Name: immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry
Uploaded: 2018-10-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry at JoVE.com

המחברים מודים ד ר ג'ודי בארבו - קריאה ועריכה ביקורתית של כתב היד, ותודה ראלף מנואל לעיצוב יצירות אמנות. המחברים רוצה גם להודות את הכתר Bioscience אונקולוגיה חיסונית-אונקולוגיה סמן צוות וצוות אונקולוגיה Vivo ב , על מאמציהם טכני נהדר.

כל הפרוטוקולים, amendment(s) או הליכים הכוללים את הטיפול ואת השימוש בבעלי חיים נבדקו ואושרו על-ידי הכתר Bioscience מוסדיים בעלי חיים והטיפול הוועדה להשתמש (IACUC) לפני התנהלות של מחקרים. הטיפול ואת השימוש בבעלי חיים בדרך כלל תיעשה בהתאם להנחיות בינלאומיות AAALAC (האגודה הערכה וטיפול הסמכה של מעבדה חיה) כפ?...

<ol>
	<li>Chevrier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Immune+Atlas+of+Clear+Cell+Renal+Cell+Carcinoma.">An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma.</a> Cell. 169 (4), 736-749 (2017).</li><li>Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+immune+responses+in+the+tumor+microenvironment.">Monitoring immune responses in the tumor microenvironment.</a> Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).</li><li>Mosely, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+Selection+of+Syngeneic+Preclinical+Tumor+Models+for+Immunotherapeutic+Drug+Discovery.">Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery.</a> Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).</li><li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+focal+adhesion+kinase+renders+pancreatic+cancers+responsive+to+checkpoint+immunotherapy.">Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy.</a> Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).</li><li>Gunderson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruton+Tyrosine+Kinase-Dependent+Immune+Cell+Cross-talk+Drives+Pancreas+Cancer.">Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer.</a> Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).</li><li>Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+modeling+for+immuno-oncology.">Experimental animal modeling for immuno-oncology.</a> Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).</li><li>Takao, K., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+greatly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).</li><li>Payne, K. J., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-cell+lineage+commitment:+translation+from+mice+to+humans.">Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans.</a> Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>von Herrath, M. G., Nepom, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+translation:+barriers+to+implementing+clinical+immunotherapeutics+for+autoimmunity.">Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity.</a> J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).</li><li>Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+to+evaluate+novel+and+conventional+therapeutic+strategies+for+cancer.">Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer.</a> Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).</li><li>Erdag, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotype+and+immunohistologic+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+are+associated+with+clinical+outcome+in+metastatic+melanoma.">Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma.</a> Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).</li><li>Guti&#233;rrez-Garcia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+and+not+immunophenotypic+algorithms+predicts+prognosis+in+patients+with+diffuse+large+B-cell+lymphoma+treated+with+immunochemotherapy.">Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy.</a> Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).</li><li>Paiva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1/PD-1+presence+in+the+tumor+microenvironment+and+activity+of+PD-1+blockade+in+multiple+myeloma.">PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma.</a> Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).</li><li>Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+nature+of+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice.">Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Landscape+in+Early+Lung+Adenocarcinoma+by+Paired+Single-Cell+Analyses.">Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses.</a> Cell. 169 (4), 750-765 (2017).</li><li>Mahoney, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Antibodies+to+Its+Cytoplasmic+Domain+Most+Clearly+Delineate+Cell+Membranes+in+Immunohistochemical+Staining+of+Tumor+Cells.">PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).</li><li>Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+expression+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+is+a+poor+prognostic+factor+in+patients+with+high+CD8++tumor-infiltrating+lymphocytes:+highly+sensitive+detection+using+phosphor-integrated+dot+staining.">PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining.</a> Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImmunoScore+Signature:+A+Prognostic+and+Predictive+Tool+in+Gastric+Cancer.">ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer.</a> Ann. Surg. , (2016).</li><li>Ribas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+Blockade+Expands+Intratumoral+Memory+T+Cells.">PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).</li></ol>

למרות מחקרים באמצעות גידולים SC מתנהלים יותר בקלות, orthotopically מושתל גידולים מודלים עלולה להיות רלוונטיים יותר ללימודי פרמקולוגיה פרה (במיוחד חקירות קלט/פלט) כדי לספק translatability משופר. דו ח זה מטרתו לעזור לקוראים/הקהל מעוניין להיות מסוגל לבצע את ההליכים טכני יכול לשמש במחקר שלהם בהתאמה. הפרוטוק...

אדנוקרצינומה ductal הלבלב (PDAC) גורמת כמעט חצי מיליון בהירושימה ברחבי העולם מדי שנה, אחד הרוצחים סרטן ראש 5. ישנם כמה אפשרויות טיפול יעיל, אין immunotherapies שאושרו; לכן, טיפולים חדשים נדרשים נואשות. הם יותר ויותר להכרה סרטן מחלות חיסוניות, כולל PDAC, בנוסף מחלות גנטיות כפי הידוע כיום. גורמים גנטיים אימונולוגי היה סביר לקבוע פרוגנוזה מחלת, כמו גם טיפול תוצאות. גידולים להתחמק מעקב המערכת החיסונית המארח, בסופו של דבר לקדם לגרימת מוות. רבים של תהליכים חיסוניים אלה מתרחשות בתוך microenvironment הגידול (טיים)1,2,3,4 איפה סוגים שונים של תאים חיסוניים אינטראקציה עם תאים סרטניים, אחד עם השני ועם הגידול אחרים רכיבים סטרומה, ישירות או בעקיפין באמצעות ציטוקינים, אשר בסופו של דבר לקבוע התוצאה המחלה. לכן, אפיון מרכיבי מערכת החיסון של הגידול של טיים או גידול immunophenotyping, כולל subtyping, ספירה, לוקליזציה של שושלות שונות של תאים חיסוניים, חיוני להבנת אנטי הגידול חסינות. במקרה של PDAC, שהוא הוצע כי גבוהות גידולים הסתננות מדכאים מקרופאגים (TAM), תאי-B הובילו למניעת הסתננות T-cell ו/או הפעלה של רמות גבוהות של פיברוזיס5,6.
הגישה הנפוצה חוקרים TMEs המערכת החיסונית השפעול יהיה להשתמש במודלים בבעלי חיים פרה הגידול הפונדקאית, רלוונטי בעיקר העכבר הגידול מודלים7, במיוחד העכבר syngeneic (מאותו מין) או מודלים מהונדס גנטית עכבר (GEMM) סוגי סרטן, על הדמיון המשוערת של האדם עבור גידולים, חסינות8,9של עכבר. . זה מובן במציאות כי ישנם ההבדלים הטבועים בין שני המינים10,11
גידולים העכבר המושתלים יש יתרונות תפעוליים על פני גידולים ספונטניים7, כלומר גידול מסונכרן פיתוח, בניגוד התפתחות הגידול ספונטנית GEMM הורים. Homografts של גידולים מאתר ספונטנית נחשבים גידולים העיקרי שהיה מעולם לא מניפולציה במבחנה, שיקוף המקורי העכבר הגידול היסטו- / מולקולרי פתולוגיה7, כמו גם פרופיל החיסונית אפשרי. Homografts מאתר אלה נחשבים לעתים קרובות "גרסה העכבר של החולה, נגזר xenografts (PDXs)". לכן סביר להניח להם translatability טוב יותר מאשר קונבנציונאלי תא syngeneic העכבר קו-derived גידולים12. בפרט, homografts רבות נגזרות GEMM ספציפי שבו מנגנוני מחלות אנושיות מסוימות, למשל הנהג oncogenic מוטציות, מתוכננים, homografts אלה כדאי לכן יש יתרונות הרלוונטיות הקלינית שלהם. בפרט, KPC GEMM לפתח העכבר PDAC תוך 15-20 שבועות של גיל, אשר מורפולוגית recapitulates מחלות אנושיות האדריכלות יוכפל לאחר המרתו טוב - עד בינוני-הבדיל הבלוטות והעשירו מאד משתית. מודל זה recapitulates גם את התכונות גנטי הנפוצים ביותר של PDAC אנושי, כלומר קראס. מפעיל את המוטציה ותפקוד P53 אובדן-של-, אשר מתרחשים 90% ו 75% של PDAC אנושי, בהתאמה5,6.
אתרים של השתלת גם שהוצעו כדי לשחק תפקיד דגם translatability. ספציפיים לרקמות הסביבה, כגון סביבת orthotopic המתאימים, יכול להיות נישה אקולוגית עבור גידולים ספציפיים לסביבות התקדמות, בניגוד אחיד תת עורית (SC) עבור גידולים מושתל בדרך כלל. זה יהיה עניין מיוחד אם, ו/או, מה ההבדל הקיים בין שני האתרים השתלת, במונחים של החיסון-microenvironment, ועולה סרטן אנושי, למשל. במקרה של PDAC.
אחד ההיבטים החשובים ביותר של פרופיל החיסונית או immunophenotyping, הוא לקבוע גידולים הסתננות התאים החיסוניים של שושלות שונות, המספרים, האחוז היחסי בתוך גידולים, כמו גם שלהם הפעלה מצבים ומיקומים. זה כולל את הגידול-infiltratrating lymphoctyes (הפדגוגי, T - וגם B-), גידולים הסתננות מקרופאגים (תאמי), גידולים הסתננות תאים הרוצח הטבעי (NKs), גידול תושב הדנדריטים תאים3,13,14 , 15 , 16 , 17, לוקליזציה subcellular של תאים18,19,20מסויימים, וכו '. קרינה פלואורסצנטית מופעל התא מיון (FACS) או זרימה cytometry היא טכנולוגיה זיהוי תא בודד המשמש בדרך כלל כדי למדוד את הפרמטרים הספציפיים של תא. צבע רב flow cytometry אמצעים מספר סמני ב4,3,תא בודד21 , היא השיטה הנפוצה ביותר כדי לקבוע את המספרים ואת האחוז היחסי של קבוצות משנה שונים של תאים חיסוניים, כולל אלה בתוך גידולים.
הדו ח מתאר הליכים עבור פרופיל גידולים הסתננות התאים החיסוניים: 1) השתלה של orthotopic PDAC העכבר גידול homografts, יחד עם ההשתלה SC; 2) גידול רקמות הקציר והכנות תא בודד באמצעות הגידול דיסוציאציה; 3) ניתוח cytometry זרימה של כל התאים נגזר גידולים כקו; 4) השוואה של פרופילים בסיסית של שתי הגישות השתלת.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine</td>
			<td>\</td>
			<td>SAS3119</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trocar 20</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>2mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotic and antimycotic</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Air chemical</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood</td>
			<td>AIRTECH</td>
			<td>BSC-1300IIA2</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibodies</td>
			<td>BD</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration</td>
			<td>BD</td>
			<td>354248</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffers</td>
			<td>BD</td>
			<td>554656</td>
			<td>Mincing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Staining Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>563794</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td>553142</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell filters</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>70&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>routine blood tube</td>
			<td>BD-Vacutainer</td>
			<td>365974</td>
			<td>2mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>vs 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3 Fix/Perm kit</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810R,5920R</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td>\</td>
			<td>vs 10.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable, sterile scalpels</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J12100</td>
			<td>11#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife handle</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J11010</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>Y00030</td>
			<td>Eye scissors 10cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>JD1060</td>
			<td>Eye tweezers 10cm with teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable liquid nitrogen tank</td>
			<td>Jinfeng</td>
			<td>YDS-175-216</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Metter Toledo</td>
			<td>AL204</td>
			<td>0-100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi C-tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi Gentle MACS with heater blocks</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-018-306</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryopreservation tube</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME</td>
			<td>PathClear</td>
			<td>3442-005-01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringes</td>
			<td>Shanghai MIWA medical industry</td>
			<td>\</td>
			<td>1-5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog software</td>
			<td>Studylog</td>
			<td>\</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Balance and supporting USB</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>SE601F</td>
			<td>Balance and supporting USB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Data line of vernier calipers</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>926.6721</td>
			<td>Data line of vernier calipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>910.1502.10</td>
			<td>Sylvac S-Cal pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339653</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339651</td>
			<td>15mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>KLCS-288</td>
			<td>4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PLF-276</td>
			<td>&#8212;20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>DW-862626</td>
			<td>&#8212;80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>am7021</td>
			<td>\</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry

גידולים מאותו מין (syngeneic) הם סוס עבודה של מחקר פרה חיסונית-אונקולוגיה (i/O) של היום. הגידול microenvironment (טיים), במיוחד את החיסון-מרכיביו, חיוני הפרוגנוזה ותחזית של תוצאות הטיפול, בעיקר אלה של חיסוני. טיים החיסון-רכיבים מורכבים שונים קבוצות משנה של גידולים הסתננות התאים החיסוניים למהירים על ידי צבע רב FACS. אדנוקרצינומה ductal הלבלב (PDAC) נמנית malignances הקטלני חסר אפשרויות טיפול טוב, ובכך קליניות ודחופים צורך רפואי. אחת הסיבות שלה ללא-ההיענות לטיפולים שונים (כימותרפיה-, ממוקד, קלט/פלט) חשוב כבר טיים שלו שופע, המורכב fibroblasts ו לויקוציטים להגן על תאים סרטניים של טיפולים אלה. Orthotopically מושתל PDAC הוא האמין יותר במדויק לשחזר את טיים ממקרי סרטן הלבלב האנושית מאשר קונבנציונאלי מודלים (SC) תת עורית.
גידולים מאותו מין (KPC) הם השתלות של העכבר ספונטנית PDAC שמקורם KPC-עכברים מהונדסים גנטית (KrasG12D / +/ /Pdx1-53- / -PCre) (KPC-GEMM). רקמת הגידול העיקרי הוא חתוך לחלקים קטנים (3~ 2 מ מ), מושתלים subcutaneously (SC) לנמענים syngeneic (C57BL/6, 7 – 9 שבועות). Homografts היו אז בניתוח orthotopically מושתלים לתוך הלבלב של עכברים C57BL/6 חדשים, יחד עם SC-השרשה, אשר הגיעו הגידול כרכים של 300-1000 מ מ3 ימים 17. רק גידולים של 400 – 600 מ מ3 היו שנקטפו לכל הליך הנתיחה שאושרו וניקה להסיר רקמות הגידול שאינם סמוכים. הם היו הפומבית לכל פרוטוקול באמצעות dissociator של הרקמה לתוך תא בודד המתלים, ואחריו מכתים עם לוחות המיועדים שכותרתו fluorescently נוגדנים עבור סמנים שונים של תאים חיסוניים שונים (הלימפה, מיאלואידית ו NK, בקרי קבוצת מחשבים). הדגימות מוכתם נותחו באמצעות צבע רב FACS כדי לקבוע מספרים של תאים חיסוניים של שושלות שונות, כמו גם את האחוזים היחסיים שלהם בתוך גידולים. הפרופילים המערכת החיסונית של גידולים orthotopic הושוו לאלה של גידולים SC. המידע הראשוני הפגינו גבוהות באופן משמעותי שחדר הפדגוגי/תאמי גידולים של הלבלב, ושל חדירה B-cell גבוה יותר orthotopic מאשר גידולים SC.

Orthotopic השרשה של PDAC הביא הגידול מהיר דומה כי ראיתי להשתלה SC. אחרי השברים הגידול התורם שהיו מושתלים לתוך עכברים הנמען, הן subcutaneously orthotopically לפי הפרוטוקולים שתואר בשלבים 2.1 ו- 2.2, גידולים מאותו מין KPC מושתל הפגינו דומה צמיחה מהירה כפי שמוצג איור 1A . גידולים מאותו מ...

Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry at JoVE.com

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

ההליך ניסיוני-immunophenotyping של orthotopic מאתר PDAC homografts שמטרתה יצירת פרופיל חיסונית-microenvironment את הגידול. גידולים הם orthotopically מושתל באמצעות ניתוח. גידולים של 200-600 מ מ3 בגודל היו קוצרים, הפומבית להכין המתלים מתא בודד, שלאחריה יבוא ניתוח רב המערכת החיסונית סמן FACS באמצעות נוגדנים שונים עם התווית fluorescently.

Immunophenotyping של Orthotopic מאותו מין (Syngeneic) של KPC העיקרי מאתר אדנוקרצינומה Ductal הלבלב על ידי Cytometry זרימה

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

הודעה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח Immunophenotyping במודלים מורין, כגון סמנים המשמשים לזיהוי שושלת חסינות שונים ואסטרטגיות הזדקנות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי מצבים סמן והזדקנות, כאשר immunophenotyping, ניתן להחיל על מגוון רחב של מודלים מורין. לפקח על משקל הגוף של C57 שחור 6 עכברים באמצעות איזון.כמו כן, לפקח על נפח הגידול של עכברים תורמים שונים על ידי מדידת קליבר. בעקבות המתת חסד של החיה במכסה המנוע biohazard לפי פרוטוקול, לעקר את העור סביב הגידול באמצעות ספוגיות יודפור. לאחר ניתוח הסרת הגידול כמפורט בפרוטוקול הטקסט, מניחים את הגידול בצלחת פטרי המכילה 20 מיליליטר של PBS כי כבר מקורר מראש ל 4 מעלות צלזיוס.אם יש דם מזהם, להעביר את הגידול לתוך צלחת פטרי אחרת לשטוף את הגידול עם PBS. חותכים את הגידול לשניים. הסר כל עור נוסף, כלי דם, הסתיידות ונמק.בחר רק חתיכות שלמות של גידול למקם אותם בצינור צנטריפוגה סטרילי 50 מיליליטר. הוסף 20 מיליליטר של PBS לפני הובלת צינור לחדר בעלי חיים נפרד למחקרים פרמקולוגיים. כדי להתכונן להשתלה אורתוטופית, לתקן עכבר הרדמה מלאה על לוח ניסוי במצב בצד ימין.לחטא את העור סביב הטחול עם אידודין ולאחר מכן דה יוד עם 75% אלכוהול אתיל. מצא את הנקודה החציונית של הטחול ולעשות חתך אנכי 1 ס"מ על הבטן כדי לחשוף את הטחול. בעדינות, למשוך חלק של רקמת הלבלב מתחת הטחול באמצעות פינצטה קצה שטוח.ועכבר סוטרו הומוגרפט חתיכת גידול מעכבר C על הלבלב של העכבר הנמען על ידי 9-O תפר כירורגי bsorbable. סגור את הבטן עם תפר משי 6-O בתפר כפול. להשיג הוקמפוסטזיס על ידי דחיסה.לאחר סיום השתלת הגידול, יש להשאיר את החיה בכלוב חם כל עוד לא מתרחשת דימום או דליפת רקמת גידול. לפקח על החיה עד שהם חוזרים להכרה מספקת כדי לשמור על שליטה בעצם החזה. החזירו את החיה לחדר החיות לאחר החלמה מלאה מההרדמה.לפקח על הגידול עכברים משתנים על ידי palpating הבטן ליד הטחול ולבחור את העכברים הנושאים גידולים אורתוטופיים. עבור כל גידול, להכין צינור C אחד עם חיץ עיכול הגידול. השתמש 3 מיליליטר של חיץ העיכול עבור שברי הגידול פחות מ 0.8 גרם כדי להבטיח את הגידול מתעכל במלואו.סמן את הגידול עם קוד המחקר, הגידול, מזהה העכבר, קבוצת הטיפול ומשקל הגידול. לאסוף את הגידול מהעכבר. לשטוף את הגידול ב- PBS קר ולנקות את הרקמה המצורפת על הגידול.מניחים את הגידול בתקשורת העיכול באר אחת של צלחת סטרילית 6 באר. להחזיק את הגידול במקום עם פינצטה סטרילית או מדפים לחתוך עם אזמל. חותכים את הגידול מספיק טוב כדי לפרוץ לחתיכות קטנות יותר.עכשיו, למקם את חתיכות הגידול בחזרה לתוך C-צינור ולהשתמש במאגר העיכול הנותר לשטוף את הצלחת. מעבירים את הנוזל לצינור C ומ מניחים אותו על קרח עד לעיכול. לאחר מכן הפעל את הדיסוציאטור עם תנורי חימום.מניחים את דיסוציאציה הגידול C-צינור הפוך לתוך השרוול של המיקום הריק. התאם את מצב מיקום הצינור מ'חופשי' ל'נבחר'. בחר תוכנית דיסוציאציה ולאחריה הבחירה של התיקיה הדרושה שבה מוצגת רשימת התכנתים.לאחר סיום התוכנית, לקחת C-tube את הדיסוציאטור ולסובב בקצרה כדי משטח המדגם. עכשיו, להשעות מחדש את הדגימות ולשים אותם לתוך מסננת תא מעל צינור 50 מיליליטר. לשטוף את התא דרך מסננת התא עם 10 מיליליטר של חיץ לשטוף כדי לספק השעיה תא יחיד.לאחר צינור צנטריפוגה ב 300 G במשך 5 דקות, להשליך את supernatant ולהשעות מחדש את התאים עם 5 מיליליטר של חיץ לשטוף. לספור תאים קיימא ולהתאים את ריכוז התאים ל 1 מיליון תאים לכל צינור או לכל מדגם. בצע תכנון לוח חיסוני, כשל חיסוני ו פלואורסצנטיות פחות שליטה אחת כפרט בפרוטוקול הטקסט.הכינו חמוזי UltraComp בזמן שמכשירי הזרימה מתחממים על ידי מערבולות ביסודיות לפני השימוש. סמן צינור דגימה נפרד של 12 x 75 מילימטר עבור כל נוגדנים נדונים פלואורוכרומים. הוסף 100 מיקרוליטר של חיץ כתמים לכל צינור ואחריו טיפה אחת מלאה של חרוזים.הוסף נוגדנים ובצע את הליך הכתמים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן להוסיף 0.5 מיליליטר של חיץ כתמים לכל גלולת חרוזים לחלוטין להשעות מחדש באמצעות מערבולת. עכשיו, להגדיר מתח PMT ציטומטריה זרימה לכל רקמת היעד לניסוי נתון.הפעל את המדגם באמצעות מדגם דרך cytometry זרימה עבור רכישת נתונים על ידי צובר על אוכלוסיית חרוזים בודדים לכל פיזור קדימה קריאות פיזור בצד. הגדר את קצב הזרימה סביב 200 עד 300 אירועים לשניה. הגדר את הפיצוי המתאים עבור נוגדנים ההטיה FITC פלואורסין נתון באמצעות FL1 לעומת התוויית נקודה FL1.מניחים שער רבעים כך חרוזים שליליים נמצאים בתוך הרבע השמאלי התחתון ואת חרוזים חיוביים נמצאים בתוך הרבע הימני העליון או התחתון. התאם את ערכי הפיצוי עד שעוצמת הפלואורסאצין החציונית של כל אוכלוסייה שווה בקירוב. חזור על שלבים אלה עבור כל הצינורות.עכשיו, להמשיך לרכישת דגימות כתם בפועל. הפעל את אשף הפיצויים ושמור את ההגדרה בתבנית:date, בניסוי ובתיבות התיבות שלך. השתלה אורתוטופית של אדנוקרצינומה צינורית הלבלב הביאה לצמיחה מהירה של גידול דומה לזו שנראתה בהשתלה תת עורית.תמונות הכתמת המטוקסילין ואאוסין מייצגות מוצגות ומדגימות צמיחה דומה של שתלים תת עוריים ו אורתוטופיים. תפוקות תאים קיימא גבוהות למדי היו להשיג מדגם הגידול של שני סוגים של השתלה. SPLAT FACS נציג מראה תאים קיימא מגידול מופרדים מן התאים המתים ופסולת התא.מוצג כאן, הוא גידול חודר השוואת פרופיל החיסון של האוכלוסייה העיקרית ואת אוכלוסיית תאי הנומרטור של מספר תת קבוצות מפתח של תאים חיסוניים סרטניים. הומוגרפט תת עורי לעומת אורתוטופי של סרטן הלבלב מוצגים. הנתונים מראים בבירור כי הגידול הגדיל באופן משמעותי את חדירת תאי החיסון בהשוואה ללבלב של עכברים בריאים.בנוסף, נמצאו אחוזים שונים של תת-קבוצות של תאים חיסוניים שחדרו לגידולים אורתוטופיים לעומת הומוגרפטים תת עוריים. לדוגמה, ישנם באופן משמעותי יותר תאי B אורתוטופיים מאשר תת עורית. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור להכין את כל החומרים הקשורים reagents מראש.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לבצע ניתוח FACS עבור מודלים מורין.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

דגם פלורסנט Orthotopic עכבר של סרטן הלבלב

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

במודל עכבר של עייפות הנגרם על ידי הקרנה ההיקפית

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

דגם העכבר סרטן הלבלב Syngeneic ללמוד את השפעות בלתי הפיכות אלקטרופורציה

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

דגם Syngeneic Orthotopic זוהרים, פלורסנט מאתר של סירוס עמידים ו אנדרוגן תלויי סרטן הערמונית

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic השתלת ריאות Syngeneic תאים אדנוקרצינומה ללמוד ביטוי PD-L1

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

מחקה וטיפול מטפלזיה Acinar-כדי-Ductal הלבלב בתרבות תלת-ממדי תא

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

בידוד ואפיון של החולה-הלבלב הנגזר דוטל אדנוקרצינומה מודלים אורגאיד

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

אולטרה סאונד-הדרכה אורתודפית של הלבלב מורלין אדנוקרצינומה

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

בידוד של נוזלים פרוקסימליים כדי לחקור את המיקרו-סביבה של הגידול של אדנוקרצינומה של הלבלב

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

מודל עכבר כריתה אורתוטופי של סרטן הלבלב

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...