Name: methods for detecting cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelial cells by pseudomonas aeruginosa
Uploaded: 2018-07-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa at JoVE.com

كان تمويل هذه البحوث في أجزاء من منح المعاهد الوطنية للصحة HL66299 للملخص والممولة من الميزانية العادية و SL، HL60024 للملخص، و HL136869 بوسط.

واستعرضت جميع الإجراءات الحيوان ووافق المؤسسية ولجنة العناية بالحيوان من جامعة ألاباما جنوب وأجريت وفقا لجميع اللوائح الاتحادية والولائية والمحلية. تم الحصول على الثقافات الأولية من الفئران خلايا بطانية ميكروفاسكولار الرئوية (بمفيكس) من "مرفق خلية الثقافة الأساسية" في مركز جامعة ألابا?...

<ol>
	<li>Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pneumonia+really+the+old+man's+friend?+Two-year+prognosis+after+community-acquired+pneumonia.">Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia.</a> Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).</li><li>Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+of+importance+for+the+long-term+prognosis+after+hospital+treated+pneumonia.">Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia.</a> Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).</li><li>Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+respiratory+tract+infections+and+risk+of+first-time+acute+myocardial+infarction.">Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction.</a> Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).</li><li>Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-term+survival+after+hospitalization+with+community-acquired+pneumonia.">Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia.</a> Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).</li><li>Yende, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+markers+at+hospital+discharge+predict+subsequent+mortality+after+pneumonia+and+sepsis.">Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis.</a> Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).</li><li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+hospitalization+for+pneumonia+and+subsequent+risk+of+cardiovascular+disease.">Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease.</a> J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).</li><li>Frank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exoenzyme+S+regulon+of+Pseudomonas+aeruginosa.">The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa.</a> Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).</li><li>Engel, J., Balachandran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Pseudomonas+aeruginosa+type+III+effectors+in+disease.">Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease.</a> Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).</li><li>Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y+is+a+promiscuous+cyclase+that+increases+endothelial+tau+phosphorylation+and+permeability.">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability.</a> J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).</li><li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y-mediated+tau+hyperphosphorylation+impairs+microtubule+assembly+in+pulmonary+microvascular+endothelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells.</a> PLoS One. 8, e74343 (2013).</li><li>Morrow, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+exoenzymes+U+and+Y+induce+a+transmissible+endothelial+proteinopathy.">Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).</li><li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+infection+liberates+transmissible,+cytotoxic+prion+amyloids.">Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids.</a> FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).</li><li>Stevens, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pseudomonas+aeruginosa+exoenzyme+Y+impairs+endothelial+cell+proliferation+and+vascular+repair+following+lung+injury.">The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).</li><li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creutzfeldt-Jakob+disease+and+scrapie+prions.">Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions.</a> Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).</li><li>Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie:+Uncertainties,+biology,+and+molecular+approaches.">Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches.</a> Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).</li><li>King, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characteristics+of+lung+macro-+and+microvascular+endothelial+cell+phenotypes.">Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes.</a> Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).</li><li>Marmont, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomeric+lipoprotein+PelC+guides+Pel+polysaccharide+export+across+the+outer+membrane+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).</li></ol>

وترد أساليب بسيطة في المختبر هنا، التي تسمح بالمظاهرات لتوليد أميلويدس السامة للخلايا أثناء الإصابة بالالتهاب رئوي التسبب في الكائن الحي. وتشمل هذه الأساليب خلية ثقافة الإنزيم سيتوتوكسيسيتي، إيمونوبلوتينج، كوانتيتيشن خلية القتل باستخدام الأسلوب المجهري الرواية، وربط تي إتش تي. أ?...

المرضى الذين ينجون من الالتهاب الرئوي يكون ارتفاع معدلات الوفاة في الأشهر التي تلت المستشفى تصريف1،2،،من34،،من56. وفي معظم الحالات، تحدث الوفاة بنوع من الفشل نهاية الجهاز بما في ذلك الكلي، الرئة، القلب، أو أحداث الكبد، فضلا عن السكتة الدماغية5،6. والسبب في ارتفاع معدل الوفيات في هذا المريض السكان أنشأ ابدأ.
ويصنف الالتهاب الرئوي أما يجري اكتسب المجتمع أو المكتسبة في المستشفى (المستشفيات)، والعوامل التي يمكن أن تسبب الالتهاب الرئوي وتشمل البكتيريا والفيروسات والفطريات والمواد الكيميائية. واحد من الأسباب الرئيسية لالتهاب رئوي المستشفوي هو بكتيريا الزائفة الزّنجاريّة. P. الزّنجاريّة هو كائن الغرام الذي يستخدم نظام إفراز نوع الثالث لنقل مختلف الجزيئات المستجيب، يسمى اكسونزيميس، مباشرة إلى السيتوبلازم للخلايا الهدف7،8. خلال عدوى خلايا غشائي الرئة، اكسونزيميس استهداف مختلف البروتينات داخل الخلايا، بما في ذلك شكل من أشكال بطانية من البروتينات المرتبطة microtubule تاو9،10،11،12 ، مما أدى إلى انهيار حاجز غشائي الناتجة في ذمة رئوية حادة، انخفضت وظائف الرئتين، وفي كثير من الأحيان، الموت.
وكما ذكر سابقا، المرضى الذين ينجون من الالتهاب الرئوي الأولى يكون ارتفاع معدلات الوفاة في الأشهر ال 12 الأولى بعد التخريج من المستشفى. إليه ممكنة لتفسير هذه الظاهرة هو أن يتم إنشاء نوع من السمية طويلة الأمد خلال العدوى الأولية التي تؤدي إلى سوء نتائج طويلة الأجل. ملاحظتان تدعم هذه الإمكانية. تفشل خلايا غشائي الرئة أولاً، مثقف التي تعامل في البداية مع P. الزّنجاريّة تنتشر لتصل إلى أسبوع بعد قتل البكتيريا بالمضادات الحيوية من13. ثبت البريونات ثانيا، المعمرة والوكلاء مع الخصائص بريون في مختلف الأمراض البشرية والحيوانية، لا سيما الأمراض المرتبطة بال14،العصبي15.
وقد وصف أساليب لدراسة إمكانية إنتاج العوامل السامة للخلايا المعمرة خلال العدوى الرئوية ابدأ. ويرد هنا سلسلة من فحوصات بسيطة في المختبر التي يمكن استخدامها للتحقيق في إنتاج سيتوتوكسين والنشاط بعد الإصابة باستخدام مشتركة الالتهاب رئوي تسبب عامل, P. الزّنجاريّة. ينبغي أن تكون هذه الاختبارات القابلة للتكييف وفقا للتحقيق التعريفي سيتوتوكسين ممكن بعد الإصابة باستخدام العوامل الأخرى التي تسبب الالتهاب الرئوي، وسوبيرناتانتس التي يتم إنشاؤها أيضا ينبغي أن تكون مفيدة للتحقيق في آثار سيتوتوكسينس في الجامعة الأجهزة أو الحيوانات. أخيرا، سوف تكون الاختبارات التي ترد هنا على الأرجح قابلة للتكيف لاختبار السوائل البيولوجية الحيوانية والبشرية لإنتاج cytotoxins أثناء الالتهاب الرئوي.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rabbit anti beta amyloid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>71-5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A11 amyloid oligomer antibody</td>
			<td>StressMarq</td>
			<td>SPC-506D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T22 anti-tau oligomer antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ABN454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 micron syringe filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Goat antirabbit IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6721-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains PA103 and &#916;PcrV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Griffonia lectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Helix pomatia lectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L1261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 micron nitrocellulose</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>162-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 2 collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30898.03IH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin Disodium salt</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>795496-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium phosphate heptahydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>MP021914221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>50-103-5801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10277</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for detecting cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelial cells by pseudomonas aeruginosa

المرضى الذين ينجون من الالتهاب الرئوي يكون ارتفاع معدلات الوفاة في الأشهر التي أعقبت التخريج من المستشفى. قد تم الافتراض بأن العدوى للأنسجة الرئوية أثناء الالتهاب الرئوي يؤدي إلى إنتاج cytotoxins المعمرة التي يمكن أن تؤدي إلى فشل اللاحقة نهاية الجهاز. وقد وضعنا في المختبر فحوصات لاختبار الفرضية القائلة بأن تنتج cytotoxins أثناء الإصابة الرئوية. تستخدم الخلايا غشائي الرئة الفئران المعزولة وبكتيريا الزائفة الزّنجاريّة كنظم نموذجية، وإنتاج سيتوكسينس بعد الإصابة بالخلايا البطانية من البكتيريا هو أثبت استخدام زراعة الخلايا التي تليها كوانتيتيشن المباشر باستخدام فحوصات نازعة لاكتات وطريقة مجهرية جديدة استخدام تكنولوجيا إيماجيج. كان تبين طبيعة هذه cytotoxins اميلويد فحوصات ملزمة تي ثيوفلافين وإيمونوبلوتينج وإيمونوديبليشن باستخدام الأجسام المضادة اميلويد A11. أظهرت تحليلات أخرى باستخدام إيمونوبلوتينج أن تاو oligomeric و Aβ أنتجت وصدر عن خلايا بطانية بعد الإصابة من P. الزّنجاريّة. يجب أن تكون هذه الطرق القابلة للتكييف وفقا لتحليلات للعينات السريرية البشرية.

وقد وضعت مقايسة بسيطة في المختبر الاعتداء على وجود سيتوتوكسينس في supernatants الخلايا المصابة ببكتيريا P. الزّنجاريّة. أساسا، تجمع الثقافة المتوسطة من الخلايا المصابة ح 4 بعد إضافة البكتيرية، تتم إزالة البكتيريا بالتعقيم تصفية الثقافة طافية، وثم يتم إضافة المادة ط?...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa at JoVE.com

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

طرق "كشف السامة للخلايا أميلويدس التالية العدوى من الرئة خلايا بطانية" الزائفة الزّنجاريّة

وترد أساليب بسيطة لما أبدته من إنتاج أميلويدس السامة للخلايا بعد إصابة بطانة الرئوية الزائفة الزّنجاريّة.

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

شارك في نماذج من الثقافة الزائفة الزنجارية الأغشية الحيوية نمت على خلايا حية إيرواي الإنسان

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

والزائفة الزنجارية السكيراء بيوفيلم في خلايا خميرة تدفق

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

طرق لتقييم موت الخلايا بيتا وساطة من قبل الخلايا اللمفاوية التائية السامة

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

اختيار المتصورة المنجلية الطفيليات لCytoadhesion لخلايا المخ البشري غشائي

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

عزل الحمض النووي الريبي الزائفة الزنجارية استعمار الهضمي المسالك الفئران

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

بعد الخلوي في مصير<em&gt; E. القولونية</em&gt; بعد الإصابة التي كتبها لامدا بالعاثية

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

على المدى الطويل المزمن<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; عدوى مجرى الهواء في الفئران

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

الزائفة الزنجارية المستحثة الرئة الإصابات نموذج

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

عدوي المكورات الرئوية من خلايا بطانة الإنسان الاساسيه في التدفق المستمر

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

ثقافة البديل مستعمرة صغيرة من Pseudomonas aeruginosa وكمية من Alginate لها

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...