Name: immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry
Uploaded: 2018-10-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry at JoVE.com

De auteurs zou Dr. Jody Barbeau - dank voor kritisch lezen en bewerken van het manuscript, en Ralph Manuel bedanken voor het ontwerpen van kunstwerken. De auteurs ook bedank de kroon Bioscience oncologie Immuno-oncologie Biomarker team en oncologie In Vivo team, voor hun grote technische inspanningen.

Alle protocollen en wijziging(en) of procedures waarbij de zorg en het gebruik van dieren zal worden herzien en goedgekeurd door de kroon Bioscience dier zorginstellingen en gebruiken Comité (IACUC) vóór de uitvoering van studies. De zorg en het gebruik van dieren zal meestal worden uitgevoerd overeenkomstig AAALAC (vereniging voor de beoordeling en de accreditatie van Laboratory Animal Care) internationale richtsnoeren zoals vermeld in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren, nationaal onderzoek Raad (201...

<ol>
	<li>Chevrier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Immune+Atlas+of+Clear+Cell+Renal+Cell+Carcinoma.">An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma.</a> Cell. 169 (4), 736-749 (2017).</li><li>Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+immune+responses+in+the+tumor+microenvironment.">Monitoring immune responses in the tumor microenvironment.</a> Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).</li><li>Mosely, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+Selection+of+Syngeneic+Preclinical+Tumor+Models+for+Immunotherapeutic+Drug+Discovery.">Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery.</a> Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).</li><li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+focal+adhesion+kinase+renders+pancreatic+cancers+responsive+to+checkpoint+immunotherapy.">Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy.</a> Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).</li><li>Gunderson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruton+Tyrosine+Kinase-Dependent+Immune+Cell+Cross-talk+Drives+Pancreas+Cancer.">Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer.</a> Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).</li><li>Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+modeling+for+immuno-oncology.">Experimental animal modeling for immuno-oncology.</a> Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).</li><li>Takao, K., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+greatly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).</li><li>Payne, K. J., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-cell+lineage+commitment:+translation+from+mice+to+humans.">Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans.</a> Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>von Herrath, M. G., Nepom, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+translation:+barriers+to+implementing+clinical+immunotherapeutics+for+autoimmunity.">Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity.</a> J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).</li><li>Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+to+evaluate+novel+and+conventional+therapeutic+strategies+for+cancer.">Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer.</a> Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).</li><li>Erdag, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotype+and+immunohistologic+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+are+associated+with+clinical+outcome+in+metastatic+melanoma.">Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma.</a> Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).</li><li>Guti&#233;rrez-Garcia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+and+not+immunophenotypic+algorithms+predicts+prognosis+in+patients+with+diffuse+large+B-cell+lymphoma+treated+with+immunochemotherapy.">Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy.</a> Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).</li><li>Paiva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1/PD-1+presence+in+the+tumor+microenvironment+and+activity+of+PD-1+blockade+in+multiple+myeloma.">PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma.</a> Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).</li><li>Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+nature+of+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice.">Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Landscape+in+Early+Lung+Adenocarcinoma+by+Paired+Single-Cell+Analyses.">Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses.</a> Cell. 169 (4), 750-765 (2017).</li><li>Mahoney, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Antibodies+to+Its+Cytoplasmic+Domain+Most+Clearly+Delineate+Cell+Membranes+in+Immunohistochemical+Staining+of+Tumor+Cells.">PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).</li><li>Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+expression+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+is+a+poor+prognostic+factor+in+patients+with+high+CD8++tumor-infiltrating+lymphocytes:+highly+sensitive+detection+using+phosphor-integrated+dot+staining.">PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining.</a> Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImmunoScore+Signature:+A+Prognostic+and+Predictive+Tool+in+Gastric+Cancer.">ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer.</a> Ann. Surg. , (2016).</li><li>Ribas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+Blockade+Expands+Intratumoral+Memory+T+Cells.">PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).</li></ol>

Hoewel studies met behulp van SC tumoren zijn gemakkelijker uitgevoerd, orthotopically geïmplanteerd tumoren modellen kunnen potentieel zijn relevanter voor preklinische farmacologie studies (met name I/O onderzoeken) te bieden verbeterde vertaalbaarheid. Dit verslag beoogt de interesse lezers/publiek om direct visualiseren de technische procedures die kunnen worden gebruikt in hun respectieve onderzoek te kunnen helpen. Onze protocollen aantonen dat orthotopic implantatie van PDAC kan leiden tot een efficiënte tumorgr...

Alvleesklier ductaal adenocarcinoom (PDAC) zorgt ervoor dat bijna de helft een miljoen sterfgevallen wereldwijd jaarlijks, een van de top 5 kanker moordenaars. Er zijn enkele effectieve behandelingsopties en geen goedgekeurde immuuntherapie; nieuwe behandelingen zijn dan ook hard nodig. Kankers worden steeds meer erkend als immunologische ziekten, met inbegrip van PDAC, naast de genetische ziekten zoals bekend vandaag. Immunologische en genetische factoren zou waarschijnlijk bepalen prognose van de ziekte, alsmede de behandeling uitkomsten. Tumoren host immuun toezicht ontduiken en uiteindelijk verder om te leiden tot de dood. Veel van deze immuun processen die zich voordoen in de communicatie van de tumor (TME)1,,2,,3,4 waar verschillende soorten immuuncellen interactie aangaan met de tumorcellen, met elkaar en met andere tumor stromale onderdelen, direct of indirect via cytokines die uiteindelijk ziekte uitkomst bepalen. Karakterisering van de componenten tumor immuun TME, of immunophenotyping van de tumor, met inbegrip van subtypering, nummering en lokalisatie van verschillende geslachten van immune cellen, is daarom cruciaal voor het begrip anti-tumor immuniteit. In het geval van PDAC, er is voorgesteld dat verhoogde tumor-infiltreren onderdrukkende macrofagen (TAM) en B-cellen hebben geleid tot de preventie van T-cel infiltratie en/of activering en hoge niveaus van fibrose5,6.
De gemeenschappelijke aanpak van immuun TMEs experimenteel onderzoek zou worden met behulp van surrogaat tumor preklinische diermodellen, voornamelijk relevante muis tumor modellen7, bijzonder muis syngeneic (homograft) of genetisch gemodificeerde Muismodellen (GEMM) van kanker, op de veronderstelde gelijkenis van muis en mens voor tumoren en immuniteit8,9. In werkelijkheid wordt ervan uitgegaan dat er inherente verschillen tussen de twee soorten10,11 zijn.
Getransplanteerde muis tumoren hebben aanzienlijke operationele voordelen ten opzichte van spontane tumoren7, namelijk gesynchroniseerde tumor ontwikkeling, in tegenstelling tot de ouderlijke GEMM spontane tumor ontwikkeling. Homografts van spontane lymfkliertest tumoren worden beschouwd als primaire tumoren heb nooit gemanipuleerd in vitroen mirroring originele muis tumor histo- / moleculaire pathologie7, evenals mogelijke immuun profielen. Deze lymfkliertest homografts worden vaak beschouwd als "een muis versie van patiënt-afgeleide xenografts (PDXs)". Daarom hebben zij waarschijnlijk een betere vertaalbaarheid dan conventionele syngeneic cel lijn afkomstige muis tumoren12. In het bijzonder, zijn veel homografts afgeleid van specifieke GEMM waar specifieke ziekten bij de mens mechanismen, bijvoorbeeld oncogene stuurprogramma mutaties, zijn ontworpen, en deze homografts moet derhalve voordelen aan hun klinische relevantie. In het bijzonder, ontwikkelen KPC GEMM muis PDAC binnen 15 tot 20 weken van leeftijd, die morfologisch recapituleert ziekten bij de mens met overwegend goed - tot matig-gesplitste klierweefsel architectuur en hoogverrijkt stroma. Dit model ook recapituleert de meest voorkomende genetische kenmerken van menselijke PDAC, namelijk Kras activeren mutatie en P53 verlies-van-functie, die in 90% en 75% van de menselijke PDAC, respectievelijk5,6te voorkomen.
Sites van transplantatie hebben geopperd zijn een rol te spelen in model vertaalbaarheid. De specifieke omgeving weefsel, zoals een overeenkomstige orthotopic omgeving, zou een niche voor specifieke tumoren aan vooruitgang, in tegenstelling tot de uniforme onderhuidse (SC) omgevingen voor algemeen getransplanteerde tumoren. Het zou van bijzonder belang als, en/of, wat verschil bestaat tussen de twee sites van de transplantatie, in termen van immuun-communicatie, en de relevantie voor menselijke kanker, bv. in het geval van PDAC.
Een van de belangrijkste aspecten van immuun profilering, of immunophenotyping, is het bepalen van de tumor-infiltreren immune cellen van verschillende geslachten, de nummers, relatieve percentage binnen tumoren, evenals hun activering Staten en locaties. Dit omvat tumor-infiltratrating lymphoctyes (TILs, T- zowel B-), tumor-infiltreren macrofagen (TAMs), tumor-infiltreren natural killer cellen (NKs) en tumor-ingezeten dendritische cellen3,13,14 , 15 , 16 , 17en de subcellular localisatie van bepaalde cellen18,19,20, enz. Fluorescentie geactiveerd Cell Sorting (FACS) of stroom cytometry is een eencellige detectietechnologie die wordt gebruikt bij het meten van de specifieke parameters van een cel. Multi-Color stroom cytometry maatregelen meerdere markeringen op een eencellige3,4,21 en is de meest gebruikte methode om te bepalen van de aantallen en de relatieve percentage van verschillende subgroepen van immune cellen, met inbegrip van die binnen tumoren.
Dit verslag beschrijft procedures voor profilering van tumor-infiltreren immuuncellen: 1) implantatie van orthotopic PDAC muis tumor homografts, samen met SC de implantatie; 2) tumor weefsel oogst en eencellige voorbereiding via tumor dissociatie; 3) stroom cytometry analyse van alle cellen afgeleid van tumoren als een baseline; 4) vergelijking van basislijn profielen van beide benaderingen van de transplantatie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine</td>
			<td>\</td>
			<td>SAS3119</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trocar 20</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>2mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotic and antimycotic</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Air chemical</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood</td>
			<td>AIRTECH</td>
			<td>BSC-1300IIA2</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibodies</td>
			<td>BD</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration</td>
			<td>BD</td>
			<td>354248</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffers</td>
			<td>BD</td>
			<td>554656</td>
			<td>Mincing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Staining Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>563794</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td>553142</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell filters</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>70&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>routine blood tube</td>
			<td>BD-Vacutainer</td>
			<td>365974</td>
			<td>2mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>vs 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3 Fix/Perm kit</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810R,5920R</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td>\</td>
			<td>vs 10.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable, sterile scalpels</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J12100</td>
			<td>11#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife handle</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J11010</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>Y00030</td>
			<td>Eye scissors 10cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>JD1060</td>
			<td>Eye tweezers 10cm with teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable liquid nitrogen tank</td>
			<td>Jinfeng</td>
			<td>YDS-175-216</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Metter Toledo</td>
			<td>AL204</td>
			<td>0-100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi C-tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi Gentle MACS with heater blocks</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-018-306</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryopreservation tube</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME</td>
			<td>PathClear</td>
			<td>3442-005-01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringes</td>
			<td>Shanghai MIWA medical industry</td>
			<td>\</td>
			<td>1-5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog software</td>
			<td>Studylog</td>
			<td>\</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Balance and supporting USB</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>SE601F</td>
			<td>Balance and supporting USB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Data line of vernier calipers</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>926.6721</td>
			<td>Data line of vernier calipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>910.1502.10</td>
			<td>Sylvac S-Cal pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339653</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339651</td>
			<td>15mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>KLCS-288</td>
			<td>4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PLF-276</td>
			<td>&#8212;20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>DW-862626</td>
			<td>&#8212;80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>am7021</td>
			<td>\</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry

Homograft (syngeneic) tumoren zijn het werkpaard van hedendaagse immuno-oncologie (I/O) preklinisch onderzoek. De tumor communicatie (TME), met name de immuun-componenten, is essentieel voor de prognose en de voorspelling van de resultaten van de behandeling, met name die van immunotherapie. TME immuun-componenten bestaan uit verschillende subgroepen van tumor-infiltreren immuuncellen verifieerbare door Multi-Color FACS. Alvleesklier ductaal adenocarcinoom (PDAC) is een van de dodelijkste malignances goede behandelingsmogelijkheden, dus een dringende en onvervulde medische noodzaak ontbreekt. Een belangrijke reden voor de niet-ontvankelijkheid aan verschillende therapieën (chemo-, doelgerichte, I/O) geweest zijn overvloedige TME, bestaande uit fibroblasten en leukocyten, die tumorcellen tegen deze therapieën beschermen. Orthotopically geïmplanteerde PDAC wordt beschouwd als meer nauwkeurig heroveren de TME van menselijke alvleesklier kanker dan conventionele onderhuidse (SC) modellen.
Homograft tumoren (KPC) zijn transplantaties van muis spontane PDAC van oorsprong uit genetisch gemanipuleerde KPC-muizen (KrasG12D / +/P53- / -/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). De primaire tumor weefsel is gesneden in kleine fragmenten (~ 2 mm3) en getransplanteerde subcutaan (SC) aan de syngeneic ontvangers (C57BL/6, 7-9 weken oud). De homografts werden vervolgens operatief orthotopically getransplanteerd naar de alvleesklier van nieuwe C57BL/6 muizen, samen met SC-implantatie, die tumor volumes van 300 – 1.000 mm3 bereikbaar 17 dagen. Alleen tumoren van 400-600 mm3 werden geoogst per goedgekeurde autopsie procedure en gereinigd om te verwijderen van de aangrenzende weefsels van de niet-tumor. Ze waren losgekoppeld per protocol gebruikt een dissociator weefsel in eencellige schorsingen, gevolgd door de kleuring met aangewezen panelen van fluorescently gelabelde antilichamen voor verschillende markers van verschillende immuuncellen (lymfoïde, myeloïde en NK, DCs). De gekleurde monsters werden geanalyseerd met Multi-Color FACS te bepalen aantal immuuncellen van verschillende geslachten, alsmede het relatieve aandeel ervan binnen tumoren. De immuun profielen van orthotopic tumoren werden vervolgens vergeleken met die van SC tumoren. De voorlopige gegevens aangetoond aanzienlijk verhoogde infiltreren TILs/TAMs tumoren in de alvleesklier, en hogere infiltratie van de B-cel in de orthotopic in plaats van SC tumoren.

Orthotopic implantatie van PDAC resulteerde in snelle tumorgroei gelijkend op dat gezien voor SC implantatie. Nadat de donor tumor fragmenten werden ingeplant ontvangende muizen, zowel subcutaan en orthotopically volgens de protocollen beschreven in stap 2.1 en 2.2, de geïmplanteerde KPC homograft tumoren aangetoond vergelijkbare snelle groei, zoals wordt weergegeven in de figuur 1A . KPC homograft tumoren geoogst op verschillende tijdstippen zijn weergegeve...

Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry at JoVE.com

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

De experimentele procedure op de immunophenotyping van lymfkliertest orthotopic PDAC homografts is gericht op de profilering van de tumor immuno-communicatie. Tumoren zijn orthotopically geïmplanteerd via chirurgie. Tumoren van 200 – 600 mm3 in grootte werden geoogst en losgekoppeld om te bereiden eencellige schorsingen, gevolgd door multi immuun marker FACS analyse met behulp van verschillende fluorescently gelabelde antilichamen.

Immunophenotyping van Orthotopic Homograft (Syngeneic) van de alvleesklier ductaal adenocarcinoom lymfkliertest primaire KPC door Stroom Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Dit bericht kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in immunofennotypering in Murine-modellen, zoals markers die worden gebruikt om verschillende immuniteitsafstamenten en verouderingsstrategieën te identificeren. Het grote voordeel van deze techniek is dat de marker en veroudering stategies, wanneer immunophenotyping, kan worden toegepast op een verscheidenheid van murine modellen. Controleer het lichaamsgewicht van C57 Black 6 muizen met behulp van een balans.Controleer ook het tumorvolume van tumor variërende donormuizen door kalibermeting. Na euthanasie van het dier in een biohazard kap volgens protocol, steriliseren de huid rond de tumor met behulp van Iodophor swabs. Na chirurgische verwijdering van de tumor zoals beschreven in het tekstprotocol, plaats de tumor in een petrischaaltje met 20 milliliter PBS dat is voorgekoeld tot 4 graden Celsius.Als er bloed besmet is, breng de tumor over in een andere petrischaal en was de tumor met PBS. Halveer de tumor. Verwijder eventuele extra huid, bloedvaten, verkalking en necrose.Kies alleen intacte stukjes tumor en leg ze in een steriele 50 milliliter centrifuge buis. Voeg 20 milliliter PBS toe voordat u de buis naar een aparte dierenkamer vervoert voor farmacologiestudies. Om voor te bereiden op orthotopische implantatie, bevestig een volledig verdovende muis op een experimentbord in de juiste laterale positie.Desinfecteer de huid rond de milt met idodine en deodinate met 75% ethylalcohol. Zoek het mediane punt van de milt en maak een verticale incisie van 1 centimeter op de buik om de milt bloot te leggen. Trek voorzichtig een deel van het alvleesklierweefsel onder de milt met platte puntceer.En sutro muis homograft tumor stuk van de C muis op de alvleesklier van de ontvanger muis door 9-O bsorbable chirurgische hechting. Sluit de buik met een 6-O zijden hechting door dubbele naad. Bereik homeostase door compressie.Na het beëindigen van tumorimplantatie, houd het dier in een warme kooi zolang er geen bloeding of tumorweefsel lekkage optreedt. Controleer het dier totdat ze weer voldoende bewustzijn hebben om de strenge recumbency te behouden. Breng het dier terug naar de dierenkamer na volledig herstel van anesthesie.Monitor de tumor variërende muizen door palpating de buik in de buurt van de milt en selecteer de muizen met orthotopische tumoren. Voor elke tumor, bereid een C-buis met tumor spijsvertering buffer. Gebruik 3 milliliter spijsverteringsbuffer voor tumorfragmenten van minder dan 0,8 gram om ervoor te zorgen dat de tumor volledig is verteerd.Label de tumor met de studiecode, tumor, muis-ID, behandelingsgroep en tumorgewicht. Verzamel de tumor van de muis. Was de tumor in koude PBS en maak het weefsel op de tumor schoon.Plaats tumor in de spijsvertering media in een put van een steriele 6-well plaat. Houd de tumor op zijn plaats met steriele pincet of tangen en snijd met een scalpel. Snijd de tumor goed genoeg om in kleinere stukken te breken.Plaats nu de tumorstukken terug in de C-buis en gebruik de resterende spijsverteringsbuffer om de plaat te wassen. Breng de vloeistof in de C-buis en plaats het op ijs tot de spijsvertering. Schakel vervolgens de dissociator in met kachels.Plaats de tumor dissociatie C-buis ondersteboven in de mouw van de vacante positie. Pas de status van de buispositie aan van Vrij naar Geselecteerd. Kies een dissociatieprogramma dat volgt op de selectie van de vereiste map waarin de lijst met programma's wordt weergegeven.Na beëindiging van het programma, neem C-buis uit de dissociator en spin kort om het monster pallet. Nu, opnieuw opschorten de monsters en zet ze in een cel zeef boven een 50 milliliter buis. Was de cel door de celzeef met 10 milliliter wasbuffer om een enkele celopening te bieden.Na het centrifugeren van buis op 300 G gedurende 5 minuten, gooi de supernatant en opnieuw opschorten van de cellen met 5 milliliter wasbuffer. Tel levensvatbare cellen en pas de celconcentratie aan tot 1 miljoen cel per buis of per monster. Voer het ontwerp van het immuunsysteem, immunostaining en fluorescentie minus één controle uit als detail in het tekstprotocol.Bereid UltraComp kralen terwijl de stroom instrumenten is opwarmen door vortexing ze grondig voor gebruik. Label een aparte monsterbuis van 12 x 75 millimeter voor elke geconjugeerde antilichamen van fluorchromiën. Voeg 100 microliter kleuring buffer aan elke buis te volgen door een volledige druppel van de kralen.Voeg antilichamen toe en voer de kleuringsprocedure uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg vervolgens 0,5 milliliter kleuring buffer aan elke kraal pellet en volledig opnieuw op te schorten via vortex. Stel nu Flow cytometrie PMT-spanning per doelweefsel in voor het gegeven experiment.Voer het monster door monster door de Flow cytometrie voor gegevensverwerving door het verkrijgen van de singlet kraal populatie per voorwaartse scatter en side scatter lezingen. Stel de stroomsnelheid in rond de 200 tot 300 gebeurtenissen per seconde. Stel de juiste compensatie in voor een bepaalde fluoresceïne FITC vervoegingsantilichamen met behulp van een FL1 versus FL1-puntplot.Plaats een kwadrant poort, zodat de negatieve kralen zijn binnen de linkerbeneden kwadrant en de positieve kralen zijn binnen de bovenste of onderste rechter kwadrant. Pas de compensatiewaarden aan totdat de mediane fluoresceïneinintensiteit van elke populatie ongeveer gelijk is. Herhaal deze stappen voor alle buizen.Nu, overgaan tot het verwerven van de werkelijke vlek monsters. Voer de wizard Compensatie uit en sla de instelling op met de indeling:datum, experiment en uw initialen. Orthotopische implantatie van pancreas ductal adenocarcinoom resulteerde in een snelle tumorgroei vergelijkbaar met die gezien in onderhuidse implantatie.Representatieve hematoxyline- en eosine-kleuringsbeelden worden getoond en vertonen een vergelijkbare groei van onderhuidse en orthotopische implantaten. Redelijk hoge levensvatbare cellen opbrengsten werden verkrijgt uit de tumor monster van beide type van implantatie. De representatieve FACS splat toont levensvatbare cellen van tumor gescheiden van de dode cellen en celpuin.Hier getoond, is een tumor infiltreren een immuun profiel vergelijking van de grote en teller cel populatie van verschillende belangrijke subsets van tumor immuuncellen. Onderhuidse versus orthotopische homograft van alvleesklierkanker worden getoond. De gegevens tonen duidelijk aan dat de tumor hebben aanzienlijk verhogen immuuncel infiltratie in vergelijking met alvleesklier van gezonde muizen.Bovendien werden verschillende percentages van tumorinfiltreren immuuncel subsets gevonden in orthotopische versus onderhuidse homografts. Er zijn bijvoorbeeld aanzienlijk meer B-cellen in orthotopic dan in onderhuids. Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden om alle bijbehorende materialen en reagentia vooraf voor te bereiden.Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe FACS-analyse uit te voeren voor murine modellen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Fluorescerende orthotope Muis Model van pancreaskanker

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Een muismodel van vermoeidheid geïnduceerd door Peripheral Bestraling

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Een muismodel van Syngeneic Pancreatic kanker te bestuderen van de gevolgen van onomkeerbaar Electroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Een bioluminescente en fluorescerende Orthotopic Syngeneic lymfkliertest Model van androgeen-afhankelijke en castratie-resistente prostaatkanker

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic transplantatie van Syngeneic Long adenocarcinoom cellen te bestuderen van PD-L1 expressie

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Nabootsen en manipuleren van de alvleesklier acinaire-naar-ductaal metaplasie in 3-dimensionale celcultuur

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolatie en karakterisering van patiënt-afgeleide pancreatic Ductal adenocarcinoom Organoid modellen

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Echografie-geleide Orthotopic implantatie van Murine pancreatic Ductal adenocarcinoom

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolatie van proximale vloeistoffen om de tumormicro-omgeving van pancreasadenocarcinoom te onderzoeken

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

Een orthotopisch resectiemuismodel van alvleesklierkanker

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...