Name: immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry
Uploaded: 2018-10-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry at JoVE.com

著者博士ジョディ Barbeau - 重要な読書と原稿の編集、ありがとうと芸術作品を設計するためラルフ ・ マヌエルを感謝思います。著者もクラウン生命科学腫瘍免疫腫瘍マーカー チームとがんのIn Vivoチームの素晴らしい技術的な努力に感謝を思います。

すべてのプロトコルとぞやケアとの動物の使用を含む手順の見直しし、試験の実施前にクラウン バイオ施設動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されました。ケアと動物の使用通常行われる AAALAC (評価・実験動物医療認定協会) 国際ガイドラインに従ってケアと使用の実験動物、研究のためのガイドで報告されました。理事会 (2011 年)。すべての動物実験の手続き (特定病原体フリー...

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	<li>Chevrier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Immune+Atlas+of+Clear+Cell+Renal+Cell+Carcinoma.">An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma.</a> Cell. 169 (4), 736-749 (2017).</li><li>Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+immune+responses+in+the+tumor+microenvironment.">Monitoring immune responses in the tumor microenvironment.</a> Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).</li><li>Mosely, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+Selection+of+Syngeneic+Preclinical+Tumor+Models+for+Immunotherapeutic+Drug+Discovery.">Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery.</a> Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).</li><li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+focal+adhesion+kinase+renders+pancreatic+cancers+responsive+to+checkpoint+immunotherapy.">Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy.</a> Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).</li><li>Gunderson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruton+Tyrosine+Kinase-Dependent+Immune+Cell+Cross-talk+Drives+Pancreas+Cancer.">Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer.</a> Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).</li><li>Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+modeling+for+immuno-oncology.">Experimental animal modeling for immuno-oncology.</a> Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).</li><li>Takao, K., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+greatly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).</li><li>Payne, K. J., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-cell+lineage+commitment:+translation+from+mice+to+humans.">Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans.</a> Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>von Herrath, M. G., Nepom, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+translation:+barriers+to+implementing+clinical+immunotherapeutics+for+autoimmunity.">Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity.</a> J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).</li><li>Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+to+evaluate+novel+and+conventional+therapeutic+strategies+for+cancer.">Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer.</a> Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).</li><li>Erdag, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotype+and+immunohistologic+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+are+associated+with+clinical+outcome+in+metastatic+melanoma.">Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma.</a> Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).</li><li>Guti&#233;rrez-Garcia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+and+not+immunophenotypic+algorithms+predicts+prognosis+in+patients+with+diffuse+large+B-cell+lymphoma+treated+with+immunochemotherapy.">Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy.</a> Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).</li><li>Paiva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1/PD-1+presence+in+the+tumor+microenvironment+and+activity+of+PD-1+blockade+in+multiple+myeloma.">PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma.</a> Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).</li><li>Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+nature+of+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice.">Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Landscape+in+Early+Lung+Adenocarcinoma+by+Paired+Single-Cell+Analyses.">Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses.</a> Cell. 169 (4), 750-765 (2017).</li><li>Mahoney, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Antibodies+to+Its+Cytoplasmic+Domain+Most+Clearly+Delineate+Cell+Membranes+in+Immunohistochemical+Staining+of+Tumor+Cells.">PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).</li><li>Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+expression+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+is+a+poor+prognostic+factor+in+patients+with+high+CD8++tumor-infiltrating+lymphocytes:+highly+sensitive+detection+using+phosphor-integrated+dot+staining.">PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining.</a> Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImmunoScore+Signature:+A+Prognostic+and+Predictive+Tool+in+Gastric+Cancer.">ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer.</a> Ann. Surg. , (2016).</li><li>Ribas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+Blockade+Expands+Intratumoral+Memory+T+Cells.">PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).</li></ol>

SC 腫瘍を用いた研究を行いやすくが移植がん腫瘍モデルすることができます潜在的臨床薬理試験 (特に I/O 調査) の関連性の高い強化翻訳対象範囲を提供します。このレポートは、直接彼らのそれぞれの研究で使用できる技術的な手順を視覚化できるように興味がある読者/視聴者の支援を目指しています。私達のプロトコルを示すその同所性同種 PDAC の注入が効率的な腫瘍の成長、SC 注入のよ...

膵管腺癌 (PDAC) ほぼ半分百万死亡世界中毎年トップ 5 がんキラーの 1 つが発生します。いくつかの効果的な治療オプションとも承認された免疫療法;したがって、新しい治療法が必死に必要です。癌は、今日知られている遺伝的疾患に加えて PDAC を含む免疫疾患として認識され始めています。病の予後と治療免疫学的および遺伝的要因を決定可能性が高い結果。腫瘍は、ホスト免疫監視を回避して最終的に死を引き起こすに進みます。多くのこれらの免疫プロセス内で発生する腫瘍微小環境 (TME)1,2,3,4異なったタイプの免疫細胞が腫瘍細胞、互いおよび他の腫瘍を対話間質成分は、直接または間接的を介してサイトカイン疾患の結果を最終的に決定します。したがって、TME、または腫瘍診療、サブタイプ、記数法の免疫細胞の異なる系統のローカリゼーションなどの腫瘍免疫成分の特性は、抗腫瘍免疫を理解する重要です。PDAC、場合それを提案されている腫瘍浸潤抑制マクロファージ (TAM) を昇格して、B 細胞は T 細胞の浸潤や活性化の防止や線維症5,6の高いレベルにつながっています。
実験的免疫手ごろを調査する一般的なアプローチは、サロゲート腫瘍臨床モデル動物を用いたが、主に関連するマウス腫瘍モデル7、特にマウス同系 (同種) または遺伝子組み換えマウス モデル (ジェム)がんのマウスおよび腫瘍および免疫8,9に対するヒトの想定された類似性に。それが現実でわかる 2 種10,11の間の本質的な違いがあること。
マウスの移植腫瘍自発腫瘍7、親のジェム自発腫瘍開発と対照をなして、すなわち同期腫瘍開発上重要な操作上の利点があります。マウス腫瘍の移植であることのなかった原発操作の in vitro、・ ミラーリング オリジナル マウス腫瘍病理組織/分子病理7、として可能性のある免疫プロファイル。多くの場合、これらのマウスの移植は「患者由来の異種移植片 (PDXs) のマウス バージョン」と見なされます。彼らしたがって可能性が高い従来の同系細胞由来のマウス腫瘍12より良い翻訳可能性があります。特に、多くの移植は、特定疾病のメカニズム、例えば発癌ドライバー変異、設計、これらの移植がその臨床的意義への利点必要したがって、特定のジェムから派生されます。特に、KPC ジェムは年齢、形態学的主にも-に分化腺アーキテクチャと人間の病気を繰り返すし、間質を高濃縮の 15-20 週間以内マウス PDAC を開発します。このモデルは、人間 PDAC、すなわち Kras 変異および P53 の機能喪失、人間 PDAC、それぞれ5,6の 75% と 90% で発生するアクティブ化の最も一般的な遺伝的特徴をまた繰り返します。
移植のサイトはモデル訳しで役割を果たすことも提案されています。対応する同所性同種環境など、特定の周囲組織環境は一般的移植腫瘍の進行状況、制服の皮下 (SC) とは対照的環境に特定の腫瘍のためのニッチかもしれない。特別な関心のであろう場合、および/または、どのような違いは例えば免疫-微小環境とひと癌との関連性の面で、2 つの移植サイト間に存在します。場合 PDAC。
免疫プロファイルや診療の最も重要な側面の一つは、異なる系統、数字、腫瘍の中で相対的な割合と同様、彼らのアクティベーション状態、および場所の腫瘍浸潤の免疫細胞を決定します。これは腫瘍 infiltratrating lymphoctyes が含まれています (ティルズ、両方の T - と B-)、(Tam) 腫瘍浸潤マクロファージ、ナチュラル キラー細胞の腫瘍浸潤 (NKs) と腫瘍居住者樹状細胞3,13,14,15,16,17、および特定の細胞18,19,20等の細胞内局在。蛍光活性化セルの並べ替え (FACS) または流れの cytometry はセルの特定のパラメーターを測定する一般的使用される単一細胞検出技術です。マルチカラー流れの cytometry 措置単一のセル3,4,21日複数のマーカーと数字と免疫細胞のさまざまなサブセットの相対的な割合を決定する最も一般的に使用される方法です。腫瘍を含みます。
このレポートは、免疫細胞の腫瘍浸潤のプロファイリングの手順を説明します: 1) 同所性同種 PDAC マウス腫瘍移植、SC 注入; と共にの注入2) 腫瘍組織の収穫と腫瘍解離を介して単一のセル準備3) 流フローサイトメトリー解析; ベースラインとして腫瘍由来細胞のすべての4) 移植両方のベースライン プロファイルの比較。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine</td>
			<td>\</td>
			<td>SAS3119</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trocar 20</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>2mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotic and antimycotic</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Air chemical</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood</td>
			<td>AIRTECH</td>
			<td>BSC-1300IIA2</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibodies</td>
			<td>BD</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration</td>
			<td>BD</td>
			<td>354248</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffers</td>
			<td>BD</td>
			<td>554656</td>
			<td>Mincing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Staining Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>563794</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td>553142</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell filters</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>70&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>routine blood tube</td>
			<td>BD-Vacutainer</td>
			<td>365974</td>
			<td>2mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>vs 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3 Fix/Perm kit</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810R,5920R</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td>\</td>
			<td>vs 10.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable, sterile scalpels</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J12100</td>
			<td>11#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife handle</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J11010</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>Y00030</td>
			<td>Eye scissors 10cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>JD1060</td>
			<td>Eye tweezers 10cm with teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable liquid nitrogen tank</td>
			<td>Jinfeng</td>
			<td>YDS-175-216</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Metter Toledo</td>
			<td>AL204</td>
			<td>0-100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi C-tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi Gentle MACS with heater blocks</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-018-306</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryopreservation tube</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME</td>
			<td>PathClear</td>
			<td>3442-005-01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringes</td>
			<td>Shanghai MIWA medical industry</td>
			<td>\</td>
			<td>1-5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog software</td>
			<td>Studylog</td>
			<td>\</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Balance and supporting USB</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>SE601F</td>
			<td>Balance and supporting USB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Data line of vernier calipers</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>926.6721</td>
			<td>Data line of vernier calipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>910.1502.10</td>
			<td>Sylvac S-Cal pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339653</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339651</td>
			<td>15mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>KLCS-288</td>
			<td>4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PLF-276</td>
			<td>&#8212;20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>DW-862626</td>
			<td>&#8212;80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>am7021</td>
			<td>\</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry

同種 (同系) の腫瘍は、今日の免疫・腫瘍学 (I/O) 臨床研究の主力製品です。腫瘍微小環境 (TME)、特に免疫-コンポーネントは予後との特にそれらの免疫療法の治療結果の予測に不可欠です。TME 免疫-コンポーネントは、マルチカラーの FACS による腫瘍浸潤の評価の免疫細胞のさまざまなサブセットの構成されます。膵管腺癌 (PDAC) は、良い治療法の選択肢、したがって、緊急と満たされていない医療ニーズを欠けている最悪の malignances の一つです。様々 な治療 (化学療法をターゲット、I/O) の非応答のための 1 つの重要な理由は、これらの治療から腫瘍細胞を守る白血球や線維芽細胞から成る、その豊富な TME をされています。注入 PDAC より正確に考えられているがんは、皮下 (SC) 従来よりも人間の膵臓癌の TME を奪還します。
同種腫瘍 (KPC) は、遺伝子組み換え KPC マウスから発信されたマウス自発 PDAC の移植 (KrasG12D/+/P53-/-/Pdx1-再C) (KPC ジェム)。腫瘍組織は小さな断片 (~ 2 mm3) にカットし、皮下移植 (SC) (C57BL/6、7-9 週齢) の同系の受信者に。移植手術していたがんと一緒に SC 注入、17 日まで 300-1,000 mm3の腫瘍体積の新しい c57bl/6 マウスの膵臓に移植しました。400-600 mm3の腫瘍だけは承認された解剖プロシージャごとに収穫され、きれいに隣接する非腫瘍性組織を削除します。単一細胞懸濁液、異なる免疫細胞の様々 なマーカーの蛍光標識抗体の指定されたパネルとの汚損によって続いてに組織発生器を使用してプロトコルごと解離彼ら (リンパ球、骨髄性 NK、DCs)。ステンド グラス サンプルの腫瘍内での相対的な割合と同様、異なる系統の免疫細胞の数を決定するマルチカラー FACS を用いていた。同所性同種腫瘍の免疫プロファイルは SC 腫瘍のものと、比較しました。予備的なデータは、膵臓と SC の腫瘍ではなく、同所性同種に高い B 細胞浸潤腫瘍の浸潤なティルズ/Tam を有意に上昇を示した。

PDAC の同所性同種移植は、SC の注入のような急速な腫瘍の成長で起因しました。受信者のマウスに移植されたドナー腫瘍フラグメント後両方皮下プロトコルに従ってがんは、2.1 と 2.2 の手順の説明、図 1 a のように埋め込まれた KPC 同種腫瘍が同様の急速な成長を実証.KPC 同種腫瘍異なる時点で収穫は図 1 bに示すように、<str...

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Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

実験マウスの同所性同種 PDAC 移植の診療には、腫瘍免疫微小環境のプロファイリングを目指しています。腫瘍は、手術を介して注入したがんです。200-600 mm3の大きさの腫瘍は、収穫され、異なる蛍光標識抗体を用いて免疫マルチ マーカー FACS 解析に続いて単一細胞懸濁液を準備する解離。

同所性同種 (同系) マウスのプライマリ KPC 膵管腺癌のフローサイトメトリーによる診療

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

このメッセージは、さまざまな免疫系統や老化戦略を特定するために使用されるマーカーなど、マウスモデルにおける免疫フェノタイピングの主要な質問に答える上で役立ちます。この技術の主な利点は、マーカーおよびエージングステートギーが、免疫平型化時に、様々なマウスモデルに適用できることである。バランスを使用してC57ブラック6マウスの体重を監視します。また、腫瘍変化ドナーマウスの腫瘍体積を口径測定により監視する。バイオハザードフード内の動物の安楽死に続いて、プロトコルごとに、イオドファー綿棒を使用して腫瘍の周りの皮膚を殺菌する。テキストプロトコルに詳述されているように腫瘍を外科的に除去した後、4°Cに予冷したPBSの20ミリリットルを含むシャーレに腫瘍を入れる。血液を汚染している場合は、腫瘍を別のペトリ皿に移し、PBSで腫瘍を洗浄します。腫瘍を半分に切る。余分な皮膚、血管、石灰化、壊死を取り除きます。腫瘍の無傷の部分のみを選択し、無菌50ミリリットル遠心管に入れます。薬理学の研究のために別の動物室にチューブを輸送する前にPBSの20ミリリットルを追加します。正交性移植の準備をするために、右横方向の位置にある実験板の上に完全に麻酔マウスを固定する。脾臓の周りの皮膚をイドジンで消毒し、75%エチルアルコールで脱イオジネートします。脾臓の中央値点を見つけ、腹部に1センチメートルの垂直切開を行い、脾臓を露出させる。平らな先端ピンセットを使用して脾臓の下に膵臓組織の一部を優しく引き出す。そして、Cマウスから9-O bsorbable外科縫合によりレシピエントマウスの膵臓に生後マウスのホモグラフト腫瘍片を有する。6-Oシルク縫合糸で腹部を二重縫い目で閉じます。圧縮によって恒常性を達成する。腫瘍移植を終了した後、出血または腫瘍組織漏れが起こらない限り、動物を暖かいケージに入れておく。彼らは胸骨の不用さを維持するために十分な意識を取り戻すまで、動物を監視します。麻酔から完全に回復した後、動物室に動物を戻します。脾臓付近の腹部を触診して腫瘍変化マウスを監視し、直交性腫瘍を持つマウスを選択します。腫瘍ごとに、腫瘍消化バッファーを備えた1つのCチューブを準備します。腫瘍が完全に消化されるように、0.8グラム未満の腫瘍断片に対して3ミリリットルの消化バッファーを使用する。研究コード、腫瘍、マウスID、治療群、および腫瘍重量で腫瘍にラベルを付けます。マウスから腫瘍を収集します。腫瘍を冷たいPBSで洗い、腫瘍に付着した組織をきれいにしてください。消化培地に腫瘍を無菌の6ウェルプレートの1つの井戸に入れる。無菌ピンセットまたは鉗子で腫瘍を所定の位置に保持し、メスでスライスします。腫瘍を十分にスライスして小さくします。次に、腫瘍片をCチューブに戻し、残りの消化バッファーを使用してプレートを洗浄します。液体をCチューブに移し、消化するまで氷の上に置きます。次に、ディソシエタとヒーターのスイッチを入れ。腫瘍解離Cチューブを空き位置のスリーブに逆さまに置きます。チューブの位置のステータスを[フリー]から[選択済み]に調整します。プログラムの一覧が表示される必要なフォルダの選択に従って、解除プログラムを選択します。プログラム終了後、Cチューブを解離器から取り出し、サンプルをパレットに短時間回転させます。サンプルを再中断し、50ミリリットルチューブの上の細胞ストレーナーに入れます。10ミリリットルの洗浄バッファーで細胞ストレーナーを通して細胞を洗浄し、単一の細胞懸濁液を提供します。300Gで5分間遠心管を閉心した後、上清を捨て、5ミリリットルの洗浄バッファーで細胞を再懸濁する。生存細胞を数え、チューブあたりまたはサンプル当たり100万個の細胞に細胞濃度を調整します。免疫パネル設計、免疫染色および蛍光からテキストプロトコルの詳細として1つのコントロールを引いたものを実行します。流れ器が使用する前にそれらを徹底的に渦巻くことによってウォーミングアップしている間、UltraCompビーズを準備してください。フルオロクローム共役抗体ごとに、12 x 75ミリメートルのサンプルチューブにラベルを付けます。各チューブに100マイクロリットルの染色バッファーを追加し、ビーズの1つのフルドロップを続けます。抗体を追加し、テキストプロトコルに記載されているように染色手順を実行します。その後、各ビーズペレットに0.5ミリリットルの染色バッファーを加え、渦を介して完全に再中断します。ここで、所定の実験に対して、目標組織あたりのフローサイトメトリーPMT電圧を設定します。前方散乱および側面散乱の測定値ごとにシングルビーズの個体数を得ることによってデータ取得のためのフローサイトメトリーを通してサンプルを通してサンプルを実行します。流量を毎秒 200 ~ 300 イベントに設定します。FL1対FL1ドットプロットを用いて、所定のフルオレセインFITC結合抗体に対して適切な補償を設定します。負のビーズが左下の象限内に、正のビーズが右上または右下の象限内になるように、四半角ゲートを配置します。各集団の中央値フルオレセイン強度がほぼ等しくなるまで補償値を調整します。すべてのチューブに対して、これらの手順を繰り返します。次に、実際の染色サンプルの取得に進みます。補正ウィザードを実行し、日付、実験、およびイニシャルの形式で設定を保存します。膵管腺癌の異形性移植は、皮下移植に見られるものと同様の急速な腫瘍増殖をもたらした。代表的なヘマトキシリンおよびエオシン染色画像が示され、皮下および異形性移植器の同様の成長を示す。適度に高い生存細胞収率は、両方のタイプの移植の腫瘍試料から得られた。代表的なFACSスプラットは、死細胞および細胞破片から分離された腫瘍から生存可能な細胞を示す。ここに示す、腫瘍免疫細胞のいくつかの主要なサブセットの主要な分子細胞集団の免疫プロファイルの比較を浸潤する腫瘍である。膵臓癌の皮下対交方同種の同種移植が示されている。このデータは、腫瘍が健康なマウスの膵臓と比較して免疫細胞浸潤を有意に増加させたことを明らかに示している。さらに、異なる割合の腫瘍浸潤免疫細胞サブセットが、異なった割合で、異なった異形と皮下の同種移植片で発見された。例えば、異方性のB細胞は皮下よりも有意に多い。この手順を試みている間、すべての関連する材料および試薬を事前に準備することを忘れないでください。このビデオを見た後、マウス モデルの FACS 解析を実行する方法についてよく理解する必要があります。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

膵臓がんの蛍光同所性マウスモデル

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

周辺照射による疲労のマウスモデル

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

不可逆エレクトロポレーションの効果を研究する同系膵癌マウス モデル

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

アンドロゲン依存性去勢抵抗性前立腺癌の生物発光と蛍光の同所性同種同系マウスモデル

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

PD L1 の発現を研究する同系の肺腺癌細胞の同所性同種移植

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

真似をして 3次元細胞培養の膵腺房の上皮化生を操作します。

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

患者由来膵管腺癌オルガノイドモデルの単離と特徴付け

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

マウス膵管腺癌の超音波誘導矯正着移植

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

膵臓腺癌の腫瘍微小環境を調べるための近位液の分離

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

膵臓癌の正交性切除マウスモデル

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...