Name: methods for detecting cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelial cells by pseudomonas aeruginosa
Uploaded: 2018-07-12T12:30:00
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Cette recherche a été financée en partie grâce à des subventions de NIH HL66299 TS, RB et SL, HL60024 à TS et HL136869 MF.

Toutes les procédures d’animaux ont été examinés et approuvés par les institutionnels et le Comité de protection des animaux de l’Université d’Alabama du Sud et ont été effectuées conformément aux règlements fédéraux, étatiques et locales. Les cultures primaires de rat pulmonaire les cellules endothéliales microvasculaires (PMVECs) proviennent de la cellule Culture Core Facility au centre de l’Université d’Alabama du Sud pour la biologie de poumon. Les cellules ont été préparés à l’aide ...

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	<li>Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pneumonia+really+the+old+man's+friend?+Two-year+prognosis+after+community-acquired+pneumonia.">Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia.</a> Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).</li><li>Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+of+importance+for+the+long-term+prognosis+after+hospital+treated+pneumonia.">Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia.</a> Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).</li><li>Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. 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D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y+is+a+promiscuous+cyclase+that+increases+endothelial+tau+phosphorylation+and+permeability.">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability.</a> J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).</li><li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y-mediated+tau+hyperphosphorylation+impairs+microtubule+assembly+in+pulmonary+microvascular+endothelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells.</a> PLoS One. 8, e74343 (2013).</li><li>Morrow, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+exoenzymes+U+and+Y+induce+a+transmissible+endothelial+proteinopathy.">Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).</li><li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+infection+liberates+transmissible,+cytotoxic+prion+amyloids.">Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids.</a> FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).</li><li>Stevens, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pseudomonas+aeruginosa+exoenzyme+Y+impairs+endothelial+cell+proliferation+and+vascular+repair+following+lung+injury.">The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).</li><li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creutzfeldt-Jakob+disease+and+scrapie+prions.">Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions.</a> Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).</li><li>Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie:+Uncertainties,+biology,+and+molecular+approaches.">Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches.</a> Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).</li><li>King, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characteristics+of+lung+macro-+and+microvascular+endothelial+cell+phenotypes.">Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes.</a> Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).</li><li>Marmont, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomeric+lipoprotein+PelC+guides+Pel+polysaccharide+export+across+the+outer+membrane+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).</li></ol>

Méthodes simples en vitro figurent ici, qui permettent la démonstration de la génération des cytotoxiques amyloïdes lors de l’infection avec une pneumonie causant l’organisme. Ces méthodes incluent un test de cytotoxicité de culture cellulaire, l’immunoblotting, la quantification des cellules tuer en utilisant une nouvelle méthode microscopique et liaison ThT. Des agents cytotoxiques, les analyses ont démontré qu’ils sont amyloïdes dans la nature (Figure 2 <strong...

Les patients qui survivent à une pneumonie ont élevé le taux de mortalité dans les mois qui suivent l’hôpital décharge1,2,3,4,5,6. Dans la plupart des cas, la mort survient par certains type de défaillance terminale d’organes y compris rénale, pulmonaire, cardiaque, ou des événements hépatiques, mais aussi des AVC5,6. La raison pour le taux de mortalité élevé chez cette population de patients n’a jamais été établie.
La pneumonie est classée comme étant soit extra-hospitalière ou nosocomiales (infections nosocomiales) et les agents qui causent la pneumonie incluent des bactéries, virus, champignons et produits chimiques. Une des principales causes de la pneumonie nosocomiale est la bactérie Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa est un organisme Gram négatif qui utilise un système de sécrétion de type III pour transférer les diverses molécules effectrices, appelés exoenzymes, directement dans le cytoplasme des cellules de cible7,8. Au cours de l’infection des cellules endothéliales pulmonaires, les exoenzymes ciblent diverses protéines intracellulaires, y compris une forme endothéliale de la protéine associée aux microtubules tau9,10,11,12 , conduisant à la rupture de la barrière endothéliale aboutissant à un oedème pulmonaire sévère, une diminution de la fonction pulmonaire et, souvent, la mort.
Comme indiqué précédemment, les patients qui survivent à la pneumonie initiale ont élevé les taux de mortalité dans les 12 premiers mois suivant la sortie de l’hôpital. Un mécanisme potentiel pour expliquer ce phénomène, c’est que certains type de toxine de longue durée de vie est dégagée au cours de l’infection initiale qui mène à mauvais pronostic à long terme. Deux observations confirment cette possibilité. Tout d’abord, cultivés pulmonaire les cellules endothéliales qui sont traités initialement par la P. aeruginosa ne parviennent pas à proliférer pour jusqu'à une semaine après que les bactéries sont tuées par les antibiotiques,13. Deuxièmement, longue durée de vie des prions et agents ayant des caractéristiques de prion ont été démontrées dans diverses maladies humaines et animales, notamment les maladies associées au système nerveux14,15.
Méthodes pour l’examen de la production potentielle d’agents cytotoxiques longue durée de vie au cours de l’infection pulmonaire n’ont jamais été décrites. Ici figurent une série de simples in vitro tests qui peut être utilisé pour étudier la production de cytotoxine et l’activité suite à une infection à l’aide d’un agent causant la pneumonie habituellement, P. aeruginosa. Ces tests devraient demeurer aisément adaptables pour étudier l’induction de cytotoxine possible suite à une infection à l’aide d’autres agents qui causent la pneumonie, et les fractions surnageantes générées doivent aussi être utiles pour étudier les effets des cytotoxines dans son ensemble organes ou des animaux. Enfin, les dosages qui sont décrites ici très probablement sera adaptables pour tester les liquides biologiques humains et animaux pour la production de cytotoxines au cours de la pneumonie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rabbit anti beta amyloid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>71-5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A11 amyloid oligomer antibody</td>
			<td>StressMarq</td>
			<td>SPC-506D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T22 anti-tau oligomer antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ABN454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 micron syringe filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Goat antirabbit IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6721-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains PA103 and &#916;PcrV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Griffonia lectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Helix pomatia lectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L1261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 micron nitrocellulose</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>162-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 2 collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30898.03IH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin Disodium salt</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>795496-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium phosphate heptahydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>MP021914221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>50-103-5801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10277</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for detecting cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelial cells by pseudomonas aeruginosa

Les patients qui survivent à une pneumonie ont élevé le taux de mortalité dans les mois qui suivent la sortie de l’hôpital. Il a émis l’hypothèse qu’infection du tissu pulmonaire au cours de la pneumonie entraîne la production de cytotoxines longue durée de vie qui peuvent conduire à la défaillance d’organes fin subséquente. Nous avons développé in vitro tests pour vérifier l’hypothèse que les cytotoxines sont produites au cours d’une infection pulmonaire. Les cellules endothéliales pulmonaires isolés de rats et la bactérie Pseudomonas aeruginosa sont utilisées comme systèmes modèles et la production de cytoxins suite à une infection des cellules endothéliales par les bactéries est démontrée à l’aide de culture cellulaire, suivie dosage direct à l’aide de tests de lactate déshydrogénase et une nouvelle méthode microscopique utilisant la technologie ImageJ. La nature amyloïde de ces cytotoxines a été démontrée par des essais de liaison thioflavine T et par immunotransfert et protocole à l’aide d’anticorps anti-amyloïdes A11. Des analyses plus poussées à l’aide d’immunotransfert ont démontré qu’oligomérique tau et bêta-amyloïdes produit et diffusé par les cellules endothéliales après infection par P. aeruginosa. Ces méthodes doivent demeurer aisément adaptables aux analyses des échantillons cliniques humains.

Un test simple in vitro a été développé pour doser la présence de cytotoxines dans les surnageants de cellules infectées par la bactérie P. aeruginosa. Fondamentalement, milieu de culture de cellules infectées est recueilli 4 h après l’addition de bactéries, les bactéries sont éliminées par stérilisation de filtre de surnageant de la culture, et puis le surnageant stérile est ajouté à une nouvelle population de cellules. Les cellules sont ensuite obser...

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Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Méthodes pour détecter les cytotoxiques amyloïdes suivant Infection de pulmonaire cellules endothéliales par Pseudomonas aeruginosa

Méthodes simples sont décrits pour démontrer la production des cytotoxiques amyloïdes suite à une infection de l’endothélium pulmonaire par Pseudomonas aeruginosa.

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