Name: assessing collagen and elastin pressure-dependent microarchitectures in live, human resistance arteries by label-free fluorescence microscopy
Uploaded: 2018-04-09T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Författarna vill tacka danska molekylär medicinsk Imaging centrum vid fakulteten för naturvetenskap, Syddansk Universitet, för användning av laboratorier och Mikroskop. Kristoffer Rosenstand och Ulla Melchior är erkända för utmärkt teknisk hjälp med trycket myography och bildbehandling.

Samling av biopsier av mänskliga parietala hjärtsäck för användning i detta arbete utfördes efter skriftligt informerat samtycke, som tidigare beskrivits33. Studiet av mänskliga vävnader överensstämma med principerna i Helsingforsdeklarationen34 och godkändes av den regionala kommittéer för hälsa forskningsetik för södra Danmark (S-20100044 och S-20140202) och danska dataskyddsverket.
1. samla vävnad och isolat (mänskliga) motstå...

Detta arbete representerar vårt förslag ett standardiserat, kombinerade imaging och trycket myography strategi, värdefullt för samtidig bedömning av de mekaniska egenskaperna hos motstånd artärer och tryck-relaterade förändringar i strukturen av arterial väggen över ett tryckområde från 0 till 100 mmHg. Den presenterade metoden utvecklades med hjälp av anpassade inbyggd utrustning, dock något tryck myograph som passar på en två-photon excitation fluorescens Mikroskop kan användas, när utformningen av b...

Det patogena bidrag och effekterna av motstånd artär remodeling dokumenteras i essentiell hypertoni, diabetes och metabola syndromet1,2,3,4,5. Dechiffrera förhållandet mellan mekanisk och mikrostrukturell egenskaperna för mikrovaskulära väggen är viktigt för att utveckla matematiska modeller av denna förening. Sådana modeller kommer att förbättra förstå remodeling processen och kommer att stödja utvecklingen av i silico modeller användbara för att testa farmakologiska strategier inriktning sjukdom relaterade remodeling i kärlväggen.
Tidigare studier fokuserat förstå hur mikroarkitekturen i kärlväggen avser kärlväggen mekanik mekaniska åtgärder och mikroarkitekturen av den extracellulär matrixen (ECM) utförs nästan uteslutande på stora , elastisk conduit artärer från möss eller svin6,7,8,9,10,11. Avbildning av mikrostrukturer av väggen är vanligen utförs med hjälp av olinjära optiska tekniker, utnyttja autofluorescens av elastin och harmonisk understödjautvecklingen av kollagen. Detta tillåter spatiotemporal avbildning av de två viktigaste komponenterna av extracellulärmatrix, elastin och kollagen, utan ett behov för färgning. Avbildning av kärlväggen i full tjocklek är en utmaning i stora conduit artärer tack vare scatteren av ljuset i tjock tunica media. För att avgöra hur mikroarkitekturen strukturella komponenter i kärlväggen avser observerade mekaniska egenskaper, måste dock tredimensionell information fås vid mekanisk provning. För stora artärer som mänskliga aorta kräver detta biaxiell montering, mekanisk provning och avbildning av regioner av intresse i 1-2 cm2 bitar av kärlväggen7,9,10, 12. endast en del av väggen kan avbildas och mekaniskt testade.
För mindre artärer av någon art (t.ex., mänskliga perikardiell13, pulmonell14 och subkutan15 artärer, råtta mesenterica artärer16,17,18, 19 , 20, mus cremaster, mesenteriska, cerebral, femorala och carotid artärer21,22,23,24,25,26, 27) avbildning av hela väggtjockleken är möjligt och kan kombineras med mekanisk provning. Detta tillåter samtidig inspelning av de mekaniska egenskaperna och de strukturella arrangemang inom väggen. Dock rapporterats en direkt matematisk modellering av förhållandet mellan de observerade förändringarna i ECM tredimensionella struktur och ändrade mekaniska egenskaper i kärlväggen motstånd, till bäst av vår kunskap endast vid nyligen i mänskliga motstånd artärer13,15.
I detta arbete beskrivs en ex vivo -Metod för passiv mekanisk provning och samtidiga tredimensionell avbildning av mikroarkitekturen av elastin och kollagen i kärlväggen av isolerade mänskliga motstånd artärer. Imaging protokollet kan tillämpas på motstånd artärer av alla arter av intresse. Bild analyser beskrivs för åtgärder av intern elastisk lamina förgrenade vinklar och adventitial kollagen rakhet13 använda Fiji28. Kollagen och elastin volym tätheter bestäms med Ilastik programvara29 och slutligen införandet av mekaniska och tänkbar data i matematiska modeller av kärlväggen mekanikerna diskuteras.
Målet att beskriva imaging och bild analyserna tekniker i kombination med matematisk modellering är att ge utredarna en systematisk metod för att beskriva och förstå observerat inducerad tryckförändringar i ECM av motstånd artärer. Den beskrivna metoden är fokuserad kvantifiera förändringar i ECM i ett fartyg under trycksättning, genom att jämföra struktur ECM på 20, 40 och 100 mmHg. Dessa tryck valdes för att bestämma strukturen i kärlväggen vid dess mer kompatibel (20 mmHg), stiff (100 mmHg) och mellantillstånd (40 mmHg), respektive. Dock kan någon process i kärlväggen av levande artärer, inklusive ändringar som induceras av vasoaktiva komponenter, hysteres och flöde, kvantifieras, beroende på forskning hypotesen i fråga av prövaren.
Användning av två-photon excitation fluorescensmikroskopi (TPEM) i kombination med en tryck-myograph för studera trycket (eller annan) inducerade förändringar i ECM av levande artärer framhävs. Först, eftersom detta tillåter samtidiga förvärv av den övergripande tredimensionella strukturen i kärlväggen (diameter och väggtjocklek) tillsammans med tredimensionella etikett-gratis förvärv av hög kvalitet, detaljerade bilder av kollagen och elastin microarchitectures som beskrivs13 genom att utnyttja den elastin autofluorescens och kollagen andra harmoniska generation signal (SHG)30. Det andra tillåter TPEM användning av energisnåla infrarött excitation ljus, minimera åldrad hud vävnad och således upprepade imaging på exakt samma position inom kärlväggen är tillåtet, tillåter upprepade-mätningar analyser av observerade förändringar.
Användningen av en alternativ metod som använder confocal avbildning av trycket fast artärer diskuteras så att användare utan tillgång till TPEM en möjlighet att använda den beskrivna metoden också. Information om ECM struktur och volym tätheter kan också hämtas från tvådimensionell analyser av vävnader sektioneras i följetong, e.g. som beskrivs av31,32. På grund av möjligheten att hämta tredimensionella strukturell information via längd skalorna i artären samt under förändrade villkor med hjälp av denna metod, det är dock inte rekommenderar detta tillvägagångssätt för utredningar av tryck och behandling inducerad tredimensionella förändringar i ECM.
Minimikravet för utredaren att tillämpa den häri beskrivna metoden är tillgång till en setup för kanylering och trycksättning av artärerna i kombination med en confocal eller två-photon excitation fluorescens Mikroskop. Den inställning som beskrivs i följande protokoll är en specialbyggd tryck myograph med en längsgående kraftgivare, byggd för att passa på en anpassad inbyggd inverterad två-photon excitation fluorescens Mikroskop.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="752">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:349px;">15401-12</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:349px;">11251-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Nikon</td>
			<td style="width:349px;">SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td>761028</td>
			<td>for dissection purpose</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark</td>
			<td style="width:349px;">1.63, 2.13, 210mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Smiths medical Intl, UK</td>
			<td style="width:349px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Ethicon</td>
			<td style="width:349px;">Ethilon 11-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Custom built</td>
			<td style="width:349px;"></td>
			<td>DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Mettler toledo</td>
			<td style="width:349px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">B3259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Merck Millipore, Hellerup, Denmark</td>
			<td style="width:349px;">1.00496.9010</td>
			<td>Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">P9666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">1.06462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td style="width:349px;">PHR1423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Sigma-Aldrich, Br&#248;ndby, Denmark.</td>
			<td>Z370525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">&#160;Tocris Bioscience, Bristol, UK</td>
			<td style="width:349px;">538944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Nikon</td>
			<td style="width:349px;">Custom built</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Spectra Physics, Mountain View, CA</td>
			<td style="width:349px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Nikon</td>
			<td style="width:349px;">CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Nikon</td>
			<td>CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Hamamatsu, Ballerup, Denmark</td>
			<td style="width:349px;">H7422P-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">AHF analysentechnik AG (T&#252;bingen, Germany).</td>
			<td style="width:349px;">ChromaET 460 nm long pass dichroic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">AHF analysentechnik AG (T&#252;bingen, Germany).</td>
			<td style="width:349px;">Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">AHF analysentechnik AG (T&#252;bingen, Germany).</td>
			<td style="width:349px;">Chroma ET402/15X&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">Scotch TM</td>
			<td style="width:349px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;"></td>
			<td style="width:349px;">coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing collagen and elastin pressure-dependent microarchitectures in live, human resistance arteries by label-free fluorescence microscopy

Patogena bidrag motstånd artär remodeling dokumenteras i essentiell hypertoni, diabetes och metabola syndromet. Utredningar och utveckling av microstructurally motiverade matematiska modeller för att förstå de mekaniska egenskaperna av mänskliga motstånd artärerna i hälsa och sjukdom har potential att hjälpa förståelse hur sjukdom och medicinska behandlingar påverka människors mikrocirkulationen. För att utveckla dessa matematiska modeller, är det viktigt att dechiffrera förhållandet mellan mekanisk och mikrostrukturell egenskaperna för mikrovaskulära väggen. I detta arbete beskriver vi en ex vivo -Metod för passiv mekanisk provning och samtidiga etikett-fri tredimensionell avbildning av mikroarkitekturen av elastin och kollagen i kärlväggen av isolerade mänskliga motstånd artärer. Imaging protokollet kan tillämpas på motstånd artärer av alla arter av intresse. Bild analyser beskrivs för att kvantifiera i) tryckinducerad förändringar i intern elastisk lamina förgrenade vinklar och adventitial kollagen rakhet med Fiji och ii) kollagen och elastin volym densiteter fastställs med hjälp av Ilastik programvara. Helst alla mekaniska och imaging mätningar utförs på levande, perfunderade artärer, dock en alternativ metod med standardtryck video-mikroskopi myography i kombination med efter fixering avbildning av nytt trycksatt fartyg är diskuteras. Denna alternativa metod ger användare med olika alternativ för analys metoder. Införandet av mekaniska och tänkbar data i matematiska modeller av kärlväggen mekanikerna diskuteras, och föreslås framtida utveckling och tillägg till protokollet.

Den specialbyggda trycket myograph för avbildning som används i detta arbete visas i figur 1. Särskild uppmärksamhet för utformningen av myograph betalades till i) kammaren med en liten volym (2 mL) och ii) möjligheten för positionering av kanyler nära till, och parallellt med glas botten (figur 1B). I kammarens botten passar ett 50 × 24 mm #1.5 täckglas (utbytbara). Tryckregulator byggdes från en standard 1 L glasflas...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Vi beskriva samtidig mekanisk provning och 3D-imaging i kärlväggen av isolerade, levande mänskliga motstånd artärer, och Fiji och Ilastik image analyser för kvantifiering av elastin och kollagen rumslig organisation och volym tätheter. Vi diskutera användningen av dessa data i matematiska modeller av kärlväggen mekanik.

Bedömningen av kollagen och Elastin Pressure-dependent Microarchitectures i Live, mänskliga motstånd artärer av etikett-fri fluorescensmikroskopi

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

Extracellular Matrix in Animals

SCIENTISTS IN ACTION

Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Tri-lager electrospinning att efterlikna Native Arteriell arkitektur med Polycaprolactone, elastin och kollagen: en förstudie

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Beröringsfri, Label-free övervakning av celler och extracellulär matris med Raman-spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Användning av Label fria optiska biosensorer för att upptäcka Modulering av kaliumkanaler av G-proteinkopplade receptorer

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Högupplöst Spatiotemporal Analys av Receptor Dynamics av ​​Single-molekyl fluorescensmikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

En mikroflödesbaserad Elektro Biochip för Label-fritt DNA hybridisering Analys

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Från Snabb fluorescens avbildning till molekylär diffusion lagen om Live cellmembran i en kommersiell mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Skikt för skikt kollagendeponering i mikroflödessystem enheter för Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

En etikett-fri teknik för spatiotemporala avbildning av en enda cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Label-fri enda molekyl Detection Använda Microtoroid optiska resonatorer

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

PIP-on-a-chip: En etikettfri studie av protein-fosfinositid-interaktioner

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...