Name: crispr-mediated reorganization of chromatin loop structure
Uploaded: 2018-09-14T12:30:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure at JoVE.com

Мы благодарим H. Chang, т. Oro, S. Tavazoie, Флинн, P. Батиста, э. Кало и весь Ван лаборатория для технической поддержки и критических чтении рукописи. S.L.M. получило поддержку в этой работе через NSFGRF (DGE-114747), NDSEGF (FA9550-11-C-0028) и Национальный институт рака (1F99CA222541-01). K.C.W. поддерживается премию карьеры для ученых-медиков из Фонда Добро пожаловать Берроуз и Дональд е. и Делия б. Бакстер фонд факультета ученый.

<ol>
	<li>Krivega, I., Dean, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+looping+as+a+target+for+altering+erythroid+gene+expression.">Chromatin looping as a target for altering erythroid gene expression.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1368, 31-39 (2016).</li><li>Matharu, N., Ahituv, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minor+loops+in+major+folds:+Enhancer-promoter+looping,+chromatin+restructuring,+and+their+association+with+transcriptional+regulation+and+disease.">Minor loops in major folds: Enhancer-promoter looping, chromatin restructuring, and their association with transcriptional regulation and disease.</a> PLoS Genet. 11, e1005640 (2015).</li><li>Dekker, J., Mart&#237;-Renom, M. A., Mirny, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+three-dimensional+organization+of+genomes:+interpreting+chromatin+interaction+data.">Exploring the three-dimensional organization of genomes: interpreting chromatin interaction data.</a> Nat. Rev Genet. 14, 390-403 (2013).</li><li>Kim, A., Dean, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+loop+formation+in+the+b-globin+locus+and+its+role+in+globin+gene+transcription.">Chromatin loop formation in the b-globin locus and its role in globin gene transcription.</a> Mol Cells. 34, 1-5 (2012).</li><li>Petrascheck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+looping+induced+by+a+transcriptional+enhancer+in+vivo.">DNA looping induced by a transcriptional enhancer in vivo.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3743-3750 (2005).</li><li>Ameres, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+DNA-loop+formation+blocks+transcriptional+activation+by+an+SV40+enhancer.">Inducible DNA-loop formation blocks transcriptional activation by an SV40 enhancer.</a> EMBO J. 24, 358-367 (2005).</li><li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+Long-Range+Genomic+Interactions+at+a+Native+Locus+by+Targeted+Tethering+of+a+Looping+Factor.">Controlling Long-Range Genomic Interactions at a Native Locus by Targeted Tethering of a Looping Factor.</a> Cell. 149, 1233-1244 (2012).</li><li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+developmentally+silenced+globin+genes+by+forced+chromatin+looping.">Reactivation of developmentally silenced globin genes by forced chromatin looping.</a> Cell. 158, 849-860 (2014).</li><li>Morgan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+Nuclear+Architecture+through+CRISPR-Mediated+Chromosomal+Looping.">Manipulation of Nuclear Architecture through CRISPR-Mediated Chromosomal Looping.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR.">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17 (1), 148 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lipofectamine 2000 Reagent. , (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNeasy Blood &amp; Tissue Kit Handbook. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclase I (M0302). , (2016).</li><li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification.">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods Mol Biol. 649, 247-256 (2010).</li><li>Shalem, O., Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. , 83-87 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNeasy Mini Handbook. , (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SuperScript VILO cDNA Synthesis Product Information Sheet. , (2015).</li><li>Theunissen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+culture+conditions+for+induction+and+maintenance+of+naive+human+pluripotency.">Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naive human pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 15, 471-487 (2014).</li><li>Mokry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+genome-wide+analysis+of+transcription+factor+occupancy,+RNA+polymerase+II+binding+and+steady+state+RNA+levels+identify+differentially+regulated+functional+gene+classes.">Integrated genome-wide analysis of transcription factor occupancy, RNA polymerase II binding and steady state RNA levels identify differentially regulated functional gene classes.</a> Nucleic Acids Res. 40, 148-158 (2012).</li><li>Drier, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oncogenic+MYB+feedback+loop+drives+alternate+cell+fates+in+adenoid+cystic+carcinoma.">An oncogenic MYB feedback loop drives alternate cell fates in adenoid cystic carcinoma.</a> Nat Genet. 48, 265-272 (2016).</li><li>Ryan, R. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+enhancer-associated+rearrangements+reveals+mechanisms+of+oncogene+dysregulation+in+B-cell+lymphoma.">Detection of enhancer-associated rearrangements reveals mechanisms of oncogene dysregulation in B-cell lymphoma.</a> Cancer Discov. 5, 1058-1071 (2015).</li><li>Montavon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+archipelago+controls+Hox+genes+transcription+in+digits.">A regulatory archipelago controls Hox genes transcription in digits.</a> Cell. 147, 1132-1145 (2011).</li><li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions.">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161, 1012-1025 (2015).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

The Most критические шаги в CLOuD9 хроматина циклических являются: 1) проектирование или с использованием правильного оформления, 2) изменение средств массовой информации ежедневно на преобразованы CLOuD9 клетки, включая ABA или ДМСО, 3) поддержание свежесть Аба и 4) выполнения точной и тщательной оценки Хроматин конформации.
Пределы CLOuD9 главным образом проживают в способность разработать руководства к целевой области выбора. Руководство РНК выполняют важную задачу по локализации dCas9 компоненты в целевых регионах ДНК, чтобы быть димерной и эффективность руководства основаны на их конкретной целевой сайт. Без надлежащего gRNA компонентов CLOuD9, система не сможет сформировать обратимо индуцированной петли. Таким образом путем разработки нескольких руководств для каждого региона интерес и распространение руководства над регионом 250-1000 bp, по крайней мере один успешный гид будет обеспечиваться. Руководство Расположение также является неотъемлемой частью точные результаты. Важно избежать направляющие расположены в сайтов связывания фактор транскрипции или других критических регионов для предотвращения фон эффекты, такие как вверх или вниз регуляции транскрипции. Кроме того точное местоположение CLOuD9 конструкции слегка может повлиять транскрипции гена целевого объекта. Это подчеркивает важность тестирования нескольких пар руководств для каждого целевого региона, для выявления наиболее надежный пару для экспериментальных целей. Кроме того в каждой паре целевых регионах, CSA конструкции должны быть ориентированы с оформления для S. aureus, и CSP конструкции должны быть ориентированы с оформления для S. pyogenes для ориентации специфичности.
Чтобы обеспечить точные результаты и правильный димеризации, важно также поддерживать свежесть клеточной среды после трансдукции CLOuD9 конструкций. Ежедневно средства массовой информации изменения и добавлением свежей dimerizer (или управления) гарантирует, что дополнительные конструкции останется в близости и сохранить измененные хроматина конформации. Кроме того важно гарантировать ABA свежие и хранился надлежащим образом по данным производителя протокол (открыт в течение 6 месяцев, холодный, хранится защищенный от света) для получения достоверных результатов.
В частности ABA dimerizer для CLOuD9 был использован с ABI и пыль димеризации белков, вместо того, чтобы более широко использовать FRB и FKBP системы. Необходимость rapalog для FRB/FKBP системы будет ограниченную применимость CLOuD9, из-за токсичности для раковых клеток. Альтернативные системы ABI/PYL обойти это ограничение, эффективно позволяя CLOuD9 быть более широко усваиваемый.
Коллективно мы разработали CLOuD9, уникальные и надежные технологии, которая может принудительно но обратимо создать контакты между дальней цели геномной локусов. Через склонение хроматина петли, мы также продемонстрировать, что CLOuD9 могут быть использованы для изменения экспрессии генов в соответствующем контексте сотовой. Адаптируемость технология позволяет неограниченное исследование взаимодействия между любые два геномной локусов, без необходимости предварительного знания циклов регионов или зацикливание механизмов. Кроме того CLOuD9 уникальный продемонстрировали обратимости позволяет дальнейшее изучение механизмов циклы заболеваний и развития. Хотя было четко продемонстрировали на цель эффекты хроматина циклов, есть еще быть данных, предлагая понимание эффекты пробить циклов и последующее воздействие на петлях на целевой.
Наши данные показывает только несколько приложений для этого инструмента, но подразумевает крупные идею что хроматина соглашение свидетельствует о экспрессии генов. Наша технология может использоваться для изучения и раскрыть нюансы структуры хроматина в регуляции генов, тем самым улучшение общего понимания роли хроматина, складывающиеся в транскрипции генов. Лучше понять тонкости транскрипционный анализ динамики может возглавить процесс исследования и лечения рака, наследственных заболеваний и врожденных расстройств, в котором собственный хроматина Ассамблея несомненно изменяет выражение гена в20, 21,,22-23. Последующие работы, используя технологию CLOuD9 будет освещать дальнейшие сведения о расположении и динамика доменов хроматина и как они управляют, складные для поддержания стабильной ген выражение как развития, так и болезни.

Отношения между хроматина, складывающиеся в ядре и конкретные организации генома собрала значительный интерес в последние годы, как было показано, быть тесно связан с ген выражение1,2. Хотя точные отношения между генной активности и модуляции структуры хроматина остается неясным, было предположить, что взаимодействия между хромосомной контактов в результате динамический трехмерный хроматина Организации служат Джин регуляционная функция3. Действительно такой эффект хорошо продемонстрирована на Локус гена глобина человека, где локус контроля региона (LCR) регулирует активность генов Глобин развивающих определенным образом, создавая петлю хроматина между двумя регионами4. Однако в этом и других регионах, он мутноват ли цикл хроматина причиной или следствием изменения в экспрессии генов.
До сих пор остаются нерешенными проблемы в изучении этого явления. Например другие попытки заставить хроматина петли участие изменения в линейной последовательности ДНК или сложных процедур, требующих обилие фоновых знаний по конкретным элементам, которые облегчают цикл5,,6, 7,8. Кроме того в то время как предыдущие работы предположил, что хроматина петли диск экспрессии генов в контексте конкретных и ограниченных7,8, уровень, на котором хроматина цикл влияет на транскрипции глобально является неопределенным. Хотя постоянно в последние годы вырос интерес в воздействии долгосрочных циклов на экспрессию генов, сохраняются нерешенные вопросы о создании и сохранении хроматина контактов для изменения активности гена.
Технологии, которые мы инженерии использует нуклеиназы кластерных регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) - ТРИФОСФАТЫ - связанные протеина 9 (dCas9), для широко применимым таргетинга любой геномной локусов9. Эта технология исключает сложные вопросы, связанные с внесением изменений в линейной последовательности ДНК и доступен без существенных предварительных знаний о конкретных циклов компонентов. Прежде всего этот инструмент является универсальным и широко применимые к петли хроматина, признается в области развития, а также различных заболеваний, таких как рак. Доказывается, что власть CLOuD9 обратимого изменения структуры петли для эффективно модуляции экспрессии генов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:889px;" width="890">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">RPMI 1640&#160; media</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11875-119</td>
			<td style="width:484px;">For K562 cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DMEM media</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11995-065</td>
			<td>1X, for 293T cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">lentiCRISPR v2</td>
			<td style="width:71px;">Addgene plasmid</td>
			<td style="width:119px;">#52961</td>
			<td>For CLOuD9 plasmid development</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pRSV-Rev</td>
			<td style="width:71px;">Addgene plasmid</td>
			<td style="width:119px;">#12253</td>
			<td>For lentivirus production</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pMD2.G</td>
			<td style="width:71px;">Addgene plasmid</td>
			<td style="width:119px;">#12259</td>
			<td>For lentivirus production</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pMDLg/pRRE</td>
			<td style="width:71px;">Addgene plasmid</td>
			<td style="width:119px;">#12251</td>
			<td>For lentivirus production</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11668-019</td>
			<td>For lentivirus production</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-HA antibody</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">3724</td>
			<td>For immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-Flag antibody</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F1804</td>
			<td>For immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNeasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">69504</td>
			<td>For DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TRIzol</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15596-018</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RNeasy Kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74106</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Superscript VILO</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11754-050</td>
			<td>For cDNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Green I MasterMix</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4707516001</td>
			<td>For qPCR analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Light Cycler 480II</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For qPCR analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-H3K4me3 antibody</td>
			<td style="width:71px;">AbCam</td>
			<td style="width:119px;">ab8580</td>
			<td>For ChIP-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-RNA Pol-II antibody</td>
			<td style="width:71px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">61083</td>
			<td>For ChIP-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA free protease inhibitor</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11873580001</td>
			<td>For protein extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4-12% Tris Glycine gel</td>
			<td style="width:71px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any size, For western blot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-Rabbit HRP antibody</td>
			<td style="width:71px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-2030</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-mouse HRP antibody</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">7076S</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">K562 and H3K293 ChIP-Seq data</td>
			<td style="width:71px;">Encode</td>
			<td style="width:119px;">ENCSR000AKU</td>
			<td>For ChIP-seq analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">K562 and H3K293 ChIP-Seq data</td>
			<td style="width:71px;">Encode</td>
			<td style="width:119px;">ENCSR000APE</td>
			<td>For ChIP-seq analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">K562 and H3K293 ChIP-Seq data</td>
			<td style="width:71px;">Encode</td>
			<td style="width:119px;">ENCSR000FCJ</td>
			<td>For ChIP-seq analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">K562 and H3K293 ChIP-Seq data</td>
			<td style="width:71px;">GEO</td>
			<td style="width:119px;">GSM1479215</td>
			<td>For ChIP-seq analysis</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10001D</td>
			<td>For immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10004D</td>
			<td>For immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNA Clean &#38; Concentrator-5</td>
			<td style="width:71px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">R1015</td>
			<td>For RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pierce 16% Formaldehyde Methanol-free</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28908</td>
			<td>For crosslinking</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PX458 Plasmid</td>
			<td style="width:71px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">48138</td>
			<td>Suggested active Cas9 plasmid for gRNA cloning, but any active Cas9 plasmid will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td>For PCR purification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">FastDigest BsmBI</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FD0454</td>
			<td>For cloning guide RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">FastAP</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EF0651</td>
			<td>For cloning guide RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">10X FastDigest Buffer</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B64</td>
			<td>For cloning guide RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>For cloning guide RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10X T4 Ligation Buffer</td>
			<td style="width:71px;">NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td>For cloning guide RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:71px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0201S</td>
			<td>For cloning guide RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2X Quick Ligase Buffer</td>
			<td style="width:71px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">B2200S</td>
			<td>For cloning guide RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Quick Ligase</td>
			<td style="width:71px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M2200S</td>
			<td>For cloning guide RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Buffers</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Farnham lysis buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>1% Tris-Cl pH 8.0, 1% SDS, 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA), and 1 mM EDTA in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Modified RIPA buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>1% NP40/Igepal, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, and 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA) in PBS pH 7.8 or 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IP dilution buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>0.01% SDS, 1.1% Triton-X 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 0.1x protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wash buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40, and 1% sodium deoxycholate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Swelling buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>0.1 M Tris pH 7.5, 10 mM potassium acetate, 15 mM magnesium acetate, 1% NP-40</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dilution buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris pH 8 and 167 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">IP elution buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>1% SDS, 10% NaHCO3 &#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr-mediated reorganization of chromatin loop structure

Недавние исследования показали, ясно, что на большие расстояния, трехмерные хроматина, цикл взаимодействия играть значительную роль в регуляции экспрессии генов, но ли цикл отвечает за или в результате изменения в экспрессии генов равно неизвестно. До недавнего времени, как хроматина цикл влияет на регулирование активности генов и клеточную функцию был довольно неоднозначной, и ограничения в существующие методы для манипулирования эти структуры не позволяют углубленное изучение этих взаимодействий. Чтобы устранить эту неопределенность, мы инженерии метод для селективного и обратимым хроматина цикл повторной организации с помощью ТРИФОСФАТЫ dCas9 (CLOuD9). Динамизм CLOuD9 системы была продемонстрирована успешной локализации CLOuD9 конструкций целевой геномной локусов для модуляции местных хроматина конформации. Важно отметить, что подтверждено также возможность обратить вспять индуцированных контакт и восстановления конформации эндогенного хроматина. Модуляции экспрессии генов с помощью этого метода устанавливает способности регулировать экспрессию клеточных генов и подчеркивает огромный потенциал для применения этой технологии в создании стабильной de novo хроматина петли, которые существенно влияют на ген выражение в контексте рака и развития.

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure at JoVE.com

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Хроматин цикла играет значительную роль в регуляции генов; Однако были не технологических достижений, которые позволяют для селективного и обратимые изменения хроматина петель. Здесь мы описываем мощную систему для повторной организации хроматина цикла с помощью ТРИФОСФАТЫ dCas9 (CLOuD9), продемонстрировал избирательно и обратимо модуляции экспрессии генов в целевых локусов.

ТРИФОСФАТЫ опосредованной реорганизация структуры хроматина цикла

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы, связанные с экспрессией генов, показывающие нам, как именно хроматин структура влияет на экспрессию генов и как хроматин организация регулирует транскрипционные динамики. Мы разработали эту технологию, потому что мы хотели быть в состоянии управляемо изменять хромосомную архитектуру, чтобы создать цикл дальнего хроматина. Хотя в то же время имеют возможность обратить вспять контекст хроматина для восстановления эндогенной хромосомной структуры.Этот метод был разработан для простоты использования и широкой применимости. Мы воспользовались нетоксичным димеризатором, а также ортогональным видом dcas9, чтобы позволить использовать систему более широко. Мы разработали этот метод, потому что мы хотели быть в состоянии ответить на давний курица-и-яйцо вопрос о том, экспрессия генов порождает хромосомной архитектуры или же хромосомная структура приводит к изменениям в экспрессии генов.В текстовом протоколе описана конструкция последовательностей РНК CRISPR-руководства и поддержание клеточных культур. Плазмид карты и грунтовки используются перечислены там дюйма Начните плазмидный препарат, смешивая пять микрограммов лентивирусной плазмиды CRISPR с тремя микролитров BsmB1 тремя микролитров щелочной фосфатазы шестью микролитров буфера пищеварения 10x и 0,6 микролитров свежеприготовленных 100 миллимолейр DTT.Доведите общий объем до 60 микролитров двойной дистиллированной воды и инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут, чтобы переварить и де-фосфорилат плазмиды. Затем гель очищает переваренную плазмиду в петле плазмидной и двойной дистиллированной воды. Далее подготовьтесь к аннелинг-реакциям для пар РНК-руководства.Объедините один микролитер каждой направляющий РНК на 100 микромолейных с одним микролитером 10x T4 перевязочных буферов 6,5 микролитров двойной дистиллированной воды и 0,5 микролитров T4 PNK для общего объема реакции 10 микролитров. Чтобы аннеал руководство РНК пар их целевых последовательностей инкубировать смеси при температуре 37 градусов по Цельсию в 30 минут, а затем инкубации при 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут, а затем постепенно снизить температуру до 25 градусов по Цельсию, уменьшая его на пять градусов по Цельсию в минуту. Далее разбавить annealed руководство РНК на один-двести в двойной дистиллированной воды.Теперь подготовь две реакции перевязки. Смешайте один микролитер переваренной плазмиды с 0,5 микролитров разбавленного периванального направляющий RNAse 2,5 микролитров 2x буфера перевязки один микролитер двойной дистиллированной воды и 0,5 микролитров лигазы. Инкубировать реакции при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы ligate направляющие BsmB1 переваривается плазмида.Затем преобразуйте недавно перевязанные плазмиды в стабильные три бактерии и усиливайте бактерии, используя любой метод плазмидной подготовки. На шести-хорошо пластины, на колодец, семена 750000 2n3 Tcells в DMEM с 10%FBS и 1%pen strep. Используйте один колодец для каждой конструкции и инкубировать клетки в течение 24 часов.На следующий день, изменить средний на свежий антибиотик бесплатно-DMEM с 10%FBS. Сразу после смены среды для каждой колодец потроха клетки готовят трубку из лентивирусной производственной смеси. За каждую реакцию разбавляют 11 микролитров липидо-базового трансфектного реагента 150 микролитров среды Opti-MEM для каждой реакции.Затем в отдельных трубках готовят ДНК. Объедините два микрограмма плазмиды переносчика CLOud9 с двумя микрограммами других компонентов лентивирусной упаковки. Разбавить эту смесь в 150 микролитров opti-MEM среды.Затем объединить равные объемы разбавленной лентивирусной плазмидной смеси в разбавленной липидной трансфекции реагента и инкубировать смеси в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем к каждому колодец клеток добавляют одну трубку подготовленных смесей и продолжают инкубацию. 48 часов спустя, передача вирусных средств производства из пластины скважин в конические и спина их вниз на 300 г в течение пяти минут.Затем перенесите супернатант в свежие трубки, чтобы выбросить гранулированное мусор. Теперь, немедленно используйте вирусные средства производства для трансдуци целевых клеток или заморозить его при 80 градусах по Цельсию для использования в будущем. Начните с добавления 250 микролитров каждой вирусной конструкции, которая в данном случае состоит из дополнительных плазмидов CLOud9 в 50 миллилитровую коническую трубку, содержащую 80 000 клеток.Затем добавьте достаточно Полибрена так, чтобы он был между одним и восемью микрограммами на миллилитр в растворе. Затем отрегулируйте общий объем в каждой трубке до одного миллилитра с помощью средств массовой информации, свободных от антибиотиков. Теперь, чтобы увеличить контакт между частицами вируса и клетками спина клетки на 800 г в течение 30 минут при комнатной температуре.Затем повторно приостанавливать клетки на супернатанте путем пипетки. Затем загрузите подвеску клеток на пластины культуры и инкубировать их в течение 24 часов. На следующий день соберите клетки.Центрифуга их при температуре 300 г в течение пяти минут при комнатной температуре и повторно приостановить их в нормальной среде. На следующий день добавьте пуромицин и гигромицин в среду, чтобы выбрать для двойной трансуцированных клеток. Соответствующая концентрация антибиотиков должна быть определена заранее для каждого типа клеток.Затем инкубировать ячейки в средствах отбора, по крайней мере три дня, прежде чем приступить к вниз по течению приложений и продолжать поддерживать ячейки и средства отбора. Для затемнения CLOud9 выбранных и трансдуцированных клеток добавить один миллимоляр ABA в культуру блюдо. Для элементов управления добавьте DMSO, а затем поддерживайте ячейки с ABA или DMSO в течение всего эксперимента.Чтобы обратить вспять димеризацию, мыть клетки с достаточным PBS, чтобы покрыть поверхность пластины в два раза. После этого, культурные ячейки в ABA-свободных средств массовой информации, чтобы поддерживать их в неразмертом состоянии. Надлежащее использование системы CLOud9 вызывает обратимый контакт дополнительных конструкций CSA и CSP CLOud9 путем добавления или удаления АБА в средства массовой информации культуры клеток.Конструкции CSA и CSP локализованы в соответствующих геномных регионах с использованием стандартного руководства CRISPR RNAse. Хроматин иммунопреципиентации следуют количественные ПЦР был использован для обеспечения точной локализации в ориентации каждого компонента CLOud9. Дополнительно coimmunoprecipation с и без ABA проверено CSA и CSP dimerization в присутствии ligand также, как reversibility в отсутствии ligand.После димеризации ABA, больший контакт между бета-глобином и LCR был измерен захватом подтверждения хромосомы. Однако этого не наблюдалось в контролях, содержащих либо только КСА, либо только конструкцию CSP. Создание взаимодействия LCR бета-глобина не полностью исключило эндогенный контакт LCR globin.Он только добавил к исходному контакту. Увеличение контактов бета-глобина LCR наблюдалось в течение 72 часов димеризации независимо от точного региона в пределах целевого LCR или бета-глобина промоутер области. Наконец, обратимость системы была подтверждена с захватом подтверждения хромосомы после удаления ABA.Это привело к полному возобновлению эндогенного подтверждения. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы изменить средства массовой информации и добавить свежие затемненные CLOud9 трансдуцированных клеток каждый день. Не забывайте, что работа с лентивирусом может быть чрезвычайно опасной, и все меры предосторожности, используемые в BSL 2, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Genetics

Cell Biology

Anatomy and Physiology

Unit 1

Cells and their Components

Structure and Organization of DNA

SCIENTISTS IN ACTION

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Последовательные соли экстракции для анализа массовых Chromatin привязки свойств Chromatin изменения комплексы

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Анализ промотора c-KIT-лиганда с использованием иммунопреципитации хроматина

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Иммунопреципитация хроматина (ChIP) в линиях Т-клеток мыши

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Поколения родной Chromatin иммунопреципитации секвенирования библиотек для анализа плотности нуклеосома

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Протокол иммунопреципитации (чип) Chromatin для Low изобилие эмбриональных образцов

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Иммунопреципитации Chromatin (чип) изменения гистона от Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

Адаптация гибридизации захвата Chromatin связанных белков для протеомики в клетках млекопитающих

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Иммунопреципитации Chromatin мышиных коричневый жировой ткани

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

ТРИФОСФАТЫ опосредованной редактирование генома человека грибкового патогена Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

Хроматин ИммунопрецитатА Ассасси использованием микрококковой nucleases в клетках млекопитающих

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...