Name: assessing collagen and elastin pressure-dependent microarchitectures in live, human resistance arteries by label-free fluorescence microscopy
Uploaded: 2018-04-09T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Les auteurs remercient le centre d’imagerie biomédicale danois moléculaire à la Faculté des Sciences naturelles, University of Southern Denmark, pour l’utilisation des laboratoires et des microscopes. Kristoffer Rosenstand et Ulla Melchior sont reconnues pour l’excellente assistance technique avec la pression myographie et d’imagerie.

Collection des biopsies du péricarde pariétal humain destiné à ces travaux ont été effectuée après consentement éclairé, comme précédemment décrit33. L’étude de tissus humains sont conformes aux principes énoncés dans la déclaration d’Helsinki34 et a été approuvé par les comités régionaux sur l’éthique de la santé recherche pour Southern Denmark (S-20100044 et S-20140202) et l’Agence danoise de Protection des données.
<p class="jove_titl...

Ce travail représente notre suggestion pour un standard, combinée d’imagerie et de la pression myographie approche, précieuse pour l’évaluation simultanée des propriétés mécaniques des artères de résistance et les changements liés à la pression dans la structure de cette artère mur sur une plage de pression de 0 à 100 mmHg. L’approche présentée a été développé en utilisant des équipements de construction personnalisée, cependant, n’importe quel myographe de pression qui s’adapte sur un mic...

La contribution pathogène et les effets du remodelage de l’artère de résistance sont documentées dans l’hypertension essentielle, le diabète et le syndrome métabolique1,2,3,4,5. Déchiffrer la relation entre les propriétés mécaniques et micro architecturale du mur microvasculaire est essentiel pour le développement de modèles mathématiques de cette association. Ces modèles seront mieux comprendre le processus de remodelage et soutiennent le développement de modèles de silico utile pour tester des stratégies pharmacologiques ciblant des maladies liées de remodelage de la paroi artérielle.
Études préalables porté à comprendre comment la microarchitecture de la paroi artérielle est liée à la mécanique de la paroi artérielle en incorporant des mesures mécaniques et la microarchitecture de la matrice extracellulaire (ECM) sont presque exclusivement réalisées sur les grands , les artères élastiques conduit des souris ou porcine6,7,8,9,10,11. Imagerie des microstructures de la paroi est généralement effectuée à l’aide des techniques optiques non linéaires, profitant de l’autofluorescence d’élastine et de deuxième génération harmonique de collagène. Cela permet l’imagerie spatio-temporelle des deux principales composantes de la matrice extracellulaire, élastine et du collagène, sans une nécessité pour la coloration. Imagerie de la paroi artérielle dans toute son épaisseur est un défi dans les artères de gros conduits en raison de la dispersion de la lumière dans les médias de tunica épais. Toutefois, pour déterminer comment la microarchitecture des composantes structurales de la paroi artérielle portent sur les propriétés mécaniques observées, informations en trois dimensions doivent être obtenues pendant l’essai mécanique. Pour les grosses artères comme l’aorte humaine, cette opération requiert biaxial montage, les essais mécaniques et imagerie des régions d’intérêt en morceaux2 1-2 cm de la paroi artérielle7,9,10, 12. qu’une partie de la paroi peut être imagée et testée mécaniquement.
Pour les plus petites artères de toute espèce (par exemple, péricardique humaine13, pulmonaire14 et les artères sous-cutanées15 , rat artères mésentériques16,17,18, 19 , 20, souris cremaster, mésentérique, cérébrale, fémorale et artères carotides21,22,23,24,25,26, 27) imagerie de l’épaisseur du mur entier est possible et peut être combinée avec les essais mécaniques. Cela permet l’enregistrement simultané des propriétés mécaniques et les arrangements structurels au sein de la paroi. Toutefois, une modélisation mathématique directe de la relation entre les altérations observées dans la structure tridimensionnelle de l’ECM et modifié les propriétés mécaniques de la paroi artérielle de résistance, au meilleur de nos connaissances seulement signale à récemment dans les artères de la résistance humaine13,15.
Dans ce travail, on décrit une méthode de ex vivo pour essais mécaniques passives et une imagerie tridimensionnelle simultanée de la microarchitecture d’élastine et de collagène dans la paroi artérielle des artères isolées de la résistance humaine. Le protocole d’imagerie peut être appliqué aux artères de résistance de toute espèce d’intérêt. Analyses d’image sont décrits pour l’obtention de mesures des angles de ramification de la limitante élastique interne et de rectitude de collagène adventitiels13 à l’aide de Fidji28. Les densités de volume collagène et d’élastine sont déterminées au moyen de logiciels Ilastik29 et enfin, on discute de l’inclusion des données mécaniques et d’imagerie dans les modèles mathématiques de la mécanique de la paroi artérielle.
Le but de décrire les analyses de l’imagerie et l’image en combinaison avec la modélisation mathématique des techniques consiste à fournir aux enquêteurs une approche systématique pour décrire et comprendre la pression induite par changements observés dans l’ECM des artères de résistance. La méthode décrite vise à quantifier les changements dans l’ECM dans un récipient pendant la pressurisation, en comparant la structure de l’ECM à 20, 40 et 100 mmHg. Ces pressions ont été retenues pour la détermination de la structure de la paroi artérielle plus dociles (20 mmHg), raide (100 mmHg) et un état intermédiaire de (40 mmHg), respectivement. Cependant, tout processus dans la paroi vasculaire des artères vivants, y compris les changements induits par les composants vasoactifs, hystérésis et flux, peut être quantifié, selon l’hypothèse de recherche en question par l’enquêteur.
L’utilisation de la microscopie de fluorescence excitation biphotonique (TPEM) en combinaison avec un myographe pression pour étudier la pression (ou autre) induit des changements dans l’ECM des artères direct est mis en valeur. Tout d’abord, parce que cela permet une acquisition simultanée de la structure tridimensionnelle dans l’ensemble de la paroi artérielle (diamètre et épaisseur de paroi) ainsi que l’acquisition de label-free tridimensionnelle de haute qualité, des images de la collagène et d’élastine détaillées microarchitectures comme décrit13 en profitant de l’autofluorescence élastine et le collagène deuxième génération harmonique signal (SHG)30. Deuxièmement, TPEM permet d’utilisation de la lumière d’excitation proche-infrarouge de faible énergie, minimiser le photovieillissement du tissu et ainsi, l’imagerie répété à exactement la même position dans la paroi vasculaire est autorisée, permettant des analyses répétées-Mensurations d’observé changements.
L’utilisation d’une approche alternative à l’aide de l’imagerie confocale de pression fixé des artères est discutée pour permettre aux utilisateurs sans accès à TPEM l’occasion d’utiliser la méthode décrite aussi bien. Informations sur la structure et le volume des densités ECM peuvent également être récupérées de l’analyse bidimensionnelle des tissus sectionnés en série, par exemple, tel que décrit par31,32. Toutefois, en raison de l’absence de possibilité de récupérer des informations structurelles en trois dimensions sur les échelles de longueur de l’artère ainsi qu’au cours de l’évolution des conditions à l’aide de cette méthode, il est déconseillé d’utiliser cette approche pour les enquêtes de pression et traitement induit des changements en trois dimensions de la MEC.
L’exigence minimale pour l’enquêteur d’appliquer la méthode décrite ci-après est l’accès à un programme d’installation pour canulation et la pressurisation des artères en combinaison avec un microscope à fluorescence excitation confocal ou deux photons. La configuration décrite dans le protocole suivant est un myographe pression sur mesure avec un capteur de force longitudinale, construit pour s’adapter sur un microscope à fluorescence personnalisé excitation construit à deux photons inversé.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="752">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:349px;">15401-12</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:349px;">11251-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Nikon</td>
			<td style="width:349px;">SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td>761028</td>
			<td>for dissection purpose</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark</td>
			<td style="width:349px;">1.63, 2.13, 210mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Smiths medical Intl, UK</td>
			<td style="width:349px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Ethicon</td>
			<td style="width:349px;">Ethilon 11-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Custom built</td>
			<td style="width:349px;"></td>
			<td>DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Mettler toledo</td>
			<td style="width:349px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">B3259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Merck Millipore, Hellerup, Denmark</td>
			<td style="width:349px;">1.00496.9010</td>
			<td>Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">P9666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">1.06462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">PHR1423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td>Z370525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Tocris Bioscience, Bristol, UK</td>
			<td style="width:349px;">538944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Nikon</td>
			<td style="width:349px;">Custom built</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Spectra Physics, Mountain View, CA</td>
			<td style="width:349px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Nikon</td>
			<td style="width:349px;">CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Nikon</td>
			<td>CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Hamamatsu, Ballerup, Denmark</td>
			<td style="width:349px;">H7422P-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">AHF analysentechnik AG (T&#252;bingen, Germany).</td>
			<td style="width:349px;">ChromaET 460 nm long pass dichroic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">AHF analysentechnik AG (T&#252;bingen, Germany).</td>
			<td style="width:349px;">Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">AHF analysentechnik AG (T&#252;bingen, Germany).</td>
			<td style="width:349px;">Chroma ET402/15X&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Scotch TM</td>
			<td style="width:349px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;"></td>
			<td style="width:349px;">coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing collagen and elastin pressure-dependent microarchitectures in live, human resistance arteries by label-free fluorescence microscopy

La contribution de pathogène de résistance artère remodelage est documentée dans l’hypertension essentielle, le diabète et le syndrome métabolique. Enquêtes et le développement de modèles mathématiques microstructurally motivés pour comprendre les propriétés mécaniques des artères de résistance humain sain ou malade ont le potentiel pour aider à comprendre comment la maladie et les traitements médicaux effet sur la microcirculation humaine. Pour développer ces modèles mathématiques, il est essentiel de déchiffrer la relation entre les propriétés mécaniques et micro architecturale du mur microvasculaire. Dans ce travail, nous décrivons une méthode ex vivo pour essais mécaniques passives et simultanée exempte d’étiquette imagerie en trois dimensions de la microarchitecture d’élastine et de collagène dans la paroi artérielle des artères isolées de la résistance humaine. Le protocole d’imagerie peut être appliqué aux artères de résistance de toute espèce d’intérêt. Analyses d’image sont décrits pour quantifier les changements i) induit par la pression dans les angles de ramification de la limitante élastique interne et de la rectitude de collagène adventitiels à l’aide de Fidji et des densités de volume ii) collagène et d’élastine, déterminées à l’aide du logiciel Ilastik. Préférence toutes les mesures mécaniques et d’imagerie sont effectuées sur les routes de live, perfusés, cependant, est une approche alternative à l’aide de pression standard de vidéo-microscopie myographie en combinaison avec l’imagerie après fixation de re-pressurisés discutés. Cette méthode alternative offre aux utilisateurs des options différentes pour les approches de l’analyse. L’inclusion des données mécaniques et d’imagerie dans les modèles mathématiques de la mécanique de la paroi artérielle est discutée, et développement futur et ajouts au protocole sont proposées.

Le myographe pression sur mesure pour l’imagerie utilisée dans ce travail est montré dans la Figure 1. Une attention particulière pour la conception de la myographe a été versée à i) la chambre avec une petite quantité (2 mL) et ii) la possibilité pour le positionnement des canules proche et en parallèle avec le fond de verre (Figure 1 b). Le fond de la chambre correspond à un 50 × 24 mm #1.5 verre couvre-objet (rem...

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Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Nous décrivons simultanée des essais mécaniques et 3D-imagerie de la paroi artérielle d’isolé, vivent les artères de la résistance humaine et des analyses d’image Fidji et Ilastik pour la quantification des densités de volume et d’organisation spatiales élastine et de collagène. Nous discutons de l’utilisation de ces données dans les modèles mathématiques de la mécanique de la paroi artérielle.

Évaluation de collagène et élastine Microarchitectures dépendant de la pression dans les artères de résistance vivants, humains en microscopie par Fluorescence Label-free

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

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