Name: immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry
Uploaded: 2018-10-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry at JoVE.com

الكتاب أود أن أشكر الدكتور جودي باربو-لقراءة وتحرير المخطوطة الحرجة، وأشكر مانويل رالف لتصميم الأعمال الفنية. الكتاب أيضا يود أن يشكر فريق علم الأورام في فيفو ، لجهودها التقنية كبيرة وفريق التاج العلوم البيولوجية الأورام الأورام المناعية "العلامات البيولوجية".

سوف استعرض جميع البروتوكولات وتعديل أو إجراءات تنطوي على الرعاية واستخدام الحيوانات ووافق "التاج العلوم البيولوجية المؤسسية رعاية الحيوانات" واستخدام اللجنة (إياكوك) قبل إجراء الدراسات. رعاية واستخدام الحيوانات عادة ستجري وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية آآلاك (رابطة لتقييم واعتماد رعاي...

<ol>
	<li>Chevrier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Immune+Atlas+of+Clear+Cell+Renal+Cell+Carcinoma.">An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma.</a> Cell. 169 (4), 736-749 (2017).</li><li>Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+immune+responses+in+the+tumor+microenvironment.">Monitoring immune responses in the tumor microenvironment.</a> Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).</li><li>Mosely, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+Selection+of+Syngeneic+Preclinical+Tumor+Models+for+Immunotherapeutic+Drug+Discovery.">Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery.</a> Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).</li><li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+focal+adhesion+kinase+renders+pancreatic+cancers+responsive+to+checkpoint+immunotherapy.">Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy.</a> Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).</li><li>Gunderson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruton+Tyrosine+Kinase-Dependent+Immune+Cell+Cross-talk+Drives+Pancreas+Cancer.">Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer.</a> Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).</li><li>Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+modeling+for+immuno-oncology.">Experimental animal modeling for immuno-oncology.</a> Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).</li><li>Takao, K., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+greatly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).</li><li>Payne, K. J., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-cell+lineage+commitment:+translation+from+mice+to+humans.">Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans.</a> Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>von Herrath, M. G., Nepom, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+translation:+barriers+to+implementing+clinical+immunotherapeutics+for+autoimmunity.">Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity.</a> J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).</li><li>Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+to+evaluate+novel+and+conventional+therapeutic+strategies+for+cancer.">Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer.</a> Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).</li><li>Erdag, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotype+and+immunohistologic+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+are+associated+with+clinical+outcome+in+metastatic+melanoma.">Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma.</a> Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).</li><li>Guti&#233;rrez-Garcia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+and+not+immunophenotypic+algorithms+predicts+prognosis+in+patients+with+diffuse+large+B-cell+lymphoma+treated+with+immunochemotherapy.">Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy.</a> Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).</li><li>Paiva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1/PD-1+presence+in+the+tumor+microenvironment+and+activity+of+PD-1+blockade+in+multiple+myeloma.">PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma.</a> Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).</li><li>Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+nature+of+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice.">Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Landscape+in+Early+Lung+Adenocarcinoma+by+Paired+Single-Cell+Analyses.">Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses.</a> Cell. 169 (4), 750-765 (2017).</li><li>Mahoney, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Antibodies+to+Its+Cytoplasmic+Domain+Most+Clearly+Delineate+Cell+Membranes+in+Immunohistochemical+Staining+of+Tumor+Cells.">PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).</li><li>Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+expression+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+is+a+poor+prognostic+factor+in+patients+with+high+CD8++tumor-infiltrating+lymphocytes:+highly+sensitive+detection+using+phosphor-integrated+dot+staining.">PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining.</a> Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImmunoScore+Signature:+A+Prognostic+and+Predictive+Tool+in+Gastric+Cancer.">ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer.</a> Ann. Surg. , (2016).</li><li>Ribas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+Blockade+Expands+Intratumoral+Memory+T+Cells.">PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).</li></ol>

على الرغم من أن أكثر سهولة تجري دراسات باستخدام اتفاقية استكهولم الأورام، نماذج الأورام أورثوتوبيكالي مزروع يحتمل أن يمكن أكثر صلة بدراسات علم الصيدلة السريرية (لا سيما التحقيقات الإدخال/الإخراج) لتقديم المعزز طواعية. يهدف هذا التقرير إلى مساعدة القراء/الجمهور المهتمين ليتمكن من تصور م?...

أسباب غدية البنكرياس الأقنية (بدك) ما يقرب من نصف مليون حالة وفاة على نطاق عالم سنوياً، واحد من القتلة السرطان أعلى 5. وهناك عدد قليل من الخيارات العلاج الفعال ولا إيمونوثيرابيس المعتمدة؛ ولذلك، تمس الحاجة إليها العلاجات الجديدة. تحظى باعتراف سرطانات متزايد كالأمراض المناعية، بما في ذلك بدك، بالإضافة إلى الأمراض الوراثية المعروفة اليوم. سوف المحتمل أن تحدد العوامل المناعية والوراثية تشخيص المرض، فضلا عن معالجة النتائج. أورام التهرب من مراقبة المضيف المناعية والمضي قدما في نهاية المطاف للتسبب في الموت. تحدث العديد من هذه العمليات المناعية داخل ورم المكروية (TME)1،2،،من34 حيث أنواع مختلفة من الخلايا المناعية تتفاعل مع الخلايا السرطانية، مع بعضها البعض ومع غيرها الورم مكونات stromal، مباشرة أو غير مباشرة عن طريق السيتوكينات التي تحدد في نهاية المطاف نتيجة المرض. ولذلك توصيف مكونات الورم المناعي TME، أو الورم إيمونوفينوتيبينج، بما في ذلك subtyping، والعد، وتعريب الأنساب مختلفة من الخلايا المناعية، أمر بالغ الأهمية لفهم الحصانة المضادة للورم. وفي حالة بدك، فقد اقترح أن مرتفعة الضامة القمعية التسلل إلى الورم (TAM) والخلايا البائية أدت إلى منع تسلل خلايا T و/أو التنشيط، ومستويات عالية من التليف5،6.
نهج مشترك للتحقيق تميس المناعي تجريبيا باستخدام مركب الأورام السريري نماذج حيوانية، والورم الماوس ذات الصلة أساسا نماذج7، لا سيما الماوس سينجينيك (هوموجرافت) أو نماذج الماوس المهندسة وراثيا (جيمم) من أمراض السرطان، في تشابه المفترضة للماوس والإنسان للأورام وحصانة8،9. ومن المفهوم في الواقع أن هناك اختلافات المتأصلة بين نوعين من أنواع10،11.
أورام الماوس زرع لها مزايا تشغيلية كبيرة أكثر أورام عفوية7، إلا وهي التنمية الورم متزامنة، على النقيض من وضع الورم عفوية جيم الأبوية. تعتبر هوموجرافتس أورام مورين عفوية الأورام الأولية وجود قط التلاعب في المختبر، والنسخ المتطابق الأصلي الماوس الورم histo-/الجزيئية الباثولوجيا7، فضلا عن ملامح محصنة ممكن. وكثيراً ما تعتبر هذه هوموجرافتس مورين "إصدار ماوس من تكثيفها المستمدة من المريض (بدكسس)". ولذلك لديهم احتمالاً طواعية أفضل من الخلية سينجينيك التقليدية المستمدة من خط الماوس الأورام12. على وجه الخصوص، هوموجرافتس كثيرة مستمدة من جيم محددة حيث تم تصميم آليات محددة من الأمراض البشرية، مثل الطفرات النمطان السائق، ولذلك ينبغي أن هوموجرافتس هذه المزايا لأهميتها السريرية. على وجه الخصوص، جيم فيلق حماية كوسوفو وضع الماوس بدك ضمن 15 – 20 أسبوعا عمر، الذي يلخص شكلياً الأمراض البشرية مع بنية غدي جيدا-باعتدال-متباينة يغلب عليها الطابع والتخصيب سدى. ويجمل هذا النموذج أيضا السمات الوراثية الأكثر شيوعاً للبشرية بداك، هما كراس تفعيل P53 الخسارة من وظيفة، والطفرات التي تحدث في 90% و 75% من البشرية بداك، على التوالي5،6.
مواقع لزرع الأعضاء اقترح أيضا أن تلعب دوراً في نموذج طواعية. البيئة الأنسجة المحيطة محددة، مثل بيئة أورثوتوبيك مقابلة، يمكن أن تكون مكاناً للأورام المحددة إلى البيئات التقدم، بدلاً من موحدة تحت الجلد (SC) للأورام شيوعاً زرع. وسيكون من مصلحة خاصة إذا، و/أو، ما هو الفرق القائم بين موقعين الزرع، من حيث المناعة-المكروية، وأهمية بالنسبة للسرطان البشري، على سبيل المثال. وفي حالة بدك.
أحد الجوانب الأكثر أهمية للتنميط المناعي، أو إيمونوفينوتيبينج، تحديد التسلل إلى ورم الخلايا المناعية الأنساب المختلفة، الأرقام، النسبة المئوية النسبية داخل الأورام، فضلا عن تفعيل الدول والمواقع. وهذا يشمل ليمفوكتييس ورم-إينفيلتراتراتينج (تيلس، سواء من تي-وب-)، التسلل إلى الورم الضامة (تامس) والتسلل إلى ورم الخلايا القاتلة الطبيعية (NKs) والورم المقيم الجذعية الخلايا3،،من1314 , 15 , 16 , 17، والتعريب سوبسيلولار بعض الخلايا18،،من1920، إلخ. الأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) أو التدفق الخلوي هو تقنية الكشف عن خلية واحدة يستخدم عادة لقياس بارامترات خلية محددة. متعدد الألوان التدفق الخلوي تدابير عدة علامات على4،3،خلية مفردة21 وهو الأسلوب الأكثر شيوعاً لتحديد النسبة المئوية النسبية لمجموعات فرعية مختلفة من الخلايا المناعية، والأرقام بما في ذلك داخل الأورام.
ويصف هذا التقرير إجراءات للتنميط التسلل إلى ورم الخلايا المناعية: 1) غرس أورثوتوبيك بدك الماوس الورم هوموجرافتس، جنبا إلى جنب مع غرس اتفاقية استكهولم؛ 2) ورم الأنسجة الحصاد وإعداد خلية مفردة عبر الورم الانفصال؛ 3) التدفق الخلوي تحليل كافة الخلايا المستمدة من الأورام كخط أساس؛ 4) مقارنة بين الملامح الأساس لكلا النهجين الزرع.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine</td>
			<td>\</td>
			<td>SAS3119</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trocar 20</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>2mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotic and antimycotic</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Air chemical</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood</td>
			<td>AIRTECH</td>
			<td>BSC-1300IIA2</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibodies</td>
			<td>BD</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration</td>
			<td>BD</td>
			<td>354248</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffers</td>
			<td>BD</td>
			<td>554656</td>
			<td>Mincing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Staining Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>563794</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td>553142</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell filters</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>70&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>routine blood tube</td>
			<td>BD-Vacutainer</td>
			<td>365974</td>
			<td>2mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>vs 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3 Fix/Perm kit</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810R,5920R</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td>\</td>
			<td>vs 10.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable, sterile scalpels</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J12100</td>
			<td>11#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife handle</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J11010</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>Y00030</td>
			<td>Eye scissors 10cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>JD1060</td>
			<td>Eye tweezers 10cm with teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable liquid nitrogen tank</td>
			<td>Jinfeng</td>
			<td>YDS-175-216</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Metter Toledo</td>
			<td>AL204</td>
			<td>0-100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi C-tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi Gentle MACS with heater blocks</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-018-306</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryopreservation tube</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME</td>
			<td>PathClear</td>
			<td>3442-005-01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringes</td>
			<td>Shanghai MIWA medical industry</td>
			<td>\</td>
			<td>1-5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog software</td>
			<td>Studylog</td>
			<td>\</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Balance and supporting USB</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>SE601F</td>
			<td>Balance and supporting USB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Data line of vernier calipers</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>926.6721</td>
			<td>Data line of vernier calipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>910.1502.10</td>
			<td>Sylvac S-Cal pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339653</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339651</td>
			<td>15mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>KLCS-288</td>
			<td>4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PLF-276</td>
			<td>&#8212;20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>DW-862626</td>
			<td>&#8212;80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>am7021</td>
			<td>\</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry

الأورام هوموجرافت (سينجينيك) هي العمود الفقري للبحوث السريرية المناعية-الأورام (الإدخال/الإخراج) اليوم. وورم المكروية (TME)، وبخاصة جهاز المناعة-مكوناته، أمر حيوي للتكهن والتنبؤ بنتائج العلاج، لا سيما تلك التي المناعي. TME المناعة-مكونات تتألف من مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا المناعية التسلل إلى الورم قابلاً بنظام مراقبة الأصول الميدانية متعدد الألوان. البنكرياس الأقنية غدية (بدك) من بين ماليجنانسيس الأكثر دموية التي تفتقر إلى خيارات العلاج الجيد، وبالتالي حاجة طبية ملحة والتي لم تلب بعد. وكان أحد الأسباب الهامة لعدم استجابته للعلاجات المختلفة (الكيماوي-، استهدفت، الإدخال/الإخراج) به TME وفيرة، تتكون من الخلايا الليفية والكريات البيضاء التي تحمي الخلايا السرطانية من هذه العلاجات. أورثوتوبيكالي بداك مزروع ويعتقد أن أكثر دقة استعادة TME سرطان البنكرياس البشرية من النماذج التقليدية (SC) تحت الجلد.
الأورام هوموجرافت (KPC) يتم زرع بالماوس عفوية بداك تنشأ من مؤسسة البترول الكويتية-الفئران المهندسة وراثيا (rasكG12D/+//Pdx1-53-/-فجإعادة) (الفيلق-جيمم). الأنسجة الورم الرئيسي هو مقطعة إلى أجزاء صغيرة (~ 2 مم3) وزرعها تحت الجلد (SC) إلى المستلمين سينجينيك (C57BL/6، 7 – 9 أسابيع من العمر). هوموجرافتس كانت في ذلك الحين جراحيا أورثوتوبيكالي زرعها على بنكرياس الفئران C57BL/6 الجديدة، جنبا إلى جنب مع اتفاقية استكهولم-غرس، الذي بلغ حجم الورم 300 – 1,000 ملم3 قبل 17 يوما. تحصد كل إجراء تشريح الجثة المعتمدة فقط من الأورام من 400 – 600 ملم3 وتنظيف لإزالة أنسجة الورم غير متجاورة. أنها تم فصلها كل بروتوكول استخدام ديسوسياتور أنسجة في تعليق خلية واحدة، تليها تلطيخ مع فريقي المعين المسمى فلوريسسينتلي الأجسام المضادة لعلامات مختلفة للخلايا المناعية المختلفة (اللمفاوية، النقوي ومن ناغورني كاراباخ، وحدات تحكم المجال Dc). تم تحليل عينات ملطخة باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية متعدد الألوان لتحديد عدد الخلايا المناعية الأنساب المختلفة، فضلا عن النسبة المئوية النسبية داخل الأورام. ثم قورنت لمحات محصنة من الأورام أورثوتوبيك لتلك الأورام اتفاقية استكهولم. أظهرت البيانات الأولية تيلس/تامس المتسللة مرتفعة إلى حد كبير في أورام البنكرياس، وأعلى ب-خلية تسلل إلى أورثوتوبيك بدلاً من الأورام اتفاقية استكهولم.

غرس أورثوتوبيك بدك أدى إلى نمو الورم السريع مشابهة للتي ينظر إليها لغرس اتفاقية استكهولم. بعد أن تم زرع أجزاء الورم المانحين في الفئران المستفيدة، سواء تحت الجلد وأورثوتوبيكالي وفقا للبروتوكولات هو موضح في الخطوات 2.1 و 2.2، والأورام homograft فيلق حماية كوسوفو مزروع أظهر النم...

Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry at JoVE.com

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

ويهدف الإجراء التجريبي في إيمونوفينوتيبينج هوموجرافتس بدك أورثوتوبيك مورين التنميط وورم المكروية-المناعية. الأورام أورثوتوبيكالي مزروع عن طريق الجراحة. أورام من 200 – 600 مم3 في حجم حصاد وفصلها بإعداد تعليق خلية واحدة، متبوعاً بعلامة متعددة محصنة ضد نظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل باستخدام الأجسام المضادة المختلفة المسمى فلوريسسينتلي.

إيمونوفينوتيبينج من أورثوتوبيك هوموجرافت (سينجينيك) من الفيلق الابتدائي موريني البنكرياس الأقنية غدية بالتدفق الخلوي

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

يمكن أن تساعد هذه الرسالة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في النماذج المناعية في النماذج مورين، مثل العلامات المستخدمة لتحديد أنساب مناعة مختلفة واستراتيجيات الشيخوخة. الفائدة الرئيسية لهذه التقنية هو أن علامة و stategies الشيخوخة، عندما immunoenotyping، يمكن أن تنطبق على مجموعة متنوعة من نماذج مورين. مراقبة وزن الجسم من C57 الأسود 6 الفئران باستخدام التوازن.أيضا، رصد حجم الورم من الفئران المانحة متفاوتة الورم حسب قياس العيار. بعد القتل الرحيم من الحيوان في غطاء محرك السيارة الخطر الحيوي وفقا للبروتوكول، تعقيم الجلد حول الورم باستخدام مسحات يودوفور. بعد إزالة الورم الجراحي كما هو مفصل في بروتوكول النص ، ضع الورم في طبق بتري يحتوي على 20 ملليلتر من PBS الذي تم تبريده مسبقًا إلى 4 درجات مئوية.إذا كان هناك تلوث الدم، ونقل الورم إلى طبق بيتري آخر وغسل الورم مع برنامج تلفزيوني. قطع الورم إلى نصفين. إزالة أي الجلد اضافية، والأوعية، والتكلس، ونخر.اختيار قطعة سليمة فقط من الورم ووضعها في أنبوب جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر معقمة. أضف 20 ملليلتر من PBS قبل نقل أنبوب إلى غرفة حيوانية منفصلة لدراسات علم الصيدلة. للتحضير لزراعة العظام، قم بإصلاح ماوس تخدير كامل على لوحة تجارب في الوضع الجانبي الأيمن.تطهير الجلد حول الطحال مع اليود ومن ثم دي iodinate مع 75٪ من الكحول الإيثيل. العثور على نقطة وسيطة من الطحال وجعل شق عمودي 1 سنتيمتر على البطن لفضح الطحال. بلطف، ارسم جزءًا من أنسجة البنكرياس تحت الطحال باستخدام ملاقط طرف مسطح.وsutro الماوس قطعة ورم هوموجرافت من الماوس C على البنكرياس من الماوس المتلقي من قبل خياطة الجراحية 9-O bsorbable. أغلق البطن بخياطة حريرية من 6 إلى 6 O بواسطة خط التماس المزدوج. تحقيق التوازن عن طريق الضغط.بعد الانتهاء من زرع الورم، والحفاظ على الحيوان في قفص دافئ طالما لا يحدث أي نزيف أو تسرب أنسجة الورم. مراقبة الحيوان حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على إعادة شغل القص. إعادة الحيوان إلى غرفة الحيوان بعد الشفاء التام من التخدير.مراقبة الورم الفئران متفاوتة عن طريق تجا ة البطن بالقرب من الطحال واختيار الفئران التي تحمل أورام العظام. لكل ورم، إعداد أنبوب C واحد مع العازلة هضم الورم. استخدام 3 ملليلتر من عازلة الهضم لشظايا الورم أقل من 0.8 غرام لضمان هضم الورم تماما.تسمية الورم مع رمز الدراسة, ورم, معرف الماوس, مجموعة العلاج, ووصم الورم. جمع الورم من الماوس. اغسل الورم في برنامج تلفزيوني بارد وانظف الأنسجة التي تعلق على الورم.وضع الورم في وسائل الإعلام الهضم في بئر واحد من لوحة 6-جيدا عقيمة. عقد الورم في مكان مع ملاقط معقمة أو ملقط وشريحة مع مشرط. شريحة الورم جيدا بما فيه الكفاية لكسر إلى قطع أصغر.الآن، ضع قطع الورم مرة أخرى في أنبوب C واستخدم المخزن المؤقت المتبقي للهضم لغسل الطبق. نقل السائل في أنبوب سي ووضعها على الجليد حتى الهضم. ثم التبديل على الفصام مع سخانات.وضع الورم تفكك C-أنبوب رأسا على عقب في كم من المنصب الشاغر. ضبط حالة وضع الأنبوب من حر إلى محدد. اختيار برنامج فصل متبوعاً بتحديد المجلد المطلوب حيث يتم عرض قائمة البرنامج.بعد إنهاء البرنامج، واتخاذ جيم أنبوب قبالة الفصام وتدور لفترة وجيزة إلى البليت العينة. الآن، إعادة تعليق العينات ووضعها في مصفاة الخلية فوق أنبوب 50 ملليلتر. اغسل الخلية من خلال مصفاة الخلايا بـ 10 ملليلتر من مخزن الغسيل لتوفير تعليق خلية واحدة.بعد أنبوب الطرد المركزي في 300 G لمدة 5 دقائق، والتخلص من عظمى وإعادة تعليق الخلايا مع 5 ملليلتر من العازلة الغسيل. عد الخلايا القابلة للحياة وضبط تركيز الخلايا إلى 1 مليون خلية لكل أنبوب أو لكل عينة. تنفيذ تصميم لوحة مناعية، والمناعة وفلوريسنس ناقص عنصر تحكم واحد كتفاصيل في بروتوكول النص.إعداد الخرز UltraComp في حين أن أدوات تدفق الاحماء من قبل دوامة لهم جيدا قبل الاستخدام. تسمية منفصلة 12 × 75 ملليمتر عينة أنبوب لكل فلوروتشرومات الأجسام المضادة مترافق. إضافة 100 ميكرولتر من البقع العازلة إلى كل أنبوب تليها قطرة واحدة كاملة من الخرز.إضافة الأجسام المضادة وتنفيذ الإجراء تلطيخ كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم إضافة 0.5 ملليلتر من مخزن البقع إلى كل بيليه حبة وإعادة تعليق تماما عبر دوامة. الآن، تعيين تدفق الجهد PMT قياس الانبعاثات في الأنسجة المستهدفة للتجربة معينة.تشغيل العينة من خلال عينة من خلال عملية استئصال التدفق من أجل الحصول على البيانات من خلال كسب على السكان حبة المفرد في مبعثر إلى الأمام و الجانب قراءات مبعثر. تعيين معدل التدفق حول 200 إلى 300 الأحداث في الثانية الواحدة. تعيين التعويض المناسب للأجسام المضادة الاقتران الفلوريسين فيتC معين باستخدام مؤامرة FL1 مقابل FL1 نقطة.ضع بوابة رباعية بحيث تكون الخرزات السلبية داخل الربع السفلي الأيسر والخرز الإيجابي داخل الربع الأيمن العلوي أو السفلي. ضبط قيم التعويض حتى تكون كثافة الفلورسين المتوسط لكل مجموعة متساوية تقريباً. كرر هذه الخطوات لجميع الأنابيب.الآن، المضي قدما في الحصول على عينات البقع الفعلية. قم بتشغيل معالج التعويض واحفظ الإعداد بالتنسيق: التاريخ والتجربة والأحرف الأولى. أدى زرع العظام من غدية القناة البنكرياسية في نمو الورم السريع مماثلة لتلك التي شوهدت في زرع تحت الجلد.يتم عرض صور التلطيخ التمثيلية للهماتيوكسيلين واليوسين وإظهار نمو مماثل للزراعة تحت الجلد والعظام. تم الحصول على غلة خلايا قابلة للحياة عالية بشكل معقول من عينة الورم من كلا النوعين من الزرع. يظهر splat ممثل FACS خلايا قابلة للحياة من الورم المنفصل عن الخلايا الميتة ومخلفات الخلايا.يظهر هنا، هو ورم يتسلل إلى مقارنة ملف المناعة بين مجموعات الخلايا الرئيسية والبسطية للعديد من المجموعات الفرعية الرئيسية للخلايا المناعية للورم. يتم عرض تحت الجلد مقابل homograft تقويم العظام من سرطان البنكرياس. البيانات تظهر بوضوح أن الورم قد يزيد بشكل كبير من تسرب الخلايا المناعية بالمقارنة مع البنكرياس من الفئران السليمة.بالإضافة إلى ذلك، تم العثور على نسب مئوية مختلفة من الورم الذي يتسلل إلى مجموعات فرعية من الخلايا المناعية في التوامُع العظمي مقابل التواهم تحت الجلد. على سبيل المثال، هناك خلايا B في تقويم العظام أكثر بكثير من الخلايا تحت الجلد. أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر لإعداد جميع المواد والكواشف المرتبطة بها مقدما.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تحليل FACS لنماذج مورين.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

فلوري مثلي نموذج الفأر من سرطان البنكرياس

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

نموذج الفأر من التعب المستحث بواسطة الطرفية تشعيع

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

نموذج سرطان البنكرياس سينجينيك ماوس دراسة آثار انهانسر لا رجعة فيه

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

نموذج أورثوتوبيك طرحه ونيون مورين سينجينيك المعتمدة على الاندروجين والاخصاء مقاومة سرطان البروستاتا

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

أورثوتوبيك زرع الخلايا غدية الرئة سينجينيك لدراسة التعبير PD-L1

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

محاكاة والتلاعب في البنكرياس حؤول Acinar للأقنية في ثقافة الخلية 3 الأبعاد

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

العزلة وتوصيف المرضي المستمدة من البنكرياس اقنيه الغدد السرطانية الأورام العضوية

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

الموجات فوق الصوتية غرس العظام البنكرياس الاقنيه اللحمية

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

عزل السوائل القريبة للتحقيق في البيئة الدقيقة للورم من سرطان البنكرياس الغدي

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

نموذج الماوس استئصال العظام لسرطان البنكرياس

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...