Name: assessing collagen and elastin pressure-dependent microarchitectures in live, human resistance arteries by label-free fluorescence microscopy
Uploaded: 2018-04-09T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Forfatterne takker dansk molekylær biomedisinsk bildebehandling sentrum på fakultetet of Natural Sciences, University of Southern Denmark, for bruk av laboratorier og mikroskop. Kristoffer Rosenstand og Ulla Melchior er anerkjent for utmerket kundestøtte med presset myography og bildebehandling.

Samling av biopsies av menneskelig parietal pericardium for bruk i dette arbeidet ble utført etter skriftlig samtykke, som beskrevet tidligere33. Studiet av menneskelig vev i samsvar med prinsipper i deklarasjonen i Helsinki34 og ble godkjent av den regionale komiteer på helse forskning etikk for sørlige Danmark (S-20100044 og S-20140202) og dansk Data Protection Agency.
1. samle vev og isolere (menneske) motstand arterie
<ol><li>Samle vevsp...

Dette arbeidet representerer vårt forslag for en standardisert, kombinert bildebehandling og trykk myography tilnærming, verdifulle samtidige vurdering av de mekaniske egenskapene av motstand arterier og press-relaterte endringer i oppbygning av hovedvei veggen over en trykket varierer fra 0 til 100 mmHg. Presentert tilnærmingen ble utviklet Bruk egendefinerte bygget, men noen press myograph som passer på en to-fotonet eksitasjon fluorescens mikroskop kan brukes når utformingen av både utstyr tillater avbilding av ...

Patogene bidrag og virkningene av motstand arterien remodeling er dokumentert i viktige hypertensjon, diabetes og Metabolsk syndrom1,2,3,4,5. Tyde forholdet mellom mekanisk og mikroarkitekturstruktur egenskapene til mikrovaskulær veggen er avgjørende for å utvikle matematiske modeller av denne tilknytningen. Slike modeller vil bedre forstå remodeling prosessen og vil støtte utviklingen av sili modeller nyttig for testing av farmakologiske strategier målretting sykdom relatert ombygging av arterieveggen.
Tidligere studier fokuserte forstå hvordan mikroarkitektur av arterieveggen gjelder arterieveggen mekanikk ved å innlemme mekanisk tiltak og mikroarkitektur med den ekstracellulære matrisen (EFM) utføres nesten utelukkende på store , elastisk kanal arterier fra mus eller svin6,7,8,9,10,11. Avbildning av microstructures av veggen utføres vanligvis med lineære optisk teknikker, utnytter autofluorescence av elastin og andre harmonisk generasjon av kollagen. Dette gjør spatiotemporal avbildning av to hovedkomponentene ekstracellulær matrix, elastin og kollagen, uten behov for flekker. Avbildning av arterieveggen full tykkelse er en utfordring i store kanal arterier på grunn av scatter lyset i tykke tunika media. Men for å avgjøre hvordan mikroarkitektur strukturelle komponentene i arterieveggen relatert til de observerte mekaniske egenskapene, må tre-dimensjonal informasjon hentes under mekanisk testing. For store arteriene som menneskelige aorta krever dette biaxial montering, mekanisk testing og imaging regioner av interesse i 1-2 cm2 stykker av arterieveggen7,9,10, 12. kun en del av veggen kan avbildes og mekanisk testet.
For mindre arterier av alle arter (f.eks human perikard13, lunge14 og underhud15 arteriene, rotte hvem arterier16,17,18, 19 , 20, mus cremaster, hvem, cerebral, femur og carotis arteriene21,22,23,24,25,26, 27) bildebehandling av hele veggtykkelse er mulig og kan kombineres med mekanisk testing. Dette tillater samtidig innspillingen av de mekaniske egenskapene og strukturelle avtaler i veggen. Men er en direkte matematisk modellering av forholdet mellom de observerte endringene i tredimensjonale strukturen av ECM og endrede mekaniske egenskaper av motstand arterieveggen, etter beste overbevisning bare rapportert på nylig i menneskelig motstand arterier13,15.
En ex vivo metode for passiv mekanisk testing og samtidige tredimensjonale imaging av mikroarkitektur av elastin og kollagen i arterieveggen av isolerte menneskelig motstand arterier er beskrevet i dette arbeidet. Tenkelig protokollen kan brukes på motstand arterier av alle arter av interesse. Bildet analyser er beskrevet for å få tiltak av interne elastisk lamina forgrening vinkler og adventitial kollagen rett linje13 med Fiji28. Kollagen og elastin volum tettheter fastsettes ved hjelp av Ilastik programvare29 og endelig inkludering av mekanisk og bildebehandling data i matematiske modeller av arterieveggen mekanikken diskuteres.
Målet med beskriver bildebehandling og bilde analysene teknikker i kombinasjon med matematisk modellering er å gi etterforskere en systematical tilnærming for å beskrive og forstå observert press induserte endringer i ECM av motstand arterier. Metoden beskrevet er fokusert i kvantifisere endringene i ECM i et fartøy i pressurization, ved å sammenligne strukturen av ECM på 20, 40 og 100 mmHg. Disse belastningene ble valgt for å bestemme strukturen i arterieveggen i mer kompatibel (20 mmHg), stive (100 mmHg) og mellomstatus (40 mmHg), henholdsvis. Imidlertid kan prosesser i vaskulære veggen av live arteriene, inkludert forandringer indusert av vasoactive komponenter, hysteresis og flyt, kvantifiseres, avhengig av forskning hypotesen aktuelle av utprøver.
Bruk av to-fotonet eksitasjon fluorescens mikroskopi (TPEM) i kombinasjon med et trykk myograph studerer press (eller andre) induserte endringer i ECM live arterier er vektlagt. Først, fordi dette gjør samtidige oppkjøpet av samlet tredimensjonale strukturen i arterieveggen (diameter og veggen tykkelse) sammen med tredimensjonale etikett-fri oppkjøpet av høy kvalitet, detaljerte bilder av kollagen og elastin microarchitectures som beskrevet13 ved å utnytte autofluorescence elastin og kollagen andre harmonisk generasjon signal (SHG)30. Andre tillater TPEM bruk av lavenergi nær infrarød eksitasjon lys, minimere photodamage vev og dermed gjentatte bildebehandling i nøyaktig samme posisjon innenfor vaskulære veggen er tillatt, tillater gjentatte målinger analyser av observert endringer.
Bruk av en alternativ tilnærming med AC confocal imaging press fast arterier er diskutert for å tillate brukere uten tilgang til TPEM en mulighet til å bruke beskrevet metoden også. Informasjon om ECM struktur og volum tettheter kan også hentes fra todimensjonal analyser av vev delt i føljetong, f.eks som beskrevet av31,32. Men på grunn av manglende mulighet til å hente tredimensjonale strukturinformasjon over lengden skalaer av arterien og endre ved hjelp av denne metoden, er det ikke anbefale å bruke denne tilnærmingen for undersøkelser av trykk og behandling indusert tredimensjonale endringer i ECM.
Minimumskravet etterforskeren bruke metoden her beskrevet er tilgang til et oppsett for cannulation og pressurization av arterier i kombinasjon med AC confocal eller to-fotonet eksitasjon fluorescens mikroskop. Beskrevet i følgende protokollen er en spesialbygd press myograph med en langsgående force svinger, bygd for å passe på en tilpasset bygget invertert to-fotonet eksitasjon fluorescens mikroskop.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="752">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:349px;">15401-12</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:349px;">11251-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Nikon</td>
			<td style="width:349px;">SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td>761028</td>
			<td>for dissection purpose</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark</td>
			<td style="width:349px;">1.63, 2.13, 210mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Smiths medical Intl, UK</td>
			<td style="width:349px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Ethicon</td>
			<td style="width:349px;">Ethilon 11-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Custom built</td>
			<td style="width:349px;"></td>
			<td>DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Mettler toledo</td>
			<td style="width:349px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">B3259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Merck Millipore, Hellerup, Denmark</td>
			<td style="width:349px;">1.00496.9010</td>
			<td>Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">P9666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">1.06462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">PHR1423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td>Z370525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Tocris Bioscience, Bristol, UK</td>
			<td style="width:349px;">538944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Nikon</td>
			<td style="width:349px;">Custom built</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Spectra Physics, Mountain View, CA</td>
			<td style="width:349px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Nikon</td>
			<td style="width:349px;">CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Nikon</td>
			<td>CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Hamamatsu, Ballerup, Denmark</td>
			<td style="width:349px;">H7422P-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">AHF analysentechnik AG (T&#252;bingen, Germany).</td>
			<td style="width:349px;">ChromaET 460 nm long pass dichroic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">AHF analysentechnik AG (T&#252;bingen, Germany).</td>
			<td style="width:349px;">Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">AHF analysentechnik AG (T&#252;bingen, Germany).</td>
			<td style="width:349px;">Chroma ET402/15X&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Scotch TM</td>
			<td style="width:349px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;"></td>
			<td style="width:349px;">coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing collagen and elastin pressure-dependent microarchitectures in live, human resistance arteries by label-free fluorescence microscopy

Patogene bidrag av motstand arterien remodeling dokumentert viktig hypertensjon, diabetes og Metabolsk syndrom. Undersøkelser og utvikling av microstructurally motiverte matematiske modeller for å forstå de mekaniske egenskapene av menneskelig motstand arterier i helse og sykdom har potensial til å hjelpe forstå hvordan sykdommen og medisinske behandlinger påvirke menneskelig blodsirkulasjonen. For å utvikle disse matematiske modeller, er det viktig å dechiffrere forholdet mellom mekanisk og mikroarkitekturstruktur egenskapene til mikrovaskulær veggen. I dette arbeidet beskriver vi en ex vivo metode for passiv mekanisk testing og samtidige etikett-fri tredimensjonale imaging av mikroarkitektur av elastin og kollagen i arterieveggen av isolerte menneskelig motstand arterier. Tenkelig protokollen kan brukes på motstand arterier av alle arter av interesse. Bildet analyser er beskrevet for kvantifisering i) press-indusert endringer i interne elastisk lamina forgrening vinkler og adventitial kollagen rett linje ved hjelp av Fiji og ii) kollagen og elastin volum tettheter bestemmes ved hjelp av Ilastik programvare. Fortrinnsvis alle mekaniske og tenkelig mål utføres på live, parfyme arterier, er imidlertid en alternativ tilnærming med standard video-mikroskopi trykk myography i kombinasjon med etter fiksering bildebehandling av nytt trykksatt fartøy diskutert. Denne alternative metoden gir brukerne ulike alternativer for analyse tilnærminger. Inkludering av mekanisk og bildebehandling data i matematiske modeller av arterieveggen mekanikken er diskutert, og fremtidig utvikling og tillegg for protokollen.

Spesialbygde press myograph for bildebehandling som brukes i dette arbeidet er vist i figur 1. Spesiell oppmerksomhet for design av myograph ble betalt til i) chamber med liten volum (2 mL) og ii) mulighet for posisjonering cannulae nær til, og parallelt med glass bunnen (figur 1B). Bunnen av kammeret passer en 50 × 24 mm #1.5 glass dekkglassvæske (utskiftbare). Trykk kontrolleren ble bygget fra en standard 1 L glassflaske og ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Vi beskriver samtidig mekanisk testing og 3D-bildebehandling av arterieveggen av isolert, live menneskelig motstand arterier og Fiji og Ilastik bilde analyser for kvantifisering av elastin og kollagen romlig organisering og volum tettheter. Vi diskuterer bruken av disse dataene i matematiske modeller av arterieveggen mekanikk.

Vurdere kollagen og Elastin press-avhengige Microarchitectures i Live, menneskelig motstand arterier av etiketten-fri fluorescens mikroskopi

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

Extracellular Matrix in Animals

SCIENTISTS IN ACTION

Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Ikke-kontakt, Label-fri Overvåking av celler og ekstracellulær matriks med Raman spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Bruk av Merkfritt Optiske biosensorer til Detect Modulation av kaliumkanaler av G-protein koblede reseptorer

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Høyoppløselig Spatiotemporal Analyse av Receptor Dynamics av ​​Single-molekyl fluorescens mikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

En microfluidic basert Elektrokjemisk biochip for Label-free DNA Hybridisering Analyse

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Fra Fast Fluorescens Imaging til Molecular Diffusion Lov om Aktive cellemembraner i et kommersielt mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Lag-på-lag Kollagen Nedfall i mikrofluid Enheter for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

En etikett-fri teknikk for rom-tid-Imaging av enkeltcelle Sekret

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Etikett-free enkelt molekyl Detection Bruke Microtoroid Optiske resonatorer

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

PIP-on-a-chip: En etikettfri studie av protein-fosfinositid-interaksjoner

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...