Name: immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry
Uploaded: 2018-10-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Dr. Jody Barbeau - kritisk læsning og redigering af håndskriftet, og takke Ralph Manuel for at designe kunstværker. Forfatterne vil også gerne takke Crown Bioscience onkologi Immuno-onkologi biomarkør team og onkologi In Vivo team, for deres store tekniske indsats.

Alle protokoller og tillægsaftaler eller procedurer, der involverer pleje og brug af dyr bliver gennemgået og godkendt af Crown Bioscience institutionelle dyrs pleje og bruge udvalg (IACUC) før gennemførelsen af undersøgelser. Pleje og brug af dyr vil normalt blive udført i overensstemmelse med internationale retningslinjer for AAALAC (Foreningen for evaluering og akkreditering af Laboratory Animal Care), som rapporteret i vejledningen for pleje og brug af forsøgsdyr, nationale forskning Rådet (2011). Alle dyr ek...

<ol>
	<li>Chevrier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Immune+Atlas+of+Clear+Cell+Renal+Cell+Carcinoma.">An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma.</a> Cell. 169 (4), 736-749 (2017).</li><li>Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+immune+responses+in+the+tumor+microenvironment.">Monitoring immune responses in the tumor microenvironment.</a> Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).</li><li>Mosely, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+Selection+of+Syngeneic+Preclinical+Tumor+Models+for+Immunotherapeutic+Drug+Discovery.">Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery.</a> Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).</li><li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+focal+adhesion+kinase+renders+pancreatic+cancers+responsive+to+checkpoint+immunotherapy.">Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy.</a> Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).</li><li>Gunderson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruton+Tyrosine+Kinase-Dependent+Immune+Cell+Cross-talk+Drives+Pancreas+Cancer.">Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer.</a> Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).</li><li>Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+modeling+for+immuno-oncology.">Experimental animal modeling for immuno-oncology.</a> Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).</li><li>Takao, K., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+greatly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).</li><li>Payne, K. J., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-cell+lineage+commitment:+translation+from+mice+to+humans.">Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans.</a> Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>von Herrath, M. G., Nepom, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+translation:+barriers+to+implementing+clinical+immunotherapeutics+for+autoimmunity.">Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity.</a> J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).</li><li>Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+to+evaluate+novel+and+conventional+therapeutic+strategies+for+cancer.">Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer.</a> Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).</li><li>Erdag, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotype+and+immunohistologic+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+are+associated+with+clinical+outcome+in+metastatic+melanoma.">Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma.</a> Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).</li><li>Guti&#233;rrez-Garcia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+and+not+immunophenotypic+algorithms+predicts+prognosis+in+patients+with+diffuse+large+B-cell+lymphoma+treated+with+immunochemotherapy.">Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy.</a> Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).</li><li>Paiva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1/PD-1+presence+in+the+tumor+microenvironment+and+activity+of+PD-1+blockade+in+multiple+myeloma.">PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma.</a> Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).</li><li>Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+nature+of+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice.">Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Landscape+in+Early+Lung+Adenocarcinoma+by+Paired+Single-Cell+Analyses.">Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses.</a> Cell. 169 (4), 750-765 (2017).</li><li>Mahoney, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Antibodies+to+Its+Cytoplasmic+Domain+Most+Clearly+Delineate+Cell+Membranes+in+Immunohistochemical+Staining+of+Tumor+Cells.">PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).</li><li>Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+expression+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+is+a+poor+prognostic+factor+in+patients+with+high+CD8++tumor-infiltrating+lymphocytes:+highly+sensitive+detection+using+phosphor-integrated+dot+staining.">PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining.</a> Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImmunoScore+Signature:+A+Prognostic+and+Predictive+Tool+in+Gastric+Cancer.">ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer.</a> Ann. Surg. , (2016).</li><li>Ribas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+Blockade+Expands+Intratumoral+Memory+T+Cells.">PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).</li></ol>

Selv om undersøgelser ved hjælp af SC tumorer er mere let udført, orthotopically implanteret tumorer modeller kan potentielt være mere relevante for prækliniske farmakologiske undersøgelser (især I/O undersøgelser) at give øget translatability. Denne betænkning sigter mod at hjælpe interesserede læsere/publikum til at være i stand til direkte visualisere de tekniske procedurer, der kan bruges i deres respektive forskning. Vores protokoller viser denne orthotopic implantation af PDAC kan resultere i effektiv ...

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) forårsager næsten halvdelen en million dødelighed over hele verden hvert år, en af top 5 cancer killers. Der er nogle effektive behandlingsmuligheder og ingen godkendte immunoterapi; Derfor er der desperat behov for nye behandlinger. Kræft er i stigende grad bliver anerkendt som immunologiske sygdomme, herunder PDAC, ud over de genetiske sygdomme, som i dag. Immunologiske og genetiske faktorer ville sandsynligvis bestemme sygdommen prognosen samt behandling resultater. Tumorer unddrage vært immun overvågning og i sidste ende fremme for at forårsage død. Mange af disse immune processer forekomme inden for tumor mikromiljø (TME)1,2,3,4 hvor forskellige typer af immunceller interagere med tumorceller, med hinanden og med andre tumor stromale komponenter, direkte eller indirekte via cytokiner, som i sidste ende bestemme sygdom resultat. Karakterisering af tumor immunkomponenter TME, og tumor Immunofænotypning, herunder subtyping, nummerering og lokalisering af forskellige slægter af immunceller, er derfor afgørende for at forstå anti-tumor immunitet. I forbindelse med PDAC, det er blevet foreslået at forhøjet tumor infiltrerer smittespredningshæmmende makrofager (TAM) og B-celler har ført til forebyggelse af T-celle infiltration og/eller aktivering og høje niveauer af fibrose5,6.
Den fælles tilgang at undersøge immun TMEs eksperimentelt ville bruge surrogat tumor prækliniske dyremodeller, hovedsageligt relevante mus tumor modeller7, især mus syngeneic (homograft) eller genetisk modificerede musemodeller (CLAUSS) af kræft, på den formodede lighed af mus og mennesker for tumorer og immunitet8,9. Det er forstået i virkeligheden, at der er iboende forskelle mellem to arter10,11.
Transplanterede mus tumorer har betydelige driftsmæssige fordele over spontane tumorer7, nemlig synkroniserede tumor udvikling i modsætning til forældrenes CLAUSS spontan tumor udvikling. Homografts af spontan murine tumorer betragtes som primære tumorer har aldrig været manipuleret i in vitro, og spejling oprindelige mus tumor Histò- / Molekylær Patologi7, samt mulige immun profiler. Disse murine homografts er ofte anset for at være "en mus version af patient-afledte xenografts (PDXs)". De har derfor sandsynligvis en bedre translatability end konventionelle syngeneic cell line-afledte mus tumorer12. Især er mange homografts afledt af specifikke CLAUSS hvor specifikke menneskelige sygdomsmekanismer, fx muterede driver mutationer, er manipuleret, og disse homografts bør derfor have fordele til deres kliniske relevans. Især udvikle KPC GEMM mus PDAC inden for 15 – 20 ugers-alderen, som morfologisk sammenfatter menneskelige sygdommen med overvejende godt - til moderat-opdelte glandulær arkitektur og højt beriget stroma. Denne model indeholder også de mest almindelige genetiske egenskaber i menneskets PDAC, nemlig Kras aktivering mutation og P53 tab af funktion, som forekommer i 90% og 75% af menneskelig PDAC, henholdsvis5,6.
Lokaliteter af transplantation er også blevet foreslået til at spille en rolle i model translatability. Det specifikke omkringliggende væv miljø, som en tilsvarende orthotopic miljø, kunne være en niche for specifikke tumorer til fremskridt, i modsætning til den ensartede subkutan (SC) miljøer for almindeligt transplanterede tumorer. Det ville være af særlig interesse, hvis og/eller, hvad forskel der findes mellem de to transplantation sites, immun-mikromiljø og relevans for menneskers kræft, fx. i forbindelse med PDAC.
En af de vigtigste aspekter af immun profilering, eller Immunofænotypning, er at bestemme tumor infiltrerer immunceller af forskellige slægter, tal, relative procentdel i tumorer, samt deres aktivering stater og steder. Dette omfatter tumor-infiltratrating lymphoctyes (TILs, både T- og B-), tumor infiltrerer makrofager (TAMs), tumor infiltrerer naturlige dræberceller (NKs) og tumor-resident dendritiske celler3,13,14 , 15 , 16 , 17, og subcellulært lokaliseringen af visse celler18,19,20, osv. Fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) eller flow flowcytometri er en enkelt celle detection teknologi, der er almindeligt anvendt til at måle de specifikke parametre for en celle. Multi-farve flow flowcytometri foranstaltninger flere markører på en enkelt celle3,4,21 og er den mest anvendte metode til at bestemme de tal og relative procentdel af forskellige delmængder af immunceller, herunder dem, inden tumorer.
Denne rapport beskriver procedurer for profilering tumor infiltrerer immunceller: 1) Implantation af orthotopic PDAC mus tumor homografts, sammen med SC implantation; 2) tumor væv høst og enkelt celle forberedelse via tumor dissociation; 3) flow flowcytometri analyse af alle de celler, der stammer fra tumorer som en baseline; 4) sammenligning af baseline profiler af både transplantation tilgange.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine</td>
			<td>\</td>
			<td>SAS3119</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trocar 20</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>2mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotic and antimycotic</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Air chemical</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood</td>
			<td>AIRTECH</td>
			<td>BSC-1300IIA2</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibodies</td>
			<td>BD</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration</td>
			<td>BD</td>
			<td>354248</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffers</td>
			<td>BD</td>
			<td>554656</td>
			<td>Mincing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Staining Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>563794</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td>553142</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell filters</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>70&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>routine blood tube</td>
			<td>BD-Vacutainer</td>
			<td>365974</td>
			<td>2mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>vs 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3 Fix/Perm kit</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810R,5920R</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td>\</td>
			<td>vs 10.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable, sterile scalpels</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J12100</td>
			<td>11#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife handle</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J11010</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>Y00030</td>
			<td>Eye scissors 10cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>JD1060</td>
			<td>Eye tweezers 10cm with teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable liquid nitrogen tank</td>
			<td>Jinfeng</td>
			<td>YDS-175-216</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Metter Toledo</td>
			<td>AL204</td>
			<td>0-100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi C-tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi Gentle MACS with heater blocks</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-018-306</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryopreservation tube</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME</td>
			<td>PathClear</td>
			<td>3442-005-01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringes</td>
			<td>Shanghai MIWA medical industry</td>
			<td>\</td>
			<td>1-5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog software</td>
			<td>Studylog</td>
			<td>\</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Balance and supporting USB</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>SE601F</td>
			<td>Balance and supporting USB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Data line of vernier calipers</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>926.6721</td>
			<td>Data line of vernier calipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>910.1502.10</td>
			<td>Sylvac S-Cal pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339653</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339651</td>
			<td>15mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>KLCS-288</td>
			<td>4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PLF-276</td>
			<td>&#8212;20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>DW-862626</td>
			<td>&#8212;80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>am7021</td>
			<td>\</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry

Homograft (syngeneic) tumorer er arbejdshest af dagens immuno-onkologi (I/O) prækliniske forskning. Tumor mikromiljø (TME), især dens immun-komponenter, er afgørende for de prognose og forudsigelse af behandlingsresultater, især dem af immunterapi. TME immun-komponenter er sammensat af forskellige delgrupper af tumor infiltrerer immunceller vurderbare af multi-farve FACS. Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er blandt de dødeligste malignances mangler gode behandlingsmuligheder, således et presserende og udækket medicinsk behov. En vigtig årsag til dens ikke reaktionsevne på forskellige behandlinger (kemo-, målrettet, I/O) har været sin rigelige TME, bestående af fibroblaster og leukocytter, der beskytter tumorceller fra disse behandlinger. Orthotopically implanterede PDAC menes at mere præcist generobre TME af menneskelige pancreascancer end konventionelle subkutan (SC) modeller.
Homograft tumorer (KPC) er transplantationer af musen spontane PDAC stammer fra gensplejsede KPC-mus (KrasG12D / +/P53- / -/Pdx1-Cre) (KPC-CLAUSS). Den primære tumor væv er skåret i små fragmenter (~ 2 mm3) og transplanteret subkutant (SC) til de syngeneic modtagere (C57BL/6, 7-9 uger gammel). Homografts blev derefter kirurgisk orthotopically transplanteret ind på bugspytkirtlen af nye C57BL/6 mus, sammen med SC-implantation, som nåede tumor mængder af 300 – 1.000 mm3 af 17 dage. Kun tumorer af 400-600 mm3 blev høstet pr. godkendt obduktion procedure og renses for at fjerne de tilstødende ikke-tumor væv. De var dissocieres per protokol ved hjælp af en væv dissociator i én celle suspensioner, efterfulgt af farvning med udpegede paneler af fluorescently mærket antistoffer til forskellige markører for forskellige immunceller (lymfoid, myeloid og NK, DCs). De farvede prøver blev analyseret ved hjælp af multi-farve FACS til at bestemme antallet af immunceller af forskellige slægter, som deres relative procentdel i tumorer. De immun profiler af orthotopic tumorer blev derefter sammenlignet med dem af SC tumorer. Den foreløbige data demonstreret betydeligt forhøjet infiltrerer TILs/TAMs i tumorer i bugspytkirtlen, og højere B-celle infiltration i orthotopic i stedet for SC tumorer.

Orthotopic implantation af PDAC resulterede i hurtige tumorvækst svarende til den, set for SC implantation. Når donor tumor fragmenter blev implanteret i modtagerens mus, både subkutant og orthotopically efter protokoller er beskrevet i trin 2.1 og 2.2, indopererede KPC homograft tumorer viste lignende hurtige vækst, som vist i figur 1A . KPC homograft tumorer høstet på forskellige tidspunkter er vist i figur 1B og repræse...

Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry at JoVE.com

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Forsøgsmetoden på Immunofænotypning af murine orthotopic PDAC homografts sigter profilering tumor immuno-mikromiljø. Tumorer er orthotopically implanteret via kirurgi. Tumorer i 200-600 mm3 i størrelse blev høstet og adskilles for at forberede encellede suspensioner, efterfulgt af flere immun markør FACS analyse ved hjælp af forskellige fluorescently-mærket antistoffer.

Immunofænotypning af Orthotopic Homograft (Syngeneic) af Murine primære KPC pancreas duktalt adenokarcinom ved flowcytometri

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Denne meddelelse kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i Immunophenotyping i Murine modeller, såsom markører bruges til at identificere forskellige immunitet slægter og aldring strategier. Den største fordel ved denne teknik er, at markør og aldring stategies, når immunophenotyping, kan gælde for en række murine modeller. Overvåg kropsvægten på C57 Black 6 mus ved hjælp af en balance.Også, overvåge tumor volumen af tumor varierende donor mus ved kaliber måling. Efter dødshjælp af dyret i en biologisk hætte som pr protokol, sterilisere huden omkring tumoren ved hjælp af Iodophor svaberprøver. Efter kirurgisk fjernelse af tumoren som beskrevet i tekstprotokollen, placere tumor i en petriskål, der indeholder 20 milliliter PBS, der er blevet forkølet til 4 grader Celsius.Hvis der er forurenende blod, overføre tumoren i en anden petriskål og vaske tumor med PBS. Skær tumoren i halve. Fjern eventuel ekstra hud, kar, forkalkning og nekrose.Vælg kun intakte stykker tumor og læg dem i et sterilt 50 milliliter centrifugerør. Tilsæt 20 milliliter PBS, før rør transporteres til et separat dyrerum til farmakologiske undersøgelser. For at forberede sig til ortopisk implantation, fastsætte en fuldt bedøvende mus på et eksperiment bord i den rigtige laterale position.Desinficere huden omkring milten med idodin og derefter afdodinate med 75% ethylalkohol. Find medianpunktet af milten og gøre en 1 centimeter lodret snit på maven til at udsætte milten. Forsigtigt trække en del af bugspytkirtlen væv under milten ved hjælp af flad spids pincet.Og sutro mus homograft tumor stykke fra C musen på bugspytkirtlen af modtageren musen ved 9-O bsorbable kirurgisk sutur. Luk maven med en 6-O silke sutur af dobbelt søm. Opnå homøostase ved kompression.Efter endt tumor implantation, holde dyret i et varmt bur, så længe ingen blødning eller tumorvæv lækage opstår. Overvåg dyret, indtil de genvinder tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal recumbency. Returner dyret til dyrerummet efter fuld helbredelse fra anæstesi.Overvåge tumor varierende mus ved palpating maven nær milten og udvælge mus forsynet med ortopiske tumorer. For hver tumor, forberede en C-rør med tumor fordøjelse buffer. Brug 3 milliliter fordøjelsesbuffer for tumorfragmenter mindre end 0,8 gram for at sikre, at tumoren er fuldt fordøjet.Mærke tumor med undersøgelsen kode, tumor, muse-id, behandling gruppe, og tumor vægt. Indsamle tumor fra musen. Vask tumoren i koldt PBS og rense ud væv knyttet på tumoren.Placer tumor i fordøjelsesmedier i en brønd af en steril 6-brønd plade. Hold tumoren på plads med sterile pincet eller pincet og skær med en skalpel. Skær tumoren godt nok til at bryde i mindre stykker.Nu, placere tumor stykker tilbage i C-rør og bruge de resterende fordøjelse buffer til at vaske pladen. Overfør væsken ind i C-røret og læg den på is, indtil du fordøjelsen. Tænd derefter dissociatoren med varmeapparater.Placer tumor dissociation C-rør på hovedet i ærmet på den ledige position. Juster status for rørpositionen fra Fri til Udvalgt. Vælg et dissociationsprogram, der skal følges af valget af den ønskede mappe, hvor listen over programmer vises.Efter programmets afslutning udtages C-røret af dissociatoren, og der drejes kortvarigt om til pallen af prøven. Nu, re-suspendere prøverne og læg dem i en celle si over en 50 milliliter rør. Vask cellen gennem cellestingen med 10 milliliter vaskebuffer for at give en enkelt cellesuspension.Efter centrifugeringsrøret ved 300 G i 5 minutter kasseres supernatanten, og cellerne suspenderes igen med en 5 milliliter vaskepude. Tæl levedygtige celler, og juster cellekoncentrationen til 1 million celler pr. rør eller pr. prøve. Udfør immunpaneldesign, immunstaining og fluorescens minus én kontrol som detalje i tekstprotokollen.Forbered UltraComp perler, mens flow instrumenter varmer op ved vortexing dem grundigt før brug. Mærke et separat 12 x 75 millimeter prøverør for hver fluorochromes konjugeret antistoffer. Tilføj 100 mikroliter af farvning buffer til hvert rør følge med en fuld dråbe af perlerne.Tilføj antistoffer og udfør farvningsproceduren som beskrevet i tekstprotokollen. Derefter tilsættes 0,5 milliliter farvning buffer til hver perle pellet og helt re-suspendere via vortex. Sæt nu Flow cytometri PMT spænding pr målvæv for det givne eksperiment.Kør prøven gennem prøven gennem Flow-cytometrien for dataindsamling ved at få en enkelt perlepopulation pr. fremadspred og sidespr.aflæsninger. Indstil strømningshastigheden omkring 200 til 300 hændelser pr. sekund. Angiv den passende kompensation for et givet fluorescein-FITC-bøjningsantistoffer ved hjælp af et FL1 versus FL1-dotplot.Placer en kvadrant gate, så de negative perler er inden for nederste venstre kvadrant og de positive perler er inden for den øvre eller nederste højre kvadrant. Juster kompensationsværdierne, indtil medianinfluoresceinintensiteten for hver population er omtrent ens. Gentag disse trin for alle rør.Fortsæt nu med at anskaffe faktiske pletprøver. Kør guiden Kompensation, og gem indstillingen med formatet:dato, eksperiment og dine initialer. Ortopisk implantation af pancreas ductal adenocarcinom resulterede i hurtig tumorvækst svarende til den, der ses i subkutan implantation.Repræsentative hæmatoxylin og eosin farvning billeder er vist og demonstrere lignende vækst af subkutane og ortopiske implantater. Rimeligt høje levedygtige celler udbytter blev indhentet fra tumor prøve af begge typer af implantation. Den repræsentative FACS splat viser levedygtige celler fra tumor adskilt fra de døde celler og cellerester.Vist her, er en tumor infiltrerer en immunprofil sammenligning af de store og tæller cellepopulation af flere vigtige delmængder af tumor immunceller. Subkutan versus ortopisk homograft af kræft i bugspytkirtlen er vist. Dataene viser klart, at tumoren har øget immuncelleinfiltrationen betydeligt sammenlignet med bugspytkirtlen af raske mus.Desuden blev der fundet forskellige procenter af tumor infiltrerende immuncelledelmængder i ortopiske versus subkutane homografter. For eksempel er der betydeligt flere B-celler i ortopisk end i subkutan. Mens du forsøger denne procedure er det vigtigt at huske at forberede alle tilknyttede materialer og reagenser på forhånd.Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan du udfører FACS analyse for murine modeller.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Fluorescent ortotopisk Mouse Model af kræft i bugspytkirtlen

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

En mus Model af træthed induceret af perifere Bestråling

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

En Syngeneic bugspytkirtelkræft musen Model til at studere virkningerne af irreversibel elektroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

En bioluminescerende og fluorescerende Orthotopic Syngeneic Murine Model af Androgen-afhængige og kastration-resistente prostatakræft

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic Transplantation af Syngeneic lunge adenocarcinom celler at studere PD-L1 udtryk

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Efterligne og manipulere med pancreas Acinar til duktalt metaplasi i 3-dimensionelle cellekultur

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolering og karakterisering af patient-afledte bugspytkirtel ductal adenokarcinom Organoid modeller

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultralyd-guidet Ortotopisk implantation af murin Pankreatisk ductal adenocarcinoma

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolering af proksimale væsker for at undersøge tumormikromiljøet af pancreas adenocarcinom

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

En orthotopic Resectional Mouse Model af kræft i bugspytkirtlen

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...