Name: immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry
Uploaded: 2018-10-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry at JoVE.com

Les auteurs seraient remercie Dr Jody Barbeau - lecture critique et l’édition du manuscrit et remercier Ralph Manuel pour la conception des œuvres d’art. Les auteurs tiens également à remercier l’équipe de couronne Bioscience oncologie Immuno-oncologie biomarqueur et oncologie In Vivo , pour leurs grands efforts techniques.

Tous les protocoles et modifications ou procédures mettant en cause le soin et l’utilisation d’animaux seront examinées et approuvées par la Couronne Bioscience Institutional Animal Care et utiliser Comité (IACUC) avant la réalisation d’études. Le soin et l’utilisation des animaux seront généralement menées conformément aux lignes directrices internationales AAALAC (Association pour l’évaluation et l’accréditation du laboratoire Animal Care) comme indiqué dans le Guide pour le soin et l’utilisa...

<ol>
	<li>Chevrier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Immune+Atlas+of+Clear+Cell+Renal+Cell+Carcinoma.">An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma.</a> Cell. 169 (4), 736-749 (2017).</li><li>Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+immune+responses+in+the+tumor+microenvironment.">Monitoring immune responses in the tumor microenvironment.</a> Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).</li><li>Mosely, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+Selection+of+Syngeneic+Preclinical+Tumor+Models+for+Immunotherapeutic+Drug+Discovery.">Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery.</a> Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).</li><li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+focal+adhesion+kinase+renders+pancreatic+cancers+responsive+to+checkpoint+immunotherapy.">Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy.</a> Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).</li><li>Gunderson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruton+Tyrosine+Kinase-Dependent+Immune+Cell+Cross-talk+Drives+Pancreas+Cancer.">Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer.</a> Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).</li><li>Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+modeling+for+immuno-oncology.">Experimental animal modeling for immuno-oncology.</a> Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).</li><li>Takao, K., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+greatly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).</li><li>Payne, K. J., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-cell+lineage+commitment:+translation+from+mice+to+humans.">Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans.</a> Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>von Herrath, M. G., Nepom, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+translation:+barriers+to+implementing+clinical+immunotherapeutics+for+autoimmunity.">Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity.</a> J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).</li><li>Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+to+evaluate+novel+and+conventional+therapeutic+strategies+for+cancer.">Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer.</a> Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).</li><li>Erdag, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotype+and+immunohistologic+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+are+associated+with+clinical+outcome+in+metastatic+melanoma.">Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma.</a> Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).</li><li>Guti&#233;rrez-Garcia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+and+not+immunophenotypic+algorithms+predicts+prognosis+in+patients+with+diffuse+large+B-cell+lymphoma+treated+with+immunochemotherapy.">Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy.</a> Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).</li><li>Paiva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1/PD-1+presence+in+the+tumor+microenvironment+and+activity+of+PD-1+blockade+in+multiple+myeloma.">PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma.</a> Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).</li><li>Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+nature+of+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice.">Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Landscape+in+Early+Lung+Adenocarcinoma+by+Paired+Single-Cell+Analyses.">Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses.</a> Cell. 169 (4), 750-765 (2017).</li><li>Mahoney, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Antibodies+to+Its+Cytoplasmic+Domain+Most+Clearly+Delineate+Cell+Membranes+in+Immunohistochemical+Staining+of+Tumor+Cells.">PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).</li><li>Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+expression+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+is+a+poor+prognostic+factor+in+patients+with+high+CD8++tumor-infiltrating+lymphocytes:+highly+sensitive+detection+using+phosphor-integrated+dot+staining.">PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining.</a> Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImmunoScore+Signature:+A+Prognostic+and+Predictive+Tool+in+Gastric+Cancer.">ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer.</a> Ann. Surg. , (2016).</li><li>Ribas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+Blockade+Expands+Intratumoral+Memory+T+Cells.">PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).</li></ol>

Bien que les études utilisant des tumeurs SC sont réalisées plus facilement, orthotopically implanté tumeurs modèles peuvent potentiellement être plus pertinentes pour les études de pharmacologie préclinique (en particulier les enquêtes I/O) pour fournir la traduisibilité améliorée. Ce rapport vise à aider le lecteurs/audience intéressée pour être en mesure de visualiser directement les procédures techniques qui peuvent être utilisés dans leurs recherches respectives. Nos protocoles de démontrent cett...

Adénocarcinome canalaire pancréatique (ACPE) provoque près de la moitié un million mortalités dans le monde entier chaque année, le top 5 du cancer meurtrière. Il y a peu d’options thérapeutiques efficaces et aucune immunothérapies approuvés ; par conséquent, les nouveaux traitements sont absolument nécessaires. Les cancers sont plus en plus reconnus comme des maladies immunologiques, incluant ACPE, outre les maladies génétiques, tel que connu aujourd'hui. Facteurs génétiques, immunologiques et déterminerait probablement pronostic de la maladie ainsi que le traitement résultats. Les tumeurs soustraire à la surveillance immunitaire hôte et finalement avancement pour causer la mort. Plusieurs de ces processus immunitaires produisent dans le microenvironnement tumoral (TME)1,2,3,4 où différents types de cellules immunitaires interagissent avec les cellules tumorales, entre eux et avec les autres tumeurs les composants stromales, directement ou indirectement par l’intermédiaire de cytokines qui déterminent en dernier ressort issue de la maladie. Caractérisation des composantes immunitaires tumeur de la TME, ou tumeur immunophénotypage, y compris le sous-typage, la numération et la localisation des différentes lignées de cellules immunitaires, est donc essentielle pour comprendre l’immunité anti-tumorale. Dans le cas de l’ACPE, il a été proposé qu’élevé tumeur-infiltration de macrophages suppressives (TAM) et les lymphocytes B ont conduit à la prévention de l’infiltration de lymphocytes et/ou l’activation et des niveaux élevés de fibrose5,6.
L’approche commune pour enquêter sur le système immunitaire eut expérimentalement utiliserait des modèles animaux précliniques de substitution tumeur, tumeur de souris principalement aux modèles7, particulièrement des souris syngénique (homogreffe) ou des modèles de souris génétiquement modifiées (GEMM) des cancers, sur la ressemblance présumée de la souris et l’homme pour les tumeurs et immunité8,9. En réalité, il est entendu qu’il y a des différences inhérentes entre les deux espèces10,11.
Les tumeurs de souris transplantées ont un avantage significatif sur des tumeurs spontanées7, à savoir le développement de tumeurs synchronisée, par contraste avec le développement de tumeurs spontanées GEMM parental. Homogreffes de tumeurs murines spontanées sont considérés comme des tumeurs primaires n’ayant jamais été manipulé in vitroet mise en miroir original souris tumeur histo- / moléculaire pathologie7, ainsi que des profils de système immunitaires possibles. Ces homogreffes murins sont souvent considérés comme « une version de souris des xénogreffes dérivés de patient (PDXs) ». Par conséquent, ils ont probablement une meilleure traduisibilité de cellule syngénique classiques dérivé souris tumeurs12. En particulier, nombreux homogreffes sont dérivés de GEMM spécifique où des mécanismes spécifiques de la maladie humaine, par exemple les mutations oncogéniques pilote, ont été conçus, et ces homogreffes devraient donc avoir des avantages à leur pertinence clinique. En particulier, la KPC GEMM développer souris ACPE dans 15 à 20 semaines d’âge, qui récapitule morphologiquement des maladies humaines avec architecture glandulaire de surtout bien à modérément-dissociés et hautement enrichi stroma. Ce modèle reprend également les fonctions génétiques les plus courantes du CCPP humaine, à savoir Kras en activant la mutation et la perte de fonction P53, qui se produisent à 90 % et 75 % des humain ACPE, respectivement de5,6.
Sites de transplantation ont également été suggérés à jouer un rôle dans la traduisibilité modèle. L’environnement tissulaire spécifique, comme dans un environnement orthotopique correspondante, pourrait être une niche pour les tumeurs spécifiques aux environnements de progrès, par opposition à l’uniform sous-cutanée (SC) pour les tumeurs couramment greffés. Il serait particulièrement intéressant if, et/ou, quelle différence existe entre les deux sites de transplantation, sur le plan immunitaire-microenvironnement et la pertinence de cancer chez l’humain, par exemple. dans le cas de l’ACPE.
Un des aspects plus importants de profilage immunitaire ou immunophénotypage, est de déterminer les cellules immunitaires infiltrant de tumeur différentes lignées, les nombres, pourcentage relatif dans les tumeurs, ainsi que leurs États d’activation et les emplacements. Cela inclut la tumeur-infiltratrating lymphoctyes (TILs, tant T - B-), tumeur-infiltration de macrophages (EAPV), tumeur-infiltration des cellules tueuses naturelles (NKs) et tumeur non-résidents dendritiques cellules3,13,14 , 15 , 16 , 17et la localisation subcellulaire de certaines cellules18,19,20, etc.. Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) ou écoulement cytometry est une technologie de détection de la cellule unique qui est couramment utilisée pour mesurer les paramètres spécifiques d’une cellule. Multi-color flow cytometry mesures des marqueurs multiples sur une seule cellule3,4,21 et est la méthode la plus couramment utilisée pour déterminer le nombre et le pourcentage relatif des différents sous-ensembles de cellules immunitaires, notamment dans les tumeurs.
Ce rapport décrit les procédures pour le profilage des cellules immunitaires infiltrant de tumeur : 1) l’Implantation des homogreffes tumeur orthotopique ACPE souris, ainsi que l’implantation de SC ; 2) tumeur tissulaire récolte et préparation de cellule unique par l’intermédiaire de dissociation de la tumeur ; 3) analyse en cytométrie en flux de toutes les cellules dérivées de tumeurs comme point de départ ; 4) Comparaison des profils de la base de ces deux approches de la transplantation.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine</td>
			<td>\</td>
			<td>SAS3119</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trocar 20</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>2mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotic and antimycotic</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Air chemical</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood</td>
			<td>AIRTECH</td>
			<td>BSC-1300IIA2</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibodies</td>
			<td>BD</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration</td>
			<td>BD</td>
			<td>354248</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffers</td>
			<td>BD</td>
			<td>554656</td>
			<td>Mincing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Staining Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>563794</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td>553142</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell filters</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>70&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>routine blood tube</td>
			<td>BD-Vacutainer</td>
			<td>365974</td>
			<td>2mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>vs 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3 Fix/Perm kit</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810R,5920R</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td>\</td>
			<td>vs 10.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable, sterile scalpels</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J12100</td>
			<td>11#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife handle</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J11010</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>Y00030</td>
			<td>Eye scissors 10cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>JD1060</td>
			<td>Eye tweezers 10cm with teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable liquid nitrogen tank</td>
			<td>Jinfeng</td>
			<td>YDS-175-216</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Metter Toledo</td>
			<td>AL204</td>
			<td>0-100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi C-tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi Gentle MACS with heater blocks</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-018-306</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryopreservation tube</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME</td>
			<td>PathClear</td>
			<td>3442-005-01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringes</td>
			<td>Shanghai MIWA medical industry</td>
			<td>\</td>
			<td>1-5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog software</td>
			<td>Studylog</td>
			<td>\</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Balance and supporting USB</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>SE601F</td>
			<td>Balance and supporting USB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Data line of vernier calipers</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>926.6721</td>
			<td>Data line of vernier calipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>910.1502.10</td>
			<td>Sylvac S-Cal pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339653</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339651</td>
			<td>15mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>KLCS-288</td>
			<td>4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PLF-276</td>
			<td>&#8212;20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>DW-862626</td>
			<td>&#8212;80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>am7021</td>
			<td>\</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry

Homogreffe tumeurs (syngéniques) sont le produit phare de la recherche préclinique d’aujourd'hui immuno-oncologie (e/s). Le microenvironnement tumoral (TME), particulièrement ses composantes immunitaires, est essentiel pour le pronostic et la prévision des résultats du traitement, en particulier ceux de l’immunothérapie. TME immunitaire-composants sont composés de différents sous-ensembles de cellules immunitaires infiltrant de tumeur évaluables par FACS multicolore. Adénocarcinome canalaire pancréatique (CCPP) est parmi les plus meurtrières malignances manque d’options de traitement bon, donc un besoin médical urgent et non satisfait. Une des grandes raisons pour sa non-réponse aux divers traitements (chimio-et ciblé, I/O) a été sa TME abondante, composée de fibroblastes et de leucocytes qui protègent les cellules tumorales de ces thérapies. Orthotopically ACPE implanté est censé plus précisément reprendre la TME des cancers du pancréas humains que les modèles conventionnels de sous-cutanée (SC).
Homogreffe tumeurs (KPC) sont des greffes de souris spontanée ACPE originaires de KPC-souris génétiquement modifiées (KrasG12D / +/P53- / -/Pdx1-Cre) (CPK-GEMM). Le tissu de la tumeur primitive est coupé en petits fragments (~ 2 mm3) et transplanté par voie sous-cutanée (SC) aux destinataires syngéniques (C57BL/6, 7-9 semaines). Les homogreffes ont ensuite étaient chirurgicalement orthotopically transplanté sur le pancréas de nouvelles souris C57BL/6, ainsi que de la SC-implantation, qui atteint des volumes de 300 à 1 000 mm3 tumeur de 17 jours. Seulement des tumeurs de 400 – 600 mm3 ont été récoltés per opératoire agréé autopsie et nettoyés pour enlever les tissus non-tumeur adjacentes. Ils sont dissociés par protocole utilisant un dissociator tissus dans des suspensions unicellulaires, suivies par la souillure avec panneaux désigné d’anticorps fluorescent marqués pour les différents marqueurs de différentes cellules immunitaires (lymphoïdes, myéloïde et NK, DCs). Les échantillons colorés ont été analysées à l’aide multicolore FACS de déterminer le nombre de cellules immunitaires de lignées différentes, ainsi que leur pourcentage relatif dans les tumeurs. Les profils immunitaires des tumeurs orthotopique sont ensuite comparés à ceux des tumeurs SC. Les données préliminaires ont démontré significativement élevés TILs/TAMs infiltrantes dans les tumeurs sur le pancréas et supérieure infiltration de lymphocytes B orthotopique plutôt que les tumeurs SC.

Implantation orthotopique du CCPP a abouti à la croissance tumorale rapide similaire à celle observée pour l’implantation de SC. Après que les fragments de tumeur de donateurs ont été implantés chez des souris bénéficiaires, tant par voie sous-cutanée et orthotopically selon les protocoles décrits aux étapes 2.1 et 2.2, les tumeurs de homogreffe KPC implantés a démontré une croissance rapide semblable comme sur la Figure 1 a . Les tumeurs de ...

Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry at JoVE.com

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

La procédure expérimentale sur l’immunophénotypage des homogreffes ACPE orthotopique murine vise à présenter le profil immuno-microenvironnement tumoral. Les tumeurs sont orthotopically implanté par la chirurgie. Tumeurs de 200 à 600 mm3 de taille ont été récoltés et dissociées pour préparer des suspensions unicellulaires, suivies d’analyse multi-immunitaire marqueur FACS à l’aide de différents anticorps fluorescent marqués.

Immunophénotypage de homogreffe orthotopique (syngéniques) d’adénocarcinome Ductal pancréatique KPC primaires murines par cytométrie en flux

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Ce message peut aider à répondre à des questions clés dans immunophéotypage dans les modèles Murine, tels que les marqueurs utilisés pour identifier les différentes lignées immunitaires et les stratégies de vieillissement. Le principal avantage de cette technique est que le marqueur et les stategies vieillissantes, lors de l’immunophéotypage, peuvent être appliqués à une variété de modèles murins. Surveillez le poids corporel des souris C57 Black 6 à l’aide d’un équilibre.En outre, surveillez le volume de tumeur des souris variables de donneur de tumeur par mesure de calibre. Après l’euthanasie de l’animal dans une hotte biohazard selon le protocole, stériliser la peau autour de la tumeur à l’aide d’écouvillons Iodophor. Après l’ablation chirurgicale de la tumeur comme indiqué dans le protocole de texte, placez la tumeur dans une boîte de Pétri contenant 20 millilitres de PBS qui a été pré-refroidi à 4 degrés Celsius.S’il y a contamination du sang, transférer la tumeur dans une autre boîte de Pétri et laver la tumeur avec PBS. Couper la tumeur en deux. Enlevez toute peau supplémentaire, les vaisseaux, la calcification et la nécrose.Choisissez seulement des morceaux intacts de tumeur et placez-les dans un tube stérile de centrifugeuse de 50 millilitres. Ajouter 20 millilitres de PBS avant de transporter le tube dans une pièce séparée pour les études en pharmacologie. Pour se préparer à l’implantation orthotopique, fixez une souris entièrement anesthésiée sur un tableau d’expérimentation en position latérale droite.Désinfecter la peau autour de la rate avec de l’idodine, puis dés’ioder avec 75% d’alcool éthylique. Trouvez le point médian de la rate et faites une incision verticale de 1 centimètre sur l’abdomen pour exposer la rate. Retirer délicatement une partie du tissu pancréatique sous la rate à l’aide d’une pince à pointe plate.Et sutro souris homograft morceau de tumeur de la souris C sur le pancréas de la souris destinataire par 9-O suture chirurgicale bsorbable. Fermez l’abdomen avec une suture en soie 6-O par double couture. Atteindre l’homéostasie par compression.Après avoir terminé l’implantation de tumeur, gardez l’animal dans une cage chaude tant qu’aucune fuite de saignement ou de tissu tumoral ne se produit. Surveillez l’animal jusqu’à ce qu’il reprenne suffisamment conscience pour maintenir sa récumbence sternale. Retournez l’animal dans la chambre des animaux après un rétablissement complet après l’anesthésie.Surveillez la tumeur différentes souris en palpant l’abdomen près de la rate et sélectionnez les souris portant des tumeurs orthotopiques. Pour chaque tumeur, préparez un tube C avec tampon de digestion tumorale. Utilisez 3 millilitres de tampon de digestion pour les fragments tumoraux de moins de 0,8 grammes pour s’assurer que la tumeur est entièrement digérée.Étiquetez la tumeur avec le code d’étude, la tumeur, l’identification de souris, le groupe de traitement, et le poids de tumeur. Recueillir la tumeur de la souris. Lavez la tumeur dans le PBS froid et nettoyez le tissu attaché sur la tumeur.Placez la tumeur dans les supports de digestion dans un puits d’une plaque stérile de 6 puits. Maintenez la tumeur en place avec des pinces stériles ou des pinces et tranchez avec un scalpel. Trancher la tumeur assez bien pour se briser en petits morceaux.Maintenant, placez les morceaux de tumeur de nouveau dans le tube C et utilisez le tampon de digestion restant pour laver la plaque. Transférer le liquide dans le tube C et le placer sur la glace jusqu’à la digestion. Ensuite, allumez le dissociateur avec des appareils de chauffage.Placez la dissociation tumorale C-tube à l’envers dans la manche de la position vacante. Ajustez l’état de la position du tube de Free à Selected. Choisissez un programme de dissociation suivi de la sélection du dossier requis où la liste du programme est affichée.Après la fin du programme, enlever le tube C du dissociateur et tourner brièvement pour paletter l’échantillon. Maintenant, suspendez les échantillons et mettez-les dans une passoire cellulaire au-dessus d’un tube de 50 millilitres. Lavez la cellule à travers la passoire cellulaire avec 10 millilitres de tampon de lavage pour fournir une suspension à cellule unique.Après avoir centrifugé le tube à 300 G pendant 5 minutes, jetez le supernatant et suspendez les cellules avec 5 millilitres de tampon de lavage. Comptez les cellules viables et ajustez la concentration cellulaire à 1 million de cellules par tube ou par échantillon. Effectuez la conception du panneau immunitaire, l’immunostaining et la fluorescence moins un contrôle comme détail dans le protocole de texte.Préparez des perles UltraComp pendant que les instruments d’écoulement se réchauffent en les vortexant soigneusement avant utilisation. Étiquetez un tube d’échantillon distinct de 12 x 75 millimètres pour chaque anticorps conjugué fluorochromes. Ajouter 100 microlitres de tampon de coloration à chaque tube suivre par une goutte complète des perles.Ajouter des anticorps et effectuer la procédure de coloration telle que décrite dans le protocole de texte. Ajouter ensuite 0,5 millilitre de tampon de coloration à chaque boule de perles et re-suspendre complètement par vortex. Maintenant, réglez la tension de cytométrie de flux PMT par tissu cible pour l’expérience donnée.Exécutez l’échantillon à travers l’échantillon à travers la cytométrie Flow pour l’acquisition de données en gagnant sur la population de perles singlet par dispersion vers l’avant et les lectures de dispersion latérale. Réglez le débit autour de 200 à 300 événements par seconde. Définissez la compensation appropriée pour un anticorps de conjugaison fitc de fluorescéine donné utilisant une parcelle de point FL1 contre FL1.Placez une porte quadrant de sorte que les perles négatives se trouvent dans le quadrant inférieur gauche et que les perles positives se trouvent dans le quadrant supérieur ou inférieur droit. Ajuster les valeurs de compensation jusqu’à ce que l’intensité médiane de fluorescéine de chaque population soit à peu près égale. Répétez ces étapes pour tous les tubes.Maintenant, procéder à l’acquisition d’échantillons de taches réelles. Exécutez l’assistant de compensation et enregistrez le paramètre avec le format : date, expérience et vos initiales. L’implantation orthotopique de l’adénocarcinome ductal pancréatique a eu comme conséquence la croissance rapide de tumeur semblable à celle vue dans l’implantation sous-cutanée.Des images de coloration représentatives de l’hématoxyline et de l’éosine sont montrées et démontrent une croissance similaire des implants sous-cutanés et orthotopiques. Des rendements raisonnablement élevés de cellules viables ont été obtenu de l’échantillon de tumeur des deux types d’implantation. La splat représentative de FACS montre des cellules viables de la tumeur séparées des cellules mortes et des débris cellulaires.Montré ici, est une tumeur infiltrant une comparaison de profil immunitaire de la population cellulaire majeure et numérique de plusieurs sous-ensembles clés de cellules immunitaires tumorales. L’homogreffe sous-cutanée contre orthotopique du cancer pancréatique sont montrées. Les données montrent clairement que la tumeur ont augmenté de manière significative l’infiltration des cellules immunitaires par rapport au pancréas de souris en bonne santé.En outre, différents pourcentages des sous-ensembles immunisés d’infiltration de tumeur ont été trouvés dans les homogreffes orthotopiques contre sous-cutanées. Par exemple, il y a beaucoup plus de cellules B en orthotopique que sous-cutanée. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de préparer tous les matériaux associés et les reagents à l’avance.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer l’analyse FACS pour les modèles murins.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Fluorescent modèle de souris orthotopique de cancer du pancréas

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Recherche

Recherche en cancérologie

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Un modèle de souris de la fatigue induite par périphérique Irradiation

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Un modèle de souris syngénique Cancer du pancréas pour étudier les effets de l’électroporation irréversible

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Un modèle murin syngénique bioluminescentes et Fluorescent orthotopique du Cancer de la Prostate androgéno-dépendants et résistant à la Castration

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic Transplantation de cellules d’adénocarcinome pulmonaire syngénique pour étudier l’Expression des PD-L1

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Imitant et manipuler une métaplasie acineux-à-canalaire pancréatique en Culture cellulaire 3D

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolement et caractérisation des modèles organoïdes du bassin adénoïque du pancréas dérivé par le patient

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Implantation orthotopique guidée par ultrasons de l'adénocarcinome ductal pancréatique murine

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolement de liquides proximaux pour étudier le microenvironnement tumoral de l’adénocarcinome pancréatique

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

Un modèle murin de résection orthotopique du cancer du pancréas

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...