Name: assessing collagen and elastin pressure-dependent microarchitectures in live, human resistance arteries by label-free fluorescence microscopy
Uploaded: 2018-04-09T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy at JoVE.com

המחברים תודה דנית מולקולרית ביו-רפואית במרכז-הפקולטה למדעי הטבע, באוניברסיטת דרום דנמרק, לשימוש של מעבדות ומיקרוסקופים. כריסטופר Rosenstand, אולה מלכיאור הם הכירו לסיוע טכני מעולה עם הלחץ myography, הדמיה.

אוסף של ביופסיות של הכפורת הקודקוד אנושיים לשימוש בעבודה זו בוצעה לאחר בכתב הסכמה מדעת, כפי שתואר לעיל33. המחקר של רקמות לציית העקרונות המתוארים בקוד הצהרת הלסינקי34 , אושרה על ידי ה ועדות אתיקה במחקר בריאות דרום דנמרק (S-20100044 ו- S-20140202), הסוכנות להגנת נתונים דנית.
<p ...

עבודה זו מייצגת את ההצעה שלנו עבור סטנדרטית בשילוב הדמיה ואת הלחץ myography גישה, יקר עבור הערכה בו זמנית של התכונות המכאניות של התנגדות העורקים ושינויים הקשורים ללחץ במבנה של העורקים קיר על טווח הלחץ בין 0 ל- 100 מ מ כספית. הגישה הציג פותחה תוך שימוש בציוד בנוי מותאם אישית, עם זאת, כל myograph לחץ מתאי...

התרומה פתוגניים ואת ההשפעות של עמידות העורק שיפוץ מתועדים חיוני יתר לחץ דם, סוכרת, תסמונת מטבולית1,2,3,4,5. לפענח את הקשר בין המאפיינים מכני ו המיקרו-ארכיטקטוני של הקיר microvascular חיוני לפיתוח מודלים מתמטיים של עמותה זו. מודל שכזה לשפר את הבנת תהליך שיפוץ, יתמוך ההתפתחות במודלים silico שימושי לבדיקת אסטרטגיות תרופתי מיקוד מחלות הקשורות שיפוץ של הקיר עורקי.
מחקרים קודמים התמקדו בהבנת המיקרו-ארכיטקטורה של הקיר עורקי מתייחס מכניקה קיר העורק על ידי שילוב אמצעים מכניים וכיצד המיקרו-ארכיטקטורה של מטריצות (ECM) מבוצעות באופן כמעט בלעדי על גדול , צינור גמיש העורקים של עכברים או חזיר6,7,8,9,10,11. הדמיה של מזערים הקיר מתבצעת בדרך כלל באמצעות טכניקות אופטית לא-ליניאריות, מנצל autofluorescence של אלסטין, הדור השני הרמונית על ידי קולגן. פעולה זו מאפשרת הדמיה זמן-מרחבי של שני מרכיביה העיקריים של מטריצה חוץ-תאית, אלסטין קולגן, ללא צורך מכתים. הדמיה של הקיר עורקי בעובי מלא הוא אתגר בתוך צינור גדול עורקים עקב פיזור של האור בתקשורת tunica עבה. עם זאת, כדי לקבוע כיצד המיקרו-ארכיטקטורה של הרכיבים המבניים של הקיר עורקי להתייחס התכונות המכאניות נצפתה, יש להשיג מידע תלת מימדי במהלך הבדיקה מכני. עבור עורקים גדולים כמו העורקים אנושי, זה דורש הרכבה biaxial, מכני בדיקות הדמיה של אזורים עניין ב- 1-2 ס מ2 חתיכות של עורקי קיר7,9,10, 12. רק חלק הקיר יכול להיות עם תמונה ונבדק באופן מכני.
עבור עורקים קטנים יותר של כל מין (למשל, סביב הלב האנושי13, ריאתי14 ותת עורית15 העורקים, עכברוש העורקים מצע המעי העליון16,17,18, 19 , 20, העכבר cremaster, מצע המעי העליון, מוחי, הירך ואת עורק21,22,23,24,25,26, 27) הדמיה של עובי קיר שלם הינה אפשרית, יכול להיות משולב עם בדיקות מכניות. דבר זה מאפשר הקלטה בו זמנית של תכונות מכאניות, הסידורים מבניים בתוך הקיר. עם זאת, מידול מתמטי ישירה של יחסי הגומלין בין השינויים שנצפו במבנה תלת מימדי של ECM שהשתנו תכונות מכניות של הקיר עורקי ההתנגדות, לפי מיטב ידיעתנו רק דווחה על לאחרונה, ההתנגדות האנושית העורקים13,15.
בעבודה זאת, מתוארת שיטה שמחוץ עבור בדיקות מכניות פסיבי, הדמיה תלת מימדי בו זמנית של המיקרו-ארכיטקטורה של אלסטין וקולגן בקיר עורקי עורקי התנגדות אנושית מבודדת. פרוטוקול הדמיה ניתן ליישם התנגדות העורקים של כל מין עניין. ניתוח התמונה מתוארים להשגת למדידת זוויות הסתעפות פנימית פרופריה אלסטי, יושר קולגן adventitial13 באמצעות פיג'י28. צפיפות האחסון קולגן ואלסטין נקבעים באמצעות תוכנת Ilastik29 ונדון בסופו של דבר, ההכללה של הנתונים מכני, הדמיה במודלים מתמטיים של המכניקה קיר העורק.
מטרתו לתאר את הבדיקות לדימות ותמונה טכניקות בשילוב עם מודלים מתימטיים היא לספק החוקרים בגישה שיטתית כדי לתאר ולהבין נצפו שינויים בלחץ המושרה ה-ECM של התנגדות העורקים. השיטה המתוארת מתמקדת ב לכימות השינויים ECM מגרגרי בזמן לחץ, על-ידי השוואת מבנה ה-ECM-20, 40 ו- 100 מ מ כספית. הלחצים הללו נבחרו לקביעת המבנה של החומה העורקים שלו תואם יותר (20 מ מ כספית), נוקשה (100 מ מ כספית) ומצב ביניים (40 מ מ כספית), בהתאמה. עם זאת, כל תהליך בדופן כלי הדם העורקים בשידור חי, כולל שינויים המושרה על ידי רכיבים vasoactive, היסטרזיס וזרימה, ניתן לכמת, בהתאם ההשערה במחקר המדובר על-ידי החוקר.
השימוש של שני הפוטונים עירור קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ (TPEM) בשילוב myograph לחץ לשינויים לומד לחץ (או השני) הנגרמת ב- ECM העורקים בשידור חי מודגשת. קודם כל, כי זה מאפשר רכישת סימולטני של מבנה תלת-ממדי הכולל של החומה עורקי (קוטר וקיר עובי) יחד עם רכישת תלת-ממדי ללא תווית של איכות גבוהה, מפורט תמונות של קולגן, אלסטין microarchitectures כמו שמתואר13 על-ידי ניצול של autofluorescence של אלסטין, קולגן השני דור הרמונית אות (SHG)30. שנית, TPEM מאפשר שימוש של אור אנרגיה נמוכה-סגול עירור, מזעור נזקי של רקמות, לפיכך, הדמיה חוזרות ונשנות-בדיוק באותה התנוחה בתוך קיר וסקולרית מותרת, המתיר ניתוח מדידות חוזרות של שנצפו שינויים.
השימוש בגישה אלטרנטיבית באמצעות הדמיה קונאפוקלית של לחץ קבוע העורקים נדון כדי לאפשר למשתמשים ללא גישה TPEM הזדמנות להשתמש בשיטה המתוארת גם כן. גם ניתן יהיה לאחזר מידע על צפיפות במבנה ונפח ECM מניתוחי דו-ממדית של רקמות למחלקה של יציאה טורית, למשל כפי שמתואר על ידי31,32. עם זאת, בשל היעדר אפשרות לאחזר נתוני מבנה תלת-ממדי על המאזניים אורך של העורק, כמו גם במהלך שינוי תנאי השימוש בשיטה זו, זה לא מומלץ שימוש בגישה זו החקירות של לחץ, טיפול המושרה תלת מימדי לשינויים ECM.
הדרישה המינימלית עבור החוקר להחיל את שיטת המתוארים במסמך זה היא הגישה אל מלכודת תעלות, לחץ עורקי בשילוב עם מיקרוסקופ קונפוקלי או שני הפוטונים עירור קרינה פלואורסצנטית. ההגדרה תיאר בפרוטוקול הבא תהיה myograph לחץ לפי הזמנה עם מתמר כוח האורך, שנבנה כדי להתאים מיקרוסקופ פלורסצנטיות עירור מותאם אישית שני הפוטונים בנוי הפוכה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="752">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:349px;">15401-12</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:349px;">11251-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Nikon</td>
			<td style="width:349px;">SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td>761028</td>
			<td>for dissection purpose</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark</td>
			<td style="width:349px;">1.63, 2.13, 210mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Smiths medical Intl, UK</td>
			<td style="width:349px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Ethicon</td>
			<td style="width:349px;">Ethilon 11-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Custom built</td>
			<td style="width:349px;"></td>
			<td>DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Mettler toledo</td>
			<td style="width:349px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">B3259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Merck Millipore, Hellerup, Denmark</td>
			<td style="width:349px;">1.00496.9010</td>
			<td>Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">P9666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">1.06462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">PHR1423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td>Z370525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Tocris Bioscience, Bristol, UK</td>
			<td style="width:349px;">538944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Nikon</td>
			<td style="width:349px;">Custom built</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Spectra Physics, Mountain View, CA</td>
			<td style="width:349px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Nikon</td>
			<td style="width:349px;">CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Nikon</td>
			<td>CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Hamamatsu, Ballerup, Denmark</td>
			<td style="width:349px;">H7422P-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">AHF analysentechnik AG (T&#252;bingen, Germany).</td>
			<td style="width:349px;">ChromaET 460 nm long pass dichroic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">AHF analysentechnik AG (T&#252;bingen, Germany).</td>
			<td style="width:349px;">Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">AHF analysentechnik AG (T&#252;bingen, Germany).</td>
			<td style="width:349px;">Chroma ET402/15X&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Scotch TM</td>
			<td style="width:349px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;"></td>
			<td style="width:349px;">coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing collagen and elastin pressure-dependent microarchitectures in live, human resistance arteries by label-free fluorescence microscopy

התרומה פתוגניים של עמידות העורק שיפוץ מתועדת חיוני יתר לחץ דם, סוכרת, התסמונת המטבולית. חקירות ופיתוח מודלים מתמטיים microstructurally מוטיבציה להבנת התכונות המכאניות של העורקים ההתנגדות האנושית מחלה ובריאות יש פוטנציאל לסייע להבין כיצד מחלות וטיפולים רפואיים להשפיע את microcirculation אנושי. כדי לפתח מודלים מתמטיים האלה, זה חיוני כדי לפענח את הקשר בין המאפיינים מכני ו המיקרו-ארכיטקטוני של הקיר microvascular. בעבודה זו, אנו מתארים שיטה שמחוץ עבור בדיקות מכניות פסיבי, בו זמנית ללא תווית תלת מימדי הדמיה של המיקרו-ארכיטקטורה של אלסטין וקולגן בקיר עורקי עורקי התנגדות אנושית מבודדת. פרוטוקול הדמיה ניתן ליישם התנגדות העורקים של כל מין עניין. ניתוח התמונה מתוארים לכימות תנועת i) לחץ-induced שינויים זוויות הסתעפות פנימית פרופריה אלסטי וכן קולגן adventitial יושר באמצעות פיג'י צפיפויות כרך ii) קולגן ואלסטין נקבע באמצעות תוכנת Ilastik. רצוי כל המדידות מכני, דימות מבוצעות על העורקים בשידור חי, perfused, עם זאת, גישה חלופית באמצעות לחץ וידאו-מיקרוסקופ רגיל myography בשילוב עם קיבוע שאחרי הדמיה של כלי מווסת מחדש דנו. זו שיטה חלופית מספק למשתמשים עם אפשרויות שונות עבור ניתוח הגישות. ההכללה של הנתונים מכני, הדמיה במודלים מתמטיים של המכניקה קיר עורקי הנדונה, פיתוח עתידי ותוספות בפרוטוקול מוצעים.

Myograph לחץ לפי הזמנה עבור הדמיה להשתמש בעבודה זו מוצג באיור1. תשומת לב מיוחדת לעיצוב myograph הוקדשה i) קאמרית עם נפח קטן (2 מ"ל) ואפשרות ii) כדי למקמם את גליליים מקרוב ומקבילי עם תחתית זכוכית (איור 1B). החלק התחתון של החדר מתאים של 50 × 24 מ מ #1.5 זכוכית cover...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

אנו לתאר בדיקות מכניות בו זמנית, 3D-הדמיה של העורקים בדופן מבודדים, לחיות ההתנגדות האנושית העורקים, וניתוחים פיג'י, Ilastik התמונה עבור כימות של אלסטין וקולגן המרחבי הארגון ונפח צפיפות. נדון השימוש של נתונים אלה במודלים מתמטיים של קיר עורקי מכניקה.

הערכת Microarchitectures תלויי-לחץ קולגן ואלסטין, חיים, אנושי התנגדות העורקים על ידי קרינה פלואורסצנטית ללא תווית מיקרוסקופ

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

Extracellular Matrix in Animals

SCIENTISTS IN ACTION

Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Tri-שכבתית Electrospinning לחקות ארכיטקטורה העורקים באמצעות שפת Polycaprolactone, אלסטין, קולגן ו: מחקר ראשוני

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

ללא קשר, לייבל ללא ניטור של תאים תאי מטריקס באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

שימוש בBiosensors האופטי ללא תווית לזיהוי מודולציה של תעלות אשלגן על ידי קולטנים מצמידים G-חלבון

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Biochip אלקטרוכימי מבוסס Microfluidic לניתוח הכלאה DNA ללא תווית

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

קולגן שכבת הפקדת-ידי שכבה במכשירי microfluidic לMicrotissue ייצוב

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

טכניקה ללא תווית להדמית החלל-הזמן של פרשות תא בודדת

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

ללא תווית מולקולה בודדת איתור באמצעות תהודה אופטית Microtoroid

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

PIP על שבב: מחקר ללא תווית של אינטראקציות חלבון- phosphoinositide

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...