Name: immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry
Uploaded: 2018-10-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry at JoVE.com

लेखक Dr. जोड़ी Barbeau शुक्रिया अदा करना चाहूंगा-महत्वपूर्ण पढ़ने और पांडुलिपि के संपादन के लिए, और कलाकृतियों को डिजाइन करने के लिए राल्फ मैनुअल धंयवाद । लेखक भी अपने महान तकनीकी प्रयासों के लिए, Vivo टीम में क्राउन विज्ञान ऑन्कोलॉजी इंयूनो-ऑन्कोलॉजी के मार्कर टीम और कैंसर विज्ञान का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

सभी प्रोटोकॉल और संशोधन (ओं) या देखभाल और पशुओं के उपयोग को शामिल प्रक्रियाओं की समीक्षा की जाएगी और क्राउन विज्ञान संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित अध्ययन के संचालन से पहले । जान?...

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	<li>Chevrier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Immune+Atlas+of+Clear+Cell+Renal+Cell+Carcinoma.">An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma.</a> Cell. 169 (4), 736-749 (2017).</li><li>Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+immune+responses+in+the+tumor+microenvironment.">Monitoring immune responses in the tumor microenvironment.</a> Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).</li><li>Mosely, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+Selection+of+Syngeneic+Preclinical+Tumor+Models+for+Immunotherapeutic+Drug+Discovery.">Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery.</a> Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).</li><li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+focal+adhesion+kinase+renders+pancreatic+cancers+responsive+to+checkpoint+immunotherapy.">Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy.</a> Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).</li><li>Gunderson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruton+Tyrosine+Kinase-Dependent+Immune+Cell+Cross-talk+Drives+Pancreas+Cancer.">Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer.</a> Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).</li><li>Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+modeling+for+immuno-oncology.">Experimental animal modeling for immuno-oncology.</a> Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).</li><li>Takao, K., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+greatly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).</li><li>Payne, K. J., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-cell+lineage+commitment:+translation+from+mice+to+humans.">Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans.</a> Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>von Herrath, M. G., Nepom, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+translation:+barriers+to+implementing+clinical+immunotherapeutics+for+autoimmunity.">Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity.</a> J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).</li><li>Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+to+evaluate+novel+and+conventional+therapeutic+strategies+for+cancer.">Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer.</a> Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).</li><li>Erdag, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotype+and+immunohistologic+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+are+associated+with+clinical+outcome+in+metastatic+melanoma.">Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma.</a> Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).</li><li>Guti&#233;rrez-Garcia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+and+not+immunophenotypic+algorithms+predicts+prognosis+in+patients+with+diffuse+large+B-cell+lymphoma+treated+with+immunochemotherapy.">Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy.</a> Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).</li><li>Paiva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1/PD-1+presence+in+the+tumor+microenvironment+and+activity+of+PD-1+blockade+in+multiple+myeloma.">PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma.</a> Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).</li><li>Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+nature+of+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice.">Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Landscape+in+Early+Lung+Adenocarcinoma+by+Paired+Single-Cell+Analyses.">Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses.</a> Cell. 169 (4), 750-765 (2017).</li><li>Mahoney, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Antibodies+to+Its+Cytoplasmic+Domain+Most+Clearly+Delineate+Cell+Membranes+in+Immunohistochemical+Staining+of+Tumor+Cells.">PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).</li><li>Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+expression+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+is+a+poor+prognostic+factor+in+patients+with+high+CD8++tumor-infiltrating+lymphocytes:+highly+sensitive+detection+using+phosphor-integrated+dot+staining.">PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining.</a> Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImmunoScore+Signature:+A+Prognostic+and+Predictive+Tool+in+Gastric+Cancer.">ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer.</a> Ann. Surg. , (2016).</li><li>Ribas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+Blockade+Expands+Intratumoral+Memory+T+Cells.">PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).</li></ol>

हालांकि अनुसूचित जाति ट्यूमर का उपयोग कर अध्ययन अधिक आसानी से आयोजित कर रहे हैं, orthotopically प्रत्यारोपित ट्यूमर मॉडल संभावित नैदानिक औषध विज्ञान अध्ययन के लिए अधिक प्रासंगिक हो सकता है (विशेष रूप से मैं/ इस...

अग्नाशय डक्टर ग्रंथिकर्कटता (PDAC) लगभग साढ़े दस लाख मृत्युदर दुनिया चौड़ा प्रतिवर्ष, शीर्ष 5 कैंसर हत्यारों में से एक का कारण बनता है । वहां कुछ प्रभावी उपचार के विकल्प और कोई अनुमोदित immunotherapies हैं; इसलिए, नए उपचार की सख्त जरूरत है । कैंसर तेजी से आज ज्ञात के रूप में आनुवंशिक रोगों के अलावा, PDAC सहित प्रतिरक्षा रोगों के रूप में मांयता प्राप्त किया जा रहा है । प्रतिरक्षा और आनुवंशिक कारकों की संभावना रोग का निदान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उपचार परिणामों का निर्धारण करेगा । ट्यूमर मेजबान प्रतिरक्षा निगरानी से बचने और अंततः मौत का कारण अग्रिम । इन प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं के कई ट्यूमर microenvironment के भीतर होते हैं (टीएमई)1,2,3,4 जहां प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के ट्यूमर कोशिकाओं के साथ बातचीत, एक दूसरे के साथ और अन्य ट्यूमर के साथ stromal अवयव, प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से साइटोकिंस जो अंततः रोग के परिणाम का निर्धारण । इसलिए, टीएमई, या ट्यूमर immunophenotyping के ट्यूमर प्रतिरक्षा घटकों के लक्षण वर्णन, उपलेखन सहित, numeration और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न प्रजातियों के स्थानीयकरण, विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. PDAC के मामले में, यह प्रस्तावित किया गया है कि ऊंचा ट्यूमर घुसपैठ दमन मैक्रोफेज (टैम) और बी कोशिकाओं टी सेल घुसपैठ और/या सक्रियण और फाइब्रोसिस5,6के उच्च स्तर की रोकथाम के लिए नेतृत्व किया है ।
प्रतिरक्षा TMEs की जांच करने के लिए आम दृष्टिकोण प्रयोग सरोगेट ट्यूमर नैदानिक पशु मॉडल का उपयोग किया जाएगा, मुख्य रूप से प्रासंगिक माउस ट्यूमर मॉडल7, विशेष रूप से माउस syngeneic (homograft) या आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (GEMM) कैंसर के, माउस और ट्यूमर और प्रतिरक्षा के लिए मानव के ग्रहण समानता पर8,9। यह वास्तविकता में समझा जाता है कि दो प्रजातियों के बीच निहित मतभेद हैं10,11.
प्रत्यारोपित माउस ट्यूमर सहज ट्यूमर7, अर्थात् सिंक्रनाइज़ ट्यूमर विकास, पैतृक GEMM सहज ट्यूमर विकास के विपरीत में महत्वपूर्ण परिचालन लाभ है । सहज murine ट्यूमर के Homografts प्राथमिक इन विट्रो मेंहेरफेर किया गया है कभी नहीं ट्यूमर माना जाता है, और मूल माउस ट्यूमर histo-/molecular पैथोलॉजी7, साथ ही संभव प्रतिरक्षा प्रोफाइल दर्पण । इन murine homografts को प्रायः "रोगी के एक माउस संस्करण-व्युत्पन्न xenografts (PDXs)" माना जाता है. वे इसलिए की संभावना पारंपरिक syngeneic सेल लाइन से एक बेहतर अनुवाद-प्राप्त माउस ट्यूमर12है । विशेष रूप से, कई homografts विशिष्ट GEMM से प्राप्त कर रहे हैं, जहां विशिष्ट मानव रोग तंत्र, उदाहरण के लिए oncogenic चालक उत्परिवर्तनों, इंजीनियर हैं, और इन homografts इसलिए उनके नैदानिक प्रासंगिकता के लिए लाभ होना चाहिए । विशेष रूप से, KPC GEMM 15 के भीतर माउस PDAC का विकास-उंर के 20 सप्ताह है, जो recapitulates अच्छी तरह से मामूली विभेदित predominately वास्तुकला और अत्यधिक समृद्ध ग्रंथियों के साथ मानव रोग आकृति विज्ञान स्ट्रोमा । यह मॉडल भी मानव PDAC की सबसे आम आनुवंशिक सुविधाओं recapitulates, अर्थात् उत्परिवर्तन और P53 नुकसान की-समारोह है, जो ९०% और मानव PDAC के ७५% में होते हैं, क्रमशः5,6सक्रिय Kras ।
प्रत्यारोपण की साइटों को भी मॉडल अनुवाद में एक भूमिका निभाने के लिए सुझाव दिया गया है । इस तरह के एक इसी orthotopic वातावरण के रूप में विशिष्ट आसपास के ऊतकों पर्यावरण, विशिष्ट ट्यूमर के लिए प्रगति के लिए एक जगह हो सकता है, के रूप में आमतौर पर प्रत्यारोपण ट्यूमर के लिए वर्दी चमड़े के नीचे (अनुसूचित जाति) वातावरण का विरोध किया । यह विशेष ब्याज की होगी, और/या, क्या अंतर दो प्रत्यारोपण साइटों के बीच मौजूद है, प्रतिरक्षा-microenvironment के मामले में, और मानव कैंसर के लिए प्रासंगिकता, उदा। PDAC के मामले में ।
प्रतिरक्षा रूपरेखा, या immunophenotyping का सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक, ट्यूमर का निर्धारण करने के लिए है, विभिन्न वंश की प्रतिरक्षा कोशिकाओं घुसपैठ, संख्या, ट्यूमर के भीतर सापेक्ष प्रतिशत, साथ ही उनके सक्रियण राज्यों, और स्थानों. यह ट्यूमर-infiltratrating lymphoctyes (TILs, दोनों टी और बी-), ट्यूमर घुसपैठ मैक्रोफेज (TAMs), ट्यूमर-प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं (NKs) और ट्यूमर-निवासी वृक्ष कोशिकाओं3,13,14 घुसपैठ शामिल , 15 , 16 , 17, और कुछ कोशिकाओं के सेलुलर स्थानीयकरण18,19,20, आदि। प्रतिदीप्ति सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) या प्रवाह cytometry एक एकल-कक्ष पहचान तकनीक है जो सामान्यतः किसी कक्ष के विशिष्ट पैरामीटर्स को मापने के लिए उपयोग की जाती है. बहु रंग प्रवाह cytometry एक एकल सेल3,4,21 पर कई मार्करों उपाय और संख्या और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न सबसेट के सापेक्ष प्रतिशत का निर्धारण करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि है, ट्यूमर के भीतर उन सहित ।
इस रिपोर्ट में ट्यूमर घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं की रूपरेखा के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करता है: 1) orthotopic PDAC माउस ट्यूमर homografts के आरोपण, साथ अनुसूचित जाति आरोपण; 2) ट्यूमर ऊतक फसल और ट्यूमर पृथक्करण के माध्यम से एकल सेल तैयारी; 3) एक आधार रेखा के रूप में ट्यूमर से प्राप्त कोशिकाओं के सभी का प्रवाह cytometry विश्लेषण; 4) दोनों ट्रांसप्लांटेशन दृष्टिकोण की आधारभूत प्रोफाइल की तुलना ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine</td>
			<td>\</td>
			<td>SAS3119</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trocar 20</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>2mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotic and antimycotic</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Air chemical</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood</td>
			<td>AIRTECH</td>
			<td>BSC-1300IIA2</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibodies</td>
			<td>BD</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration</td>
			<td>BD</td>
			<td>354248</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffers</td>
			<td>BD</td>
			<td>554656</td>
			<td>Mincing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Staining Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>563794</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td>553142</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell filters</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>70&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>routine blood tube</td>
			<td>BD-Vacutainer</td>
			<td>365974</td>
			<td>2mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>vs 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3 Fix/Perm kit</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810R,5920R</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td>\</td>
			<td>vs 10.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable, sterile scalpels</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J12100</td>
			<td>11#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife handle</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J11010</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>Y00030</td>
			<td>Eye scissors 10cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>JD1060</td>
			<td>Eye tweezers 10cm with teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable liquid nitrogen tank</td>
			<td>Jinfeng</td>
			<td>YDS-175-216</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Metter Toledo</td>
			<td>AL204</td>
			<td>0-100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi C-tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi Gentle MACS with heater blocks</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-018-306</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryopreservation tube</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME</td>
			<td>PathClear</td>
			<td>3442-005-01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringes</td>
			<td>Shanghai MIWA medical industry</td>
			<td>\</td>
			<td>1-5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog software</td>
			<td>Studylog</td>
			<td>\</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Balance and supporting USB</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>SE601F</td>
			<td>Balance and supporting USB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Data line of vernier calipers</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>926.6721</td>
			<td>Data line of vernier calipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>910.1502.10</td>
			<td>Sylvac S-Cal pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339653</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339651</td>
			<td>15mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>KLCS-288</td>
			<td>4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PLF-276</td>
			<td>&#8212;20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>DW-862626</td>
			<td>&#8212;80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>am7021</td>
			<td>\</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry

Homograft (syngeneic) ट्यूमर आज के इंयूनो-ऑन्कोलॉजी (आई. ओ.) के workhorse नैदानिक अनुसंधान कर रहे हैं । ट्यूमर microenvironment (टीएमई), विशेष रूप से अपनी प्रतिरक्षा घटकों, रोग का निदान और उपचार के परिणामों की भविष्यवाणी करने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से उन immunotherapy के । टीएमई प्रतिरक्षा-घटक बहु-रंग FACS द्वारा assessable ट्यूमर-घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न सबसेट से बना रहे हैं. अग्नाशय डक्टर ग्रंथिकर्कटता (PDAC) घातक अच्छे उपचार के विकल्प की कमी द्रोह के बीच है, इस प्रकार एक तत्काल और unmet चिकित्सा की जरूरत है । अपनी गैर विभिंन चिकित्सा के लिए जवाबदेही के लिए एक महत्वपूर्ण कारण (chemo-, लक्षित, मैं/ओ) अपने प्रचुर मात्रा में टीएमई, fibroblasts और ल्यूकोसाइट्स है कि इन उपचारों से ट्यूमर कोशिकाओं की रक्षा से मिलकर किया गया है । Orthotopically प्रत्यारोपित PDAC और अधिक सही पारंपरिक चमड़े के नीचे (अनुसूचित जाति) मॉडल की तुलना में मानव अग्नाशय के कैंसर के टीएमई पर कब्जा करने के लिए माना जाता है ।
Homograft ट्यूमर (KPC) का प्रत्यारोपण कर रहे हैं माउस सहज PDAC से उद्भव अनुवांशिक इंजीनियर KPC-चूहों (KrasG12D/+/P५३-/-/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). प्राथमिक ट्यूमर ऊतक छोटे टुकड़ों (~ 2 मिमी3) में कटौती और syngeneic प्राप्तकर्ताओं (C57BL/6, 7-9 सप्ताह पुरानी) के लिए (एससी) चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित है । homografts तो शल्य चिकित्सा orthotopically नए C57BL के अग्ंयाशय पर प्रत्यारोपित किया गया/6 चूहों, साथ अनुसूचित जाति-आरोपण, जो के ट्यूमर मात्रा तक पहुंच 300-1000 मिमी3 द्वारा 17 दिन । केवल 400 के ट्यूमर-600 मिमी3 अनुमोदित शव परीक्षण प्रक्रिया के अनुसार काटा गया और आसंन गैर ट्यूमर ऊतकों को दूर करने के लिए साफ किया । वे एक एकल सेल निलंबन में dissociator ऊतक का उपयोग कर प्रोटोकॉल प्रति असंबद्ध थे, फ्लोरोसेंट के निर्दिष्ट पैनलों के साथ धुंधला-अलग प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिंन मार्करों के लिए लेबल एंटीबॉडी (लसीकावत्, माइलॉयड और NK, dc) के बाद । सना हुआ नमूनों बहु रंग FACS का उपयोग करने के लिए विभिन्न वंश की प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए विश्लेषण किया गया, साथ ही ट्यूमर के भीतर अपने रिश्तेदार प्रतिशत. orthotopic ट्यूमर की प्रतिरक्षा प्रोफाइल तो अनुसूचित जाति के ट्यूमर की तुलना में थे । प्रारंभिक डेटा अग्ंयाशय पर ट्यूमर में TILs/TAMs घुसपैठ में काफी ऊंचा प्रदर्शन किया, और एससी ट्यूमर के बजाय orthotopic में उच्च बी-सेल घुसपैठ ।

PDAC के Orthotopic आरोपण के परिणामस्वरूप तेजी से ट्यूमर विकास के समान है कि अनुसूचित जाति आरोपण के लिए देखा । दाता ट्यूमर टुकड़े के बाद प्राप्तकर्ता चूहों में प्रत्यारोपित किया गया, दोनों चमड़े के ?...

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Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

murine orthotopic PDAC homografts के immunophenotyping पर प्रयोगात्मक प्रक्रिया ट्यूमर इंयूनो-microenvironment की रूपरेखा पर करना है । ट्यूमर सर्जरी के जरिए प्रत्यारोपित orthotopically हैं. 200 के ट्यूमर – 600 मिमी आकार में3 काटा और एकल सेल निलंबन तैयार करने के लिए असंबद्ध थे, बहु प्रतिरक्षा मार्कर FACS विश्लेषण द्वारा अलग फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी का उपयोग कर के बाद.

Immunophenotyping के Orthotopic Homograft (Syngeneic) के Murine प्राथमिक KPC अग्नाशय वाहिनीई ग्रंथिकर्कटता द्वारा प्रवाह Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

यह संदेश मुरीन मॉडल में इम्यूनोफेनोटाइपिंग में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकता है, जैसे कि विभिन्न प्रतिरक्षा वंश और उम्र बढ़ने की रणनीतियों की पहचान करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मार्कर। इस तकनीक का प्रमुख लाभप्रद यह है कि मार्कर और एजिंग स्टेटजी, जब इम्यूनोफेनोटाइपिंग, विभिन्न प्रकार के मुरीन मॉडलों पर लागू हो सकते हैं। एक संतुलन का उपयोग कर C57 काले 6 चूहों के शरीर के वजन की निगरानी करें।इसके अलावा, कैलिबर माप द्वारा ट्यूमर अलग दाता चूहों के ट्यूमर की मात्रा की निगरानी करें। प्रोटोकॉल के अनुसार एक बायोहैजार्ड हुड में जानवर की इच्छामृत्यु के बाद, इओडोफोर झाड़ू का उपयोग करके ट्यूमर के आसपास की त्वचा को निष्फल करें। पाठ प्रोटोकॉल में विस्तृत के रूप में ट्यूमर को हटाने के बाद, ट्यूमर को पीबीएस के 20 मिलीलीटर युक्त पेट्री डिश में रखें जिसे पूर्व में 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया गया है।यदि रक्त दूषित हो रहा है, तो ट्यूमर को एक और पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और ट्यूमर को पीबीएस से धोएं। ट्यूमर को आधे में काट लें। किसी भी अतिरिक्त त्वचा, जहाजों, कैल्सिफिकेशन, और परिगलन को हटा दें।ट्यूमर के केवल बरकरार टुकड़े चुनें और उन्हें एक बाँझ 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें। फार्माकोलॉजी अध्ययन के लिए एक अलग पशु कमरे में ट्यूब परिवहन से पहले पीबीएस के 20 मिलीलीटर जोड़ें । ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण के लिए तैयार करने के लिए, सही पार्श्व स्थिति में एक प्रयोग बोर्ड पर एक पूरी तरह से एनेस्थेटाइज माउस को ठीक करें।इडोडीन के साथ तिल्ली के चारों ओर त्वचा को कीटाणुरहित करें और फिर 75% एथिल अल्कोहल के साथ डी-आयोडिनेट करें। तिल्ली के मीडियन पॉइंट का पता लगाएं और तिल्ली को बेनकाब करने के लिए पेट पर 1 सेंटीमीटर वर्टिकल चीरा लगाएं। धीरे-धीरे, फ्लैट टिप चिमटी का उपयोग करके तिल्ली के नीचे अग्न्याशय ऊतक का हिस्सा बाहर निकालें।और सुट्रो माउस होमोबेड़ा ट्यूमर टुकड़ा सी माउस से प्राप्तकर्ता माउस के अग्न्याशय पर 9-O bsorbable सर्जिकल सीवन द्वारा। डबल सीम द्वारा 6-ओ रेशम सीवन के साथ पेट को बंद करें। संपीड़न द्वारा होमोस्टेसिस प्राप्त करें।ट्यूमर प्रत्यारोपण खत्म करने के बाद, जानवर को गर्म पिंजरे में रखें जब तक कि रक्तस्राव या ट्यूमर ऊतक रिसाव न हो। जानवर की निगरानी तब तक करें जब तक कि वे स्टर्नल रेक्यूबेंसी बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना हासिल न करें। संज्ञाहरण से पूर्ण वसूली के बाद जानवर के कमरे में जानवर वापस।तिल्ली के पास पेट को टटोलना और ऑर्थोटोपिक ट्यूमर असर चूहों का चयन करके ट्यूमर अलग-अलग चूहों की निगरानी करें। प्रत्येक ट्यूमर के लिए, ट्यूमर पाचन बफर के साथ एक सी ट्यूब तैयार करें। ट्यूमर पूरी तरह से पचाने के लिए 0.8 ग्राम से कम ट्यूमर के टुकड़े के लिए पाचन बफर के 3 मिलीलीटर का उपयोग करें।अध्ययन कोड, ट्यूमर, माउस आईडी, उपचार समूह, और ट्यूमर वजन के साथ ट्यूमर लेबल। माउस से ट्यूमर ले लीजिए। ट्यूमर को ठंडे पीबीएस में धोएं और ट्यूमर पर लगे टिश्यू को साफ करें।पाचन मीडिया में ट्यूमर को बाँझ 6-अच्छी प्लेट के एक कुएं में रखें। एक स्केलपेल के साथ बाँझ चिमटी या संदंश और टुकड़ा के साथ जगह में ट्यूमर पकड़ो। ट्यूमर को छोटे टुकड़ों में तोड़ने के लिए पर्याप्त अच्छी तरह से टुकड़ा करें।अब ट्यूमर के टुकड़ों को वापस सी-ट्यूब में रखें और प्लेट को धोने के लिए बचे हुए पाचन बफर का इस्तेमाल करें। तरल पदार्थ को सी-ट्यूब में स्थानांतरित करें और पाचन तक बर्फ पर रखें। फिर हीटर के साथ वियोजन पर स्विच करें।ट्यूमर वियोजन सी-ट्यूब को खाली स्थिति की आस्तीन में उल्टा रखें। ट्यूब की स्थिति को मुफ्त से चयनित करने के लिए समायोजित करें। प्रोग्राम की सूची प्रदर्शित होने पर आवश्यक फ़ोल्डर के चयन के बाद एक वियोजन कार्यक्रम चुनें।कार्यक्रम की समाप्ति के बाद, सी-ट्यूब को वियोजना से दूर करें और नमूना को फूस के लिए संक्षेप में स्पिन करें। अब नमूनों को फिर से निलंबित कर 50 मिलीलीटर ट्यूब के ऊपर एक सेल छलनी में डाल दिया। सेल छन्नी के माध्यम से सेल छन्नी के माध्यम से सेल को वॉश बफर के 10 मिलीलीटर के साथ धोएं ताकि एक सेल निलंबन प्रदान किया जा सके।5 मिनट के लिए 300 ग्राम पर अपकेंद्रित्र ट्यूब के बाद, सुपरनेट को त्यागें और 5 मिलीलीटर वॉश बफर के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें और प्रति ट्यूब या प्रति नमूना 1 मिलियन सेल में सेल एकाग्रता को समायोजित करें। पाठ प्रोटोकॉल में विस्तार के रूप में प्रतिरक्षा पैनल डिजाइन, इम्यूनोस्टेपिंग और फ्लोरेसेंस माइनस एक नियंत्रण करें।अल्ट्राकॉम्प मोतियों को तैयार करें जबकि प्रवाह उपकरण उपयोग से पहले उन्हें अच्छी तरह से भंवर से गर्म कर रहे हैं। प्रत्येक फ्लोरोक्रोम के लिए एक अलग 12 x 75 मिलीमीटर नमूना ट्यूब लेबल एंटीबॉडी। मोतियों की एक पूरी बूंद के बाद प्रत्येक ट्यूब के लिए धुंधला बफर के १०० माइक्रोलीटर जोड़ें ।एंटीबॉडी जोड़ें और पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित धुंधला प्रक्रिया का प्रदर्शन करें। फिर प्रत्येक मनका गोली के लिए धुंधला बफर के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें और भंवर के माध्यम से पूरी तरह से फिर से निलंबित करें। अब, दिए गए प्रयोग के लिए प्रति लक्ष्य ऊतक प्रवाह साइटोमेट्री पीएमटी वोल्टेज सेट करें।आगे तितर बितर और पक्ष तितर बितर रीडिंग प्रति एकल मनका आबादी पर प्राप्त करके डेटा अधिग्रहण के लिए प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से नमूना के माध्यम से नमूना चलाएं। प्रति सेकंड 200 से 300 घटनाओं के आसपास प्रवाह दर निर्धारित करें। FL1 बनाम FL1 डॉट प्लॉट का उपयोग करके दिए गए फ्लोरोर्सिन फिटसी कंजूगेशन एंटीबॉडी के लिए उचित मुआवजा निर्धारित करें।एक चतुर्भुज द्वार रखें ताकि नकारात्मक मोती निचले बाएं चतुर्भुज के भीतर हों और सकारात्मक मोती ऊपरी या निचले दाएं चतुर्भुज के भीतर हों। प्रत्येक आबादी की औसत फ्लोरोसेइन तीव्रता लगभग बराबर होने तक मुआवजा मूल्यों को समायोजित करें। सभी ट्यूबों के लिए इन चरणों को दोहराएं।अब, वास्तविक दाग नमूने प्राप्त करने के लिए आगे बढ़ें। मुआवजा जादूगर चलाएं और प्रारूप के साथ सेटिंग को बचाएं: तिथि, प्रयोग और अपने प्रथमाक्षर। अग्नाशय डक्टल एडेनोकार्सिनोमा के ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण के परिणामस्वरूप तेजी से ट्यूमर विकास हुआ जो चमड़े के नीचे प्रत्यारोपण में देखा गया।प्रतिनिधि हेमटॉक्सीलिन और ईओसिन धुंधला छवियों को दिखाया जाता है और चमड़े के नीचे और ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण के समान विकास को प्रदर्शित करता है। यथोचित उच्च व्यवहार्य कोशिकाओं की पैदावार प्रत्यारोपण के दोनों प्रकार के ट्यूमर नमूने से प्राप्त किया गया । प्रतिनिधि FACS स्प्प्लैट मृत कोशिकाओं और कोशिका मलबे से अलग ट्यूमर से व्यवहार्य कोशिकाओं को दिखाता है ।यहां दिखाया गया है, एक ट्यूमर ट्यूमर प्रतिरक्षा कोशिकाओं के कई प्रमुख सबसेट के प्रमुख और संख्यात्मक सेल आबादी की एक प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल तुलना घुसपैठ है । अग्नाशय के कैंसर के चमड़े के नीचे बनाम ऑर्थोटोपिक होमोबेड़ा दिखाया गया है। डेटा स्पष्ट रूप से पता चलता है कि ट्यूमर काफी स्वस्थ चूहों के अग्न्याशय के साथ तुलना के रूप में प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ में वृद्धि हुई है ।इसके अलावा, ऑर्थोटोपिक बनाम चमड़े के नीचे होमोग्राफ्ट में ट्यूमर घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिका सबसेट के विभिन्न प्रतिशत पाए गए। उदाहरण के लिए, चमड़े के नीचे की तुलना में ऑर्थोटोपिक में काफी अधिक बी कोशिकाएं हैं। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय सभी संबद्ध सामग्रियों और अभिकर् ती को पहले से तैयार करना याद रखना महत्वपूर्ण है।इस वीडियो को देखने के बाद, आपको एक अच्छी समझ होनी चाहिए कि मुरीन मॉडल के लिए एफएएफएस विश्लेषण कैसे करें।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

फ्लोरोसेंट Orthotopic माउस अग्नाशय के कैंसर के मॉडल

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

थकान के एक माउस मॉडल परिधीय विकिरण से प्रेरित

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

एक Syngeneic अग्नाशय के कैंसर माउस मॉडल अपरिवर्तनीय Electroporation के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

एक Bioluminescent और फ्लोरोसेंट Orthotopic Syngeneic Murine मॉडल एण्ड्रोजन के आश्रित और बधिया प्रतिरोधी प्रोस्टेट कैंसर

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

पीडी-L1 एक्सप्रेशन का अध्ययन करने के लिए Syngeneic लंग ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं का Orthotopic ट्रांसप्लांटेशन

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

3-आयामी कोशिका संस्कृति में अग्नाशय कोष्ठकी-टू-डक्टर Metaplasia की नकल उतारना और हेर-फेर करना

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

रोगी-व्युत्पन्न अग्नाशय डक्टल एडेनोकार्सिनोमा ऑर्गेनॉइड मॉडल का अलगाव और लक्षण वर्णन

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

मैरिन अग्नाशय के डक्टल एडेनोकार्सिनोमा के अल्ट्रासाउंड-गाइडेड ऑर्थोटोपिक इम्प्लांटेशन

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा के ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की जांच के लिए समीपस्थ तरल पदार्थ का अलगाव

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

अग्नाशय के कैंसर का एक ऑर्थोटोपिक रीसेक्शनल माउस मॉडल

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...