Name: methods for detecting cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelial cells by pseudomonas aeruginosa
Uploaded: 2018-07-12T12:30:00
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Questa ricerca è stata finanziata in parti da sovvenzioni NIH HL66299 TS, RB e SL, HL60024 a TS e HL136869 a MF.

Tutte le procedure di animali sono state esaminate e approvati dal comitato di cura di animale della University of South Alabama e istituzionale e sono state eseguite in conformità con tutte le normative federali, statali e locali. Colture primarie di cellule endoteliali microvascolari polmonare del ratto (PMVECs) sono stati ottenuti dall'impianto di Core di cultura cellulare presso la University of South Alabama di centro per biologia del polmone. Le cellule sono state preparate utilizzando le procedure precedentemente...

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	<li>Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pneumonia+really+the+old+man's+friend?+Two-year+prognosis+after+community-acquired+pneumonia.">Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia.</a> Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).</li><li>Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+of+importance+for+the+long-term+prognosis+after+hospital+treated+pneumonia.">Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia.</a> Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).</li><li>Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. 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D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y+is+a+promiscuous+cyclase+that+increases+endothelial+tau+phosphorylation+and+permeability.">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability.</a> J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).</li><li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y-mediated+tau+hyperphosphorylation+impairs+microtubule+assembly+in+pulmonary+microvascular+endothelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells.</a> PLoS One. 8, e74343 (2013).</li><li>Morrow, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+exoenzymes+U+and+Y+induce+a+transmissible+endothelial+proteinopathy.">Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).</li><li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+infection+liberates+transmissible,+cytotoxic+prion+amyloids.">Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids.</a> FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).</li><li>Stevens, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pseudomonas+aeruginosa+exoenzyme+Y+impairs+endothelial+cell+proliferation+and+vascular+repair+following+lung+injury.">The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).</li><li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creutzfeldt-Jakob+disease+and+scrapie+prions.">Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions.</a> Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).</li><li>Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie:+Uncertainties,+biology,+and+molecular+approaches.">Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches.</a> Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).</li><li>King, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characteristics+of+lung+macro-+and+microvascular+endothelial+cell+phenotypes.">Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes.</a> Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).</li><li>Marmont, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomeric+lipoprotein+PelC+guides+Pel+polysaccharide+export+across+the+outer+membrane+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).</li></ol>

Qui, metodi semplici in vitro sono delineati che consentono la dimostrazione della generazione di citotossici amiloidi durante l'infezione con una polmonite causando organismo. Questi metodi includono analisi di citotossicità di cultura cellulare, immunoblotting, quantificazione dell'utilizzo un metodo novello al microscopio e dell'associazione ThT di uccisione delle cellule. Analisi degli agenti citotossici hanno dimostrato che sono amiloide in natura (Figura 2 e </strong...

I pazienti che sopravvivono polmonite hanno elevato i tassi di mortalità nei mesi successivi ospedale scarico1,2,3,4,5,6. Nella maggior parte dei casi, la morte si verifica da qualche tipo di organo di estremità guasto tra cui renale, polmonare, cardiaca, o eventi del fegato, come pure colpo5,6. Il motivo per l'elevato tasso di mortalità in questa popolazione di pazienti non è mai stato stabilito.
Polmonite è classificato come sia essere acquisita in comunità o nosocomiali (nosocomial) e gli agenti che possono causare la polmonite includono batteri, virus, funghi e sostanze chimiche. Una delle principali cause di polmonite nosocomiale è il batterio Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa è un organismo gram-negativo che utilizza un sistema di secrezione di tipo III per trasferire varie molecole effettrici, definite ESOENZIMI, direttamente al citoplasma delle cellule bersaglio7,8. Durante l'infezione di cellule endoteliali polmonari, gli ESOENZIMI destinazione varie proteine intracellulari, compreso un modulo endoteliale del microtubule-collegata della proteina tau9,10,11,12 , che conduce alla rottura di barriera endoteliale con conseguente edema polmonare severo, diminuita funzione polmonare e, spesso, la morte.
Come affermato in precedenza, i pazienti che sopravvivono la polmonite iniziale hanno elevati tassi di mortalità nei primi 12 mesi dopo la dimissione dall'ospedale. Un potenziale meccanismo per spiegare questo fenomeno è che qualche tipo di tossina longeva viene generato durante l'infezione iniziale che conduce al risultato a lungo termine difficile. Due osservazioni supportano questa possibilità. Prime, coltivate cellule endothelial polmonare che sono trattate inizialmente con p. aeruginosa non riescono a proliferare per fino ad una settimana dopo i batteri vengono uccisi da antibiotici13. I prioni secondo, lunga vita e agenti con caratteristiche da prioni sono stati dimostrati in varie malattie umane e animali, in particolare le malattie connesse con il sistema nervoso14,15.
Non sono mai stati descritti metodi per esaminare il potenziale di produzione di agenti citotossici longevi durante l'infezione polmonare. Qui sono descritte una serie di saggi di semplice in vitro che può essere utilizzato per indagare la citotossina produzione e attività che segue infezione usando un agente comune che causa polmonite, p. aeruginosa. Queste analisi devono essere facilmente adattabile per indagare induzione citotossina possibili dopo l'infezione con altri agenti che causano la polmonite, e i surnatanti generati anche dovrebbero essere utili per investigare gli effetti di citotossine in tutto gli organi o gli animali. Infine, i saggi che sono descritte qui molto probabilmente sarà adattabili per testare fluidi biologici umani e animali per la produzione di citotossine durante la polmonite.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rabbit anti beta amyloid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>71-5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A11 amyloid oligomer antibody</td>
			<td>StressMarq</td>
			<td>SPC-506D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T22 anti-tau oligomer antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ABN454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 micron syringe filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Goat antirabbit IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6721-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains PA103 and &#916;PcrV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Griffonia lectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Helix pomatia lectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L1261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 micron nitrocellulose</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>162-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 2 collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30898.03IH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin Disodium salt</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>795496-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium phosphate heptahydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>MP021914221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>50-103-5801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10277</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for detecting cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelial cells by pseudomonas aeruginosa

I pazienti che sopravvivono polmonite hanno elevati tassi di mortalità nei mesi successivi alla dimissione dall'ospedale. È stato ipotizzato che l'infezione del tessuto polmonare durante la polmonite provoca la produzione di citotossine longeve che può condurre a guasto dell'organo fine successive. Abbiamo sviluppato le analisi in vitro per verificare l'ipotesi che citotossine sono prodotte durante l'infezione polmonare. Cellule endoteliali polmonari isolati del ratto e il batterio Pseudomonas aeruginosa sono utilizzati come sistemi modello, e la produzione di cytoxins dopo l'infezione delle cellule endoteliali dai batteri è dimostrata mediante coltura cellulare seguita da quantificazione diretta utilizzando dosaggi di lattato deidrogenasi e un nuovo metodo al microscopio che utilizza la tecnologia di ImageJ. La natura dell'amiloide di queste citotossine è stata dimostrata dalle analisi obbligatorie di tioflavina T e di immunoblotting e immunodepletion usando l'anticorpo dell'anti-amiloide A11. Ulteriori analisi mediante immunoblotting ha dimostrato che oligomerici tau e Aβ erano prodotte e rilasciate dalle cellule endoteliali dopo l'infezione da p. aeruginosa. Questi metodi dovrebbero essere facilmente adattabili alle analisi di campioni clinici umani.

Un test semplice in vitro è stato sviluppato per analizzare la presenza di citotossine in surnatanti delle cellule infettate dal batterio p. aeruginosa. Fondamentalmente, terreno di coltura da cellule infette sono raccolti 4 h dopo aggiunta batterica, i batteri sono stati rimossi da sterilizzazione filtro del surnatante della cultura, e quindi il surnatante sterile viene aggiunto a una nuova popolazione di cellule. Le cellule sono poi osservate 21-24 h dopo l'aggiunta d...

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Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Metodi per rilevare amiloidi seguente infezione di polmonare endoteliali cellule citotossiche da Pseudomonas aeruginosa

Metodi semplici sono descritti per la dimostrazione della produzione di citotossici amiloidi che segue infezione dell'endotelio polmonare da Pseudomonas aeruginosa.

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

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