Name: methods for detecting cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelial cells by pseudomonas aeruginosa
Uploaded: 2018-07-12T12:30:00
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Esta investigación fue financiada en parte por subvenciones de NIH HL66299 y TS, RB, SL, HL60024 a TS y HL136869 a MF.

Todos los procedimientos animales fueron revisados y aprobados por el Comité de cuidado del Animal de la Universidad de Alabama del sur e institucional y se realizaron conforme a las regulaciones federales, estatales y locales. Cultivos primarios de células endoteliales microvasculares pulmonar rata (PMVECs) se obtuvieron del fondo para el núcleo de la célula cultura en el centro de la Universidad de Alabama del sur para la biología del pulmón. Las células fueron preparadas usando procedimientos previamente descri...

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	<li>Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pneumonia+really+the+old+man's+friend?+Two-year+prognosis+after+community-acquired+pneumonia.">Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia.</a> Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).</li><li>Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+of+importance+for+the+long-term+prognosis+after+hospital+treated+pneumonia.">Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia.</a> Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).</li><li>Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. 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D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y+is+a+promiscuous+cyclase+that+increases+endothelial+tau+phosphorylation+and+permeability.">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability.</a> J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).</li><li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y-mediated+tau+hyperphosphorylation+impairs+microtubule+assembly+in+pulmonary+microvascular+endothelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells.</a> PLoS One. 8, e74343 (2013).</li><li>Morrow, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+exoenzymes+U+and+Y+induce+a+transmissible+endothelial+proteinopathy.">Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).</li><li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+infection+liberates+transmissible,+cytotoxic+prion+amyloids.">Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids.</a> FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).</li><li>Stevens, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pseudomonas+aeruginosa+exoenzyme+Y+impairs+endothelial+cell+proliferation+and+vascular+repair+following+lung+injury.">The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).</li><li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creutzfeldt-Jakob+disease+and+scrapie+prions.">Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions.</a> Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).</li><li>Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie:+Uncertainties,+biology,+and+molecular+approaches.">Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches.</a> Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).</li><li>King, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characteristics+of+lung+macro-+and+microvascular+endothelial+cell+phenotypes.">Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes.</a> Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).</li><li>Marmont, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomeric+lipoprotein+PelC+guides+Pel+polysaccharide+export+across+the+outer+membrane+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).</li></ol>

Aquí, simple en vitro métodos están descritos que permiten la demostración de la generación de amiloides citotóxicos durante la infección con una pulmonía que organismo. Estos métodos incluyen ensayos de citotoxicidad en cultivo celular, immunoblotting, cuantificación de célula matar utilizando un novedoso método microscópico y enlace de ThT. Análisis de los agentes citotóxicos han demostrado que son amiloide en la naturaleza (figura 2 y <strong cla...

Los pacientes que sobreviven la neumonía han elevado las tasas de mortalidad en los meses siguientes hospital descarga1,2,3,4,5,6. En la mayoría de los casos, la muerte se produce por algún tipo de insuficiencia de órgano, incluyendo renal, pulmonar, cardiaca, o hígados eventos como la carrera5,6. Nunca se ha establecido la razón de la elevada tasa de mortalidad en esta población de pacientes.
La neumonía se clasifica como siendo ya sea adquirida en la comunidad o adquirida en el hospital (nosocomial) y los agentes causantes de neumonía incluyen bacterias, virus, hongos y productos químicos. Una de las principales causas de neumonía nosocomial es la bacteria Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa es un organismo Gram-negativo que utiliza un sistema de secreción tipo III para transferir varias moléculas efectoras, como exoenzimas, directamente en el citoplasma de las células de destino7,8. Durante la infección de células endoteliales pulmonares, las exoenzimas objetivo diversas proteínas intracelulares, incluyendo una forma endotelial de la proteína asociada a microtúbulos tau9,10,11,12 , conduce a la ruptura de la barrera endotelial dando lugar a edema pulmonar severo, disminución de la función pulmonar y, a menudo, la muerte.
Como se indicó anteriormente, los pacientes que sobreviven la neumonía inicial han elevado las tasas de mortalidad en los primeros 12 meses después del alta hospitalaria. Un mecanismo potencial para explicar este fenómeno es que se genera algún tipo de toxina duradera durante la infección inicial que conduce a pobres resultados a largo plazo. Dos observaciones apoyan esta posibilidad. En primer lugar, cultivadas pulmonar las células endoteliales que son tratadas inicialmente con p. aeruginosa no proliferan por hasta una semana después de que las bacterias se destruyen con antibióticos13. Priones en segundo lugar, larga vida y agentes con las características del prión se han demostrado en varias enfermedades humanas y animales, particularmente las enfermedades asociadas con el sistema nervioso14,15.
Nunca se han descrito métodos para examinar el potencial de producción de agentes citotóxicos duraderos durante la infección pulmonar. Aquí se describen una serie de ensayos simples en vitro que puede utilizarse para investigar producción de citotoxina y actividad después de la infección con un agente que causa común de neumonía, p. aeruginosa. Estos ensayos deben ser fácilmente adaptables para investigar la inducción de la citotoxina posible después de la infección con otros agentes causantes de neumonía, y los sobrenadantes que se generan también deberían ser útiles para investigar efectos de citotoxinas en todo órganos o animales. Por último, los ensayos que se describen aquí es muy probable que será adaptables a prueba de fluidos biológicos humanos y animales para la producción de citotoxinas en neumonía.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rabbit anti beta amyloid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>71-5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A11 amyloid oligomer antibody</td>
			<td>StressMarq</td>
			<td>SPC-506D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T22 anti-tau oligomer antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ABN454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 micron syringe filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Goat antirabbit IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6721-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains PA103 and &#916;PcrV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Griffonia lectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Helix pomatia lectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L1261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 micron nitrocellulose</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>162-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 2 collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30898.03IH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin Disodium salt</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>795496-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium phosphate heptahydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>MP021914221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>50-103-5801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10277</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for detecting cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelial cells by pseudomonas aeruginosa

Los pacientes que sobreviven la neumonía han elevado las tasas de mortalidad en los meses después del alta hospitalaria. Se ha presumido que la infección del tejido pulmonar durante la neumonía los resultados en la producción de citotoxinas larga vida que puede llevar a insuficiencia del órgano de extremo posterior. Hemos desarrollado en vitro ensayos para probar la hipótesis que citotoxinas son producidos durante la infección pulmonar. Las células endoteliales pulmonares aislado de rata y la bacteria Pseudomonas aeruginosa se utilizan como sistemas modelo, y la producción de cytoxins después de la infección de las células endoteliales por la bacteria se demuestra mediante cultivo celular seguido por cuantificación directa mediante los análisis de lactato deshidrogenasa y un novedoso método microscópico utilizando tecnología de ImageJ. La naturaleza amiloide de estas citotoxinas fue demostrada por thioflavin T enlace ensayos y por immunoblotting y immunodepletion usando anticuerpo anti-amiloide de A11. Posteriores análisis mediante immunoblotting demostraron que los tau y Aβ se producida y liberada por las células endoteliales después de la infección por p. aeruginosa. Estos métodos deben ser fácilmente adaptables a los análisis de muestras clínicas humanas.

Un análisis simple en vitro ha sido desarrollado para analizar la presencia de citotoxinas en sobrenadantes de células infectadas con la bacteria p. aeruginosa. Básicamente, medio de cultivo de las células infectadas se recogen 4 h después de la adición de bacteria, las bacterias se eliminan por la esterilización del filtro de la cultura sobrenadante y luego se añade el sobrenadante estéril a una nueva población de células. Las células luego se observan 21-24...

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Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Métodos para la detección de amiloides siguiente infección de pulmonar endotelial células citotóxicas por Pseudomonas aeruginosa

Se describen métodos sencillos para la demostración de la producción de amiloides citotóxicos después de la infección del endotelio pulmonar por Pseudomonas aeruginosa.

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

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