Name: immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry
Uploaded: 2018-10-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry at JoVE.com

Die Autoren würden Dr. Jody Barbeau - Danke für das kritische lesen und Bearbeitung des Manuskripts und danken Ralph Manuel für die Gestaltung von Kunstwerken. Die Autoren möchten auch die Krone Bioscience Onkologie Immuno-Onkologie Biomarker Team und Onkologie In Vivo -Team, für ihre großen technischen Bemühungen danken.

Alle Protokolle und Zusatzvereinbarungen oder Verfahren, die die Pflege und Verwendung von Tieren werden überprüft und genehmigt durch die Krone Bioscience Tier Heimen und verwenden Committee (IACUC) vor der Durchführung von Studien. Die Pflege und Verwendung von Tieren in der Regel nach internationalen Richtlinien AAALAC (Verein zur Prüfung und Akkreditierung of Laboratory Animal Care) erfolgt wie in der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren, National Research berichtet Rat (2011). Alle tierische ...

<ol>
	<li>Chevrier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Immune+Atlas+of+Clear+Cell+Renal+Cell+Carcinoma.">An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma.</a> Cell. 169 (4), 736-749 (2017).</li><li>Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+immune+responses+in+the+tumor+microenvironment.">Monitoring immune responses in the tumor microenvironment.</a> Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).</li><li>Mosely, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+Selection+of+Syngeneic+Preclinical+Tumor+Models+for+Immunotherapeutic+Drug+Discovery.">Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery.</a> Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).</li><li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+focal+adhesion+kinase+renders+pancreatic+cancers+responsive+to+checkpoint+immunotherapy.">Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy.</a> Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).</li><li>Gunderson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruton+Tyrosine+Kinase-Dependent+Immune+Cell+Cross-talk+Drives+Pancreas+Cancer.">Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer.</a> Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).</li><li>Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+modeling+for+immuno-oncology.">Experimental animal modeling for immuno-oncology.</a> Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).</li><li>Takao, K., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+greatly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).</li><li>Payne, K. J., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-cell+lineage+commitment:+translation+from+mice+to+humans.">Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans.</a> Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>von Herrath, M. G., Nepom, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+translation:+barriers+to+implementing+clinical+immunotherapeutics+for+autoimmunity.">Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity.</a> J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).</li><li>Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+to+evaluate+novel+and+conventional+therapeutic+strategies+for+cancer.">Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer.</a> Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).</li><li>Erdag, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotype+and+immunohistologic+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+are+associated+with+clinical+outcome+in+metastatic+melanoma.">Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma.</a> Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).</li><li>Guti&#233;rrez-Garcia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+and+not+immunophenotypic+algorithms+predicts+prognosis+in+patients+with+diffuse+large+B-cell+lymphoma+treated+with+immunochemotherapy.">Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy.</a> Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).</li><li>Paiva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1/PD-1+presence+in+the+tumor+microenvironment+and+activity+of+PD-1+blockade+in+multiple+myeloma.">PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma.</a> Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).</li><li>Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+nature+of+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice.">Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Landscape+in+Early+Lung+Adenocarcinoma+by+Paired+Single-Cell+Analyses.">Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses.</a> Cell. 169 (4), 750-765 (2017).</li><li>Mahoney, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Antibodies+to+Its+Cytoplasmic+Domain+Most+Clearly+Delineate+Cell+Membranes+in+Immunohistochemical+Staining+of+Tumor+Cells.">PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).</li><li>Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+expression+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+is+a+poor+prognostic+factor+in+patients+with+high+CD8++tumor-infiltrating+lymphocytes:+highly+sensitive+detection+using+phosphor-integrated+dot+staining.">PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining.</a> Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImmunoScore+Signature:+A+Prognostic+and+Predictive+Tool+in+Gastric+Cancer.">ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer.</a> Ann. Surg. , (2016).</li><li>Ribas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+Blockade+Expands+Intratumoral+Memory+T+Cells.">PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).</li></ol>

Obwohl Studien mit SC Tumore leichter durchgeführt werden, können Orthotopically implantierten Tumoren Modelle potenziell relevanter für präklinische pharmakologischen Studien (besonders I/O Untersuchungen) sein, verbesserte Übersetzbarkeit versorgen. Dieser Bericht soll helfen das interessierte Leser/Publikum, dass man direkt die technischen Verfahren zu visualisieren, die in ihrer jeweiligen Forschung verwendet werden können. Unsere Protokolle zeigen, dass orthotopen Implantation der PDAC kann dazu führen, dass ...

Duktales Pankreaskarzinom (PDAC) bewirkt, dass fast eine halbe million Todesfälle weltweit jährlich eines der Top-5-Krebs-Killer. Es gibt einige wirksame Behandlungsmöglichkeiten und keine zugelassenen Immuntherapien; neue Behandlungen sind daher dringend erforderlich. Krebserkrankungen werden zunehmend als immunologische Erkrankungen, einschließlich PDAC, zusätzlich zu den Erbkrankheiten, wie heute bekannt anerkannt wird. Immunologische und genetische Faktoren würde wahrscheinlich feststellen, Prognose sowie Behandlung Ergebnisse. Tumoren Host immunüberwachung umgehen und schließlich vorrücken, um zum Tod führen. Viele dieser immun Prozesse treten innerhalb der Tumor Mikroumgebung (TME)1,2,3,4 wo verschiedene Arten von Immunzellen zu interagieren, mit Tumorzellen, miteinander und mit anderen tumor Stromazellen Komponenten direkt oder indirekt über Zytokine die Krankheit Ergebnis letztlich zu bestimmen. Charakterisierung der Tumor immun Komponenten des TME oder Tumor Immunphänotypisierung, einschließlich Subtypisierung, Nummerierung und Lokalisierung von verschiedenen Linien von Immunzellen, ist daher entscheidend für Anti-Tumor Immunität zu verstehen. Im Falle der PDAC, es wurde vorgeschlagen, die erhöhte Tumor infiltrieren suppressive Makrophagen (TAM) und B-Zellen zur Vermeidung von T-Zell-Infiltration und/oder Aktivierung und ein hohes Maß von Fibrose5,6geführt haben.
Das gemeinsame Konzept zu immun TMEs experimentell untersucht Surrogat Tumor präklinischen Tiermodellen verwenden würden, vor allem relevanten Maus Tumor Modelle7, besonders Maus Phänomen (Homograft) oder gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMM) Krebserkrankungen, auf die vermeintlichen Ähnlichkeit von Maus und Mensch für Tumoren und Immunität8,9. Es ist in Wirklichkeit verstanden, dass es angeborene Unterschiede zwischen den beiden Arten10,11.
Transplantierten Maus Tumoren haben erhebliche betriebliche Vorteile gegenüber spontanen Tumoren7, nämlich synchronisierte Tumorentwicklung, im Gegensatz zu den elterlichen GEMM spontane Tumorentwicklung. Bestätigung der spontanen murinen Tumoren gelten Primärtumoren gewesen nie manipuliert, in Vitround Spiegelung original Maus Tumor Histo- / Molekulare Pathologie7sowie möglichen immun Profile. Diese murinen Homografts gelten oft als "eine Maus Version des Patienten abgeleitet Xenotransplantate (PDXs)". Sie haben daher wahrscheinlich eine bessere Übersetzbarkeit als konventionelle Phänomen Zelle Linie abgeleitet Maus Tumoren12. Vor allem sind viele Homografts abgeleitet spezifische GEMM bestimmte menschliche Krankheitsmechanismen, z. B. Onkogenen Fahrer Mutationen sind so konstruiert, wobei diese Bestätigung sollte daher Vorteile auf ihre klinische Relevanz haben. Insbesondere entwickeln die KPC GEMM Maus PDAC innerhalb von 15 – 20 Wochen alt, die morphologisch rekapituliert menschlichen Erkrankungen mit überwiegend gut bis mäßig-differenzierten glandulären Architektur und hochangereichertes Stroma. Dieses Modell rekapituliert auch die häufigsten genetischen Eigenschaften der menschlichen PDAC, nämlich Kras aktivierende Mutation und P53 Verlust der Funktion, die in 90 % und 75 % der menschlichen PDAC, jeweils5,6auftreten.
Standorte der Transplantation sind auch vorgeschlagen worden, eine Rolle im Modell Übersetzbarkeit. Die spezifische Gewebe Umgebung, wie z. B. eine entsprechende orthotopen Umgebung könnte eine Nische für bestimmte Tumoren, Fortschritt, im Gegensatz zu der einheitlichen subkutaner (SC) Umgebungen für die häufigsten transplantierten Tumoren. Es wäre von besonderem Interesse wird bzw. was für einen Unterschied zwischen den beiden Standorten der Transplantation, in Bezug auf die immun-Mikroumgebung und die Relevanz für Krebserkrankungen, z.B.existiert. im Falle der PDAC.
Einer der wichtigsten Aspekte der immun Profilierung oder Immunphänotypisierung, soll Tumor infiltrieren Immunzellen der verschiedenen Linien, Nummern, relative Anteil innerhalb von Tumoren, sowie ihren Aktivierungsstatus und Standorte bestimmen. Dazu gehören Tumor-Infiltratrating Lymphoctyes (TILs, T- und B-), Tumor infiltrieren Makrophagen (TAMs), Tumor infiltrieren natürlichen Killer-Zellen (NKs) und Tumor-Resident dendritischen Zellen3,13,14 , 15 , 16 , 17und die subzelluläre Lokalisation von bestimmten Zellen18,19,20, etc.. Fluoreszenz aktiviert Zelle Sortieren (FACS) oder Flow Cytometry ist eine einzellige Detection-Technologie, die häufig verwendet wird, um die spezifischen Parameter einer Zelle messen. Multi-Color flow Cytometry Maßnahmen mehrere Markierungen auf eine einzelne Zelle3,4,21 und ist die am häufigsten verwendete Methode zur Bestimmung der Zahlen und relativen Prozentsatz von verschiedenen Untergruppen von Immunzellen, auch innerhalb der Tumoren.
Dieser Bericht beschreibt die Verfahren für die Profilerstellung Tumor infiltrieren Immunzellen: 1) Implantation des orthotopen PDAC Maus Tumor Homografts, zusammen mit SC Implantation; (2) Tumor Gewebe Ernte und Vorbereitung der Einzelzelle über Tumor Dissoziation; (3) Flow Cytometry Analyse aller von den Zellen von Tumoren als Basislinie abgeleitet; (4) Vergleich der Baseline profile beider Transplantation Ansätze.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine</td>
			<td>\</td>
			<td>SAS3119</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trocar 20</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>2mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotic and antimycotic</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Air chemical</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood</td>
			<td>AIRTECH</td>
			<td>BSC-1300IIA2</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibodies</td>
			<td>BD</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration</td>
			<td>BD</td>
			<td>354248</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffers</td>
			<td>BD</td>
			<td>554656</td>
			<td>Mincing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Staining Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>563794</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td>553142</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell filters</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>70&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>routine blood tube</td>
			<td>BD-Vacutainer</td>
			<td>365974</td>
			<td>2mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>vs 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3 Fix/Perm kit</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810R,5920R</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td>\</td>
			<td>vs 10.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable, sterile scalpels</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J12100</td>
			<td>11#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife handle</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J11010</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>Y00030</td>
			<td>Eye scissors 10cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>JD1060</td>
			<td>Eye tweezers 10cm with teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable liquid nitrogen tank</td>
			<td>Jinfeng</td>
			<td>YDS-175-216</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Metter Toledo</td>
			<td>AL204</td>
			<td>0-100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi C-tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi Gentle MACS with heater blocks</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-018-306</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryopreservation tube</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME</td>
			<td>PathClear</td>
			<td>3442-005-01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringes</td>
			<td>Shanghai MIWA medical industry</td>
			<td>\</td>
			<td>1-5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog software</td>
			<td>Studylog</td>
			<td>\</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Balance and supporting USB</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>SE601F</td>
			<td>Balance and supporting USB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Data line of vernier calipers</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>926.6721</td>
			<td>Data line of vernier calipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>910.1502.10</td>
			<td>Sylvac S-Cal pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339653</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339651</td>
			<td>15mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>KLCS-288</td>
			<td>4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PLF-276</td>
			<td>&#8212;20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>DW-862626</td>
			<td>&#8212;80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>am7021</td>
			<td>\</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry

Homograft (Phänomen) Tumoren sind das "Arbeitspferd" der heutigen Immuno-Onkologie (e/a) präklinischen Forschung. Der Tumor Mikroumgebung (TME), besonders seine immun-Komponenten ist entscheidend für die Prognose und Vorhersage der Behandlungsergebnisse, insbesondere der Immuntherapie. TME immun-Komponenten bestehen aus verschiedenen Untergruppen von Tumor infiltriert Immunzellen bewertbar durch mehrfarbige FACS. Duktales Pankreaskarzinom (PDAC) zählt zu den tödlichsten Malignances fehlen gute Behandlungsmöglichkeiten, so eine dringende und ungedeckten medizinischen Bedarf. Ein wichtiger Grund für seine nicht-Reaktion auf verschiedene Therapien (Chemo-, gezielte, I/O) wurde seine reichlich TME, bestehend aus Fibroblasten und Leukozyten, die Tumorzellen von den Therapien zu schützen. Orthotopically implantierten PDAC geglaubt wird, um mehr genau zurückzuerobern TME der menschlichen pankreaskarzinome als herkömmliche subkutaner (SC) Modelle.
Homograft Tumoren (KPC) sind Transplantationen von Maus spontane PDAC aus gentechnisch KPC-Mäuse (K-RasG12D / +/P53- / -/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). Der primäre Tumor-Gewebe ist schneiden Sie in kleine Fragmente (~ 2 mm3) und subkutan transplantiert (SC) an das Phänomen Empfänger (C57BL/6, 7 – 9 Wochen alt). Die Homografts wurden dann chirurgisch Orthotopically verpflanzt auf die Bauchspeicheldrüse von neuen C57BL/6 Mäusen zusammen mit SC-Implantation, die Tumor-Volumen von 300-1.000 mm3 von 17 Tagen erreicht. Nur Tumoren von 400 – 600 mm3 wurden gemäß dem genehmigten Autopsie Verfahren geerntet und gereinigt, um die angrenzenden keinen Tumor-Gewebe zu entfernen. Sie wurden getrennt pro Protokoll mit einem Gewebe Dissociator in einzellige Suspensionen, gefolgt von Färbungen mit dafür vorgesehenen Platten von eindringmittel-markierten Antikörpern für verschiedene Marker von verschiedenen Immunzellen (lymphoide, myeloischen und NK, DCs). Die gefärbten Proben wurden analysiert mit multi-Color FACS um Zahlen von Immunzellen der verschiedenen Linien, sowie ihr relativer Anteil innerhalb von Tumoren zu bestimmen. Die immun Profile der orthotopen Tumoren wurden dann mit den SC Tumoren verglichen. Die vorläufigen Daten bewiesen deutlich erhöhten eindringende TILs/TAMs in Tumoren in der Bauchspeicheldrüse und höhere B-Zell-Infiltration in Orthotopic anstatt SC Tumoren.

Orthotopen Implantation der PDAC führte zu schnelle Tumorwachstum ähnlich gesehen für die SC-Implantation. Nachdem die Spender Tumor Fragmente in Empfänger Mäuse implantiert wurden sowohl subkutan und Orthotopically gemäß den Protokollen beschrieben Schritte 2.1 und 2.2, die implantierten KPC Homograft Tumoren gezeigt ähnlich rasant wie in Abbildung 1A . KPC Homograft Tumoren zu unterschiedlichen Zeitpunkten geerntet sind in Abbil...

Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry at JoVE.com

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Die Versuchsdurchführung auf die Immunphänotypisierung der murinen orthotopen PDAC Homografts bezweckt die Profilierung der Tumor Immuno-Mikroumgebung. Tumoren sind Orthotopically über Operation implantiert. Tumoren von 200 – 600 mm3 in der Größe wurden geerntet und distanzierte um einzellige Suspensionen, gefolgt von Multi-immun FACS Markeranalyse mit verschiedenen fluoreszent-markierten Antikörpern vorzubereiten.

Die Immunphänotypisierung der Orthotopen Homograft (Phänomen) der murinen primäre KPC duktales Pankreaskarzinom durch Durchflusszytometrie

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Diese Meldung kann helfen, wichtige Fragen in Immunophenotypisierung in Murine-Modellen zu beantworten, wie Marker verwendet, um verschiedene Immunitätslinien und Alterungsstrategien zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass der Marker und die Alterungs-Stategies, wenn Dieimmunonotypisierung, auf eine Vielzahl von murinen Modellen angewendet werden können. Überwachen Sie das Körpergewicht von C57 Black 6 Mäusen mit einem Gleichgewicht.Überwachen Sie auch das Tumorvolumen von Tumor-verschiedenen Spendermäusen durch Kalibermessung. Nach der Euthanasie des Tieres in einer Biohazard-Haube nach Protokoll, sterilisieren Sie die Haut um den Tumor mit Iodophor Tupfer. Nach der chirurgischen Entfernung des Tumors, wie im Textprotokoll beschrieben, legen Sie den Tumor in eine Petrischale mit 20 Milliliter PBS, die auf 4 Grad Celsius vorgekühlt wurde.Wenn es verunreinigendes Blut gibt, übertragen Sie den Tumor in eine andere Petrischale und waschen Sie den Tumor mit PBS. Den Tumor halbieren. Entfernen Sie zusätzliche Haut, Gefäße, Verkalkung und Nekrose.Wählen Sie nur intakte Tumorstücke und legen Sie sie in ein steriles 50 Milliliter Zentrifugenrohr. Fügen Sie 20 Milliliter PBS hinzu, bevor Sie das Rohr in einen separaten Tierraum für Pharmakologie-Studien transportieren. Um sich auf die orthotopische Implantation vorzubereiten, fixieren Sie eine voll anästhesische Maus auf einem Experimentierbrett in der rechten seitlichen Position.Desinfizieren Sie die Haut um die Milz mit Idod und deiodiieren Sie dann mit 75% Ethylalkohol. Finden Sie den Medianpunkt der Milz und machen Sie einen 1 Zentimeter vertikalen Schnitt am Bauch, um die Milz freizulegen. Ziehen Sie vorsichtig einen Teil des Bauchspeicheldrüsengewebes unter der Milz mit einer flachen Zehenpinzette heraus.Und Sutro-Maus homograft Tumorstück von der C-Maus auf die Bauchspeicheldrüse der Empfängermaus durch 9-O bsorbable chirurgische Naht. Schließen Sie den Bauch mit einer 6-O Seidennaht mit Doppelnaht. Erreichen Sie Homöostase durch Kompression.Nach Beendigung der Tumorimplantation, halten Sie das Tier in einem warmen Käfig, solange keine Blutungen oder Tumorgewebe Leckagen auftreten. Überwachen Sie das Tier, bis sie genügend Bewusstsein zurückgewinnen, um die Brustbesinnung aufrechtzuerhalten. Bringen Sie das Tier nach vollständiger Genesung von der Anästhesie in den Tierraum zurück.Überwachen Sie die Tumor-Mäuse, indem Sie den Bauch in der Nähe der Milz palepating und wählen Sie die Mäuse mit orthotopischen Tumoren. Für jeden Tumor eine C-Röhre mit Tumorverdauungspuffer vorbereiten. Verwenden Sie 3 Milliliter Verdauungspuffer für Tumorfragmente unter 0,8 Gramm, um sicherzustellen, dass der Tumor vollständig verdaut ist.Kennzeichnen Sie den Tumor mit dem Studiencode, Tumor, Maus-ID, Behandlungsgruppe und Tumorgewicht. Sammeln Sie den Tumor von der Maus. Waschen Sie den Tumor in kalten PBS und reinigen Sie das Amtuum andenten Gewebe.Stellen Sie den Tumor in Verdauungsmedien in einen Brunnen einer sterilen 6-Well-Platte. Halten Sie den Tumor an Ort und Stelle mit steriler Pinzette oder Zange und schneiden Sie mit einem Skalpell. Schneiden Sie den Tumor gut genug, um in kleinere Stücke zu brechen.Legen Sie nun die Tumorstücke wieder in das C-Rohr und verwenden Sie den restlichen Verdauungspuffer, um die Platte zu waschen. Übertragen Sie die Flüssigkeit in die C-Röhre und legen Sie sie bis zur Verdauung auf Eis. Schalten Sie dann den Dissoziator mit Heizungen ein.Legen Sie die Tumordissoziation C-Rohr kopfüber in die Hülse der freien Position. Passen Sie den Status der Rohrposition von Frei auf Ausgewählt an. Wählen Sie ein Dissoziationsprogramm folgen durch die Auswahl des erforderlichen Ordners, in dem die Liste des Programms angezeigt wird.Nach Beendigung des Programms nehmen Sie C-Rohr aus dem Dissoziator und drehen Sie kurz, um die Probe zu palettieren. Nun setzen Sie die Proben wieder auf und legen Sie sie in ein Zellsieb über einem 50 Milliliter-Rohr. Waschen Sie die Zelle durch das Zellsieb mit 10 Milliliter Waschpuffer, um eine Einzelzellsuspension zu bieten.Nach dem Zentrifugieren des Rohres bei 300 G für 5 Minuten den Überstand entsorgen und die Zellen mit 5 Milliliter Waschpuffer wieder aufhängen. Zählen Sie lebensfähige Zellen und passen Sie die Zellkonzentration auf 1 Million Zellen pro Tube oder pro Probe an. Führen Sie Immunpanel-Design, Immunostaining und Fluoreszenz minus eine Steuerung als Detail im Textprotokoll durch.Bereiten Sie UltraComp Perlen vor, während sich die Strömungsinstrumente aufwärmen, indem Sie sie vor dem Gebrauch gründlich wirbeln. Beschriften Sie ein separates 12 x 75-Millimeter-Probenröhrchen für jeden fluorchromen konjugierten Antikörper. Fügen Sie 100 Mikroliter Färbung Puffer zu jedem Rohr folgen durch einen vollen Tropfen der Perlen.Fügen Sie Antikörper hinzu, und führen Sie das Färbeverfahren wie im Textprotokoll beschrieben durch. Dann 0,5 Milliliter Färbepuffer zu jedem Perlenpellet hinzufügen und über Wirbel vollständig wieder aufhängen. Legen Sie nun die PmT-Spannung der Durchflusszytometrie pro Zielgewebe für das gegebene Experiment fest.Führen Sie die Probe durch die Probe durch die Flow-Zytometrie zur Datenerfassung, indem Sie die Singlet-Perlenpopulation pro Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung gewinnen. Legen Sie die Durchflussrate um 200 bis 300 Ereignisse pro Sekunde fest. Legen Sie die entsprechende Kompensation für einen bestimmten Fluorescein-FITC-Konjugationsantikörper mithilfe eines FL1-gegen-FL1-Punktdiagramms fest.Platzieren Sie ein Quadrantentor, so dass sich die negativen Perlen innerhalb des unteren linken Quadranten und die positiven Perlen innerhalb des oberen oder unteren rechten Quadranten befinden. Passen Sie die Kompensationswerte an, bis die mittlere Fluoresceinintensität jeder Population ungefähr gleich ist. Wiederholen Sie diese Schritte für alle Rohre.Fahren Sie nun mit dem Erwerb tatsächlicher Fleckenproben fort. Führen Sie den Vergütungs-Assistenten aus, und speichern Sie die Einstellung mit dem Format:datum, experiment und Ihren Initialen. Orthotopische Implantation des pankreasischen duktodalen Adenokarzinoms führte zu einem schnellen Tumorwachstum ähnlich dem bei subkutaner Implantation.Repräsentative Hämatoxylin- und Eosin-Färbungsbilder werden gezeigt und zeigen ein ähnliches Wachstum von subkutanen und orthotopischen Implantaten. Einigermaßen hohe lebensfähige Zellerträge wurden aus der Tumorprobe beider Arten der Implantation erhalten. Die repräsentative FACS-Splat zeigt lebensfähige Zellen aus Tumoren, die von den abgestorbenen Zellen und Zellablagerungen getrennt sind.Hier gezeigt, ist ein Tumor infiltriert einen Immunprofilvergleich der Haupt- und Zählerzellpopulation mehrerer wichtiger Teilmengen von Tumorimmunzellen. Gezeigt werden subkutane versus orthotopische Homograft von Bauchspeicheldrüsenkrebs. Die Daten zeigen deutlich, dass der Tumor die Infiltration von Immunzellen im Vergleich zur Bauchspeicheldrüse gesunder Mäuse deutlich erhöht hat.Darüber hinaus wurden verschiedene Prozentsätze von Tumor infiltrierenden Immunzell-Untergruppen in orthotopischen versus subkutanen Homograften gefunden. Beispielsweise gibt es im orthotopischen als in subkutanen Zellen deutlich mehr B-Zellen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, alle zugehörigen Materialien und Reagenzien im Voraus vorzubereiten.Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie FACS-Analysen für murine Modelle durchführen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Fluoreszierende orthotopen Mausmodell des Bauchspeicheldrüsenkrebs

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Forschung

Krebsforschung

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Ein Maus-Modell der Fatigue, induziert durch Peripheral Bestrahlung

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Ein Phänomen Bauchspeicheldrüsenkrebs-Maus-Modell zur Untersuchung der Auswirkungen der Irreversible Electroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Eine Fluoreszenz und Biolumineszenz orthotopen Phänomen Mausmodell der Androgen-abhängige und Kastration-resistenten Prostatakrebs

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopen Transplantation von Phänomen Lungenzellen Adenokarzinom, PD-L1 Ausdruck zu studieren

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Nachahmung und Manipulation von pankreatischen Acinar-duktale Metaplasie im 3-dimensionalen Zellkultur

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolierung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten Pankreas-Ductal Adenokarzinom-Organoidmodellen

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultraschallgeführte orthotopische Implantation von murine Pankreas-Ductalsocarcinom

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolierung proximaler Flüssigkeiten zur Untersuchung der Tumormikroumgebung des Pankreas-Adenokarzinoms

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

Ein orthotopisches Resektions-Mausmodell für Bauchspeicheldrüsenkrebs

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...