exklusive platserna för otillräcklig kvalitet från analysen och kombinera resultaten av alla återstående platser, B. den genomsnittliga andelen totala antalet celler i varje plats som målat positivt för varje markör och samtidig märkt för båda markörer, C. Genomsnittligt färgade området och D. genomsnittliga cell intensiteten representeras grafiskt. RFU = relativ fluorescens enheter. Data är uttryckta som medelvärde ± standardavvikelse. Skala barerna är 20 µm. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig10large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System at JoVE.com

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Här beskriver vi ett protokoll för automatisk segmentering av fluorescently märkt vävnader på bilder med hjälp av ett widefield hög-innehållsanalys system (WHCAS). Detta protokoll har omfattande tillämpningar i något fält som omfattar kvantitering av fluorescerande markörer i biologiska vävnader inklusive biologiska vetenskaper, medicinsk teknik och medicin.

Automatiserad bild Scanning och segmentering i Fluorescently-märkt vävnader Widefield High-innehåll analyssystem med

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Provberedning, Imaging och analysprotokoll för knivsegg Scanning Mikroskopi

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Video-rate Scanning konfokalmikroskopi och Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematisk analys av<em&gt; In Vitro</em&gt; Cell Rolling Med hjälp av en platta med flera brunnar mikroflödessystem

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Beställa enskilda celler och Single Embryon i 3D Förlossning: En ny enhet för hög halt Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generering av ett tredimensionellt Full Tjocklek hudekvivalent och automatiserade sårar

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Stora ytor skanning sond Nanolithography underlättas av automatiska justering och dess tillämpning på substrat Fabrication för cellkulturstudier

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Stelhet mätning av mjuk silikon substrat för Mekanobiologi studier med Widefield fluorescens Mikroskop

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Levande Cell analys av Shear Stress på Pseudomonas aeruginosa använder ett automatiserat System för högre genomströmning mikrofabricerade

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Rening och analys av en monoklonal antikropp från äggstocksceller från kinesisk hamster med hjälp av ett automatiserat Mikrobioreaktor system

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Elektriska och magnetiska fältenheter för stimulering av biologiska vävnader

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...