Name: immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry
Uploaded: 2018-10-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry at JoVE.com

저자는 박사 조디 Barbeau-중요 한 읽기 및 원고, 편집에 대 한 감사 드리고 그리고 삽화를 디자인 하기 위한 랄 프 마누엘을 감사 합니다. 저자는 또한 크라운 생명 종양 면역-종양학 바이오 마커 팀과 그들의 기술 노력에 대 한 종양 Vivo에서 팀을 감사 하 고 싶습니다.

모든 프로토콜 및 목 또는 동물의 사용 및 관리 절차 검토 하 크라운 생명 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 연구의 행위 사전 승인 합니다. 관심과 동물의 사용 일반적으로 실시 됩니다 AAALAC (평가 및 실험 동물 관리 인증 협회) 국제 지침에 따라 관리를 사용 하 여 실험실 동물의, 국가 연구 가이드에 보고 위원회 (2011 년). 모든 동물 실험 절차 SPF (특정 병원 체 무료) 시설에서 무 균 조건 하에?...

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	<li>Chevrier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Immune+Atlas+of+Clear+Cell+Renal+Cell+Carcinoma.">An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma.</a> Cell. 169 (4), 736-749 (2017).</li><li>Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+immune+responses+in+the+tumor+microenvironment.">Monitoring immune responses in the tumor microenvironment.</a> Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).</li><li>Mosely, S. 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I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+nature+of+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice.">Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Landscape+in+Early+Lung+Adenocarcinoma+by+Paired+Single-Cell+Analyses.">Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses.</a> Cell. 169 (4), 750-765 (2017).</li><li>Mahoney, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Antibodies+to+Its+Cytoplasmic+Domain+Most+Clearly+Delineate+Cell+Membranes+in+Immunohistochemical+Staining+of+Tumor+Cells.">PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).</li><li>Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+expression+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+is+a+poor+prognostic+factor+in+patients+with+high+CD8++tumor-infiltrating+lymphocytes:+highly+sensitive+detection+using+phosphor-integrated+dot+staining.">PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining.</a> Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImmunoScore+Signature:+A+Prognostic+and+Predictive+Tool+in+Gastric+Cancer.">ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer.</a> Ann. Surg. , (2016).</li><li>Ribas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+Blockade+Expands+Intratumoral+Memory+T+Cells.">PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).</li></ol>

비록 연구 SC 종양을 사용 하 여 더 쉽게 실시 하 고, orthotopically 이식 종양 모델 수 있습니다 전 임상 약리학 연구 (특히 I/O 조사)에 대 한 관련성이 향상 된 translatability를 제공 하. 이 보고서는 관심이 독자/시청자 직접 그들의 각각 연구에 사용할 수 있는 기술 절차를 시각화 수 있도록 목표로 합니다. 우리의 프로토콜 입증 그 orthotopic PDAC 이식 효율적인 종양 성장, SC 주입 비슷한 발생할 수 있습니?...

췌 장 ductal 선 암 (PDAC) 하면 거의 절반 백만 mortalities 세계-넓은 매년 상위 5 암 살인범 중 하나. 몇 가지 효과적인 치료 옵션 및 아무 승인된 immunotherapies; 따라서, 새로운 치료 필사적으로 필요 합니다. 암은 점점 오늘 알려진 유전 질환 뿐만 아니라 PDAC를 포함 하 여 면역 질병으로 인식 되 고 있습니다. 면역 및 유전적 요인 치료 뿐만 아니라 질병의 예 후 결정 가능성이 결과. 종양은 호스트 면역 감시를 회피 하 고 결국 죽음을 미리. 이러한 면역 프로세스의 많은 내 발생 종양 microenvironment (TME)1,2,,34 어디 다른 종류의 면역 세포 작용 종양 세포와, 서로 다른 종양 stromal 구성 요소, 직접 또는 간접적으로 궁극적으로 질병 결과 결정 하는 cytokines. 따라서, TME, 또는 종양 immunophenotyping, 동등, 세는 법 및 면역 세포의 다른 계보의 지역화를 포함 하 여 종양 면역 구성의 특성은 항 종양 면역을 이해 하는 데 중요 합니다. PDAC, 경우 그것은 제안 되었습니다 그 높은 종양 침투 진압 대 식 세포 (TAM) 및 B 세포 T 세포 침투 활성화의 예방 및 섬유 증5,6의 높은 수준으로 이끈.
면역 TMEs을 실험적으로 조사 하는 일반적인 방법은 대리 종양 전 임상 동물 모델을 사용 하는 것, 주로 관련 마우스 종양 모델7, 특히 마우스 syngeneic (homograft) 또는 유전자 조작된 마우스 모델 (GEMM) 암, 마우스와 인간 종양과 면역8,9의 가정된 유사성에. 두 종10,11사이의 고유의 차이 현실에서 이해 된다.
종양 이식된 마우스는 자발적인 종양7, 즉 동기화 된 종양 개발, 부모의 GEMM 자연 종양 개발 달리 상당한 운영 이점이 있다. 자발적인 murine 종양의 homografts 1 차 종양 적 데 조작 생체 외에서미러링 원래 마우스 종양 조직-간주 됩니다 / 분자 병 리7, 뿐만 아니라 가능한 면역 프로필. 이러한 murine homografts는 종종 "환자 파생 xenografts (PDXs)의 마우스 버전" 간주 됩니다. 그들은 따라서 가능성이 있다 기존의 syngeneic 셀 라인 파생 마우스 종양12보다 더 나은 translatability. 특히, 많은 homografts는 특정 인간 질병 메커니즘, 예를 들면 종양 드라이버 돌연변이, 설계는, 그리고이 homografts 그러므로 그들의 임상 관련성에 이점이 있어야 특정 GEMM에서 파생 됩니다. 특히, KPC GEMM 형태학 상으로 주로 잘에 알맞게-차별화 된 선의 건축과 인간의 질병이 고 높은 기질 있는 나이의 15-20 주 이내 마우스 PDAC 개발. 이 모델은 또한 인간의 PDAC, 즉 Kra 90%와 인간의 PDAC, 각각5,6의 75%에서 발생 하는 돌연변이 P53 손실-의-기능을 활성화의 가장 일반적인 유전자 기능을이.
이식의 사이트는 또한 모델 translatability에 역할을 제안 되었습니다. 해당 orthotopic 환경 등 특정 주변 조직 환경 일반적으로 이식된 종양에 대 한 균일 한 피하 (SC) 반대로 진행 환경에 특정 종양에 대 한 틈새 수 있습니다. 그것은 특정 관심의 것 경우, 어떤 차이가 존재 하는 면역-microenvironment, 및 인간의 암에 관련성 두 이식 사이트 간에 예그리고/또한. PDAC 경우.
면역 프로 파일링 또는 immunophenotyping의 가장 중요 한 측면 중 하나는 종양 침투 면역 세포의 다른 계보, 숫자, 종양, 내 상대 비율으로 그들의 활성화 상태 및 위치를 결정 하는. 이 포함 하는 종양-infiltratrating lymphoctyes (TILs, T-와 B-), 종양 침투 대 식 세포 (Tam), 자연 킬러 세포 종양 침투 (NKs) 및 종양 상주 수지상 세포3,,1314 , 15 , 16 , 17, 그리고 특정 셀18,,1920, 등등의 subcellular 지 방화. 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 또는 흐름 cytometry는 일반적으로 셀의 특정 파라미터를 측정 하는 데 사용 되는 단일 셀 탐지 기술. 멀티 컬러 cytometry 조치 단일 셀3,,421 에 여러 마커 흐름과 숫자와 면역 세포의 다른 하위 집합의 상대적 비율을 결정 하기 위해 가장 일반적으로 사용된 방법입니다. 그 종양을 포함 하 여.
이 보고서는 면역 세포 종양 침투를 프로 파일링 하는 절차를 설명 합니다: 1) SC 주입; 함께 orthotopic PDAC 마우스 종양 homografts의 주입 2) 종양 조직 수확 및 종양 분리; 통해 단일 셀 준비 모든 기준;으로 종양에서 파생 된 셀의 3) 흐름 cytometry 분석 4) 두 이식 방법의 기본 프로 파일의 비교.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine</td>
			<td>\</td>
			<td>SAS3119</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trocar 20</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>2mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotic and antimycotic</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Air chemical</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood</td>
			<td>AIRTECH</td>
			<td>BSC-1300IIA2</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibodies</td>
			<td>BD</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration</td>
			<td>BD</td>
			<td>354248</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffers</td>
			<td>BD</td>
			<td>554656</td>
			<td>Mincing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Staining Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>563794</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td>553142</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell filters</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>70&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>routine blood tube</td>
			<td>BD-Vacutainer</td>
			<td>365974</td>
			<td>2mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>vs 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3 Fix/Perm kit</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810R,5920R</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td>\</td>
			<td>vs 10.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable, sterile scalpels</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J12100</td>
			<td>11#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife handle</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J11010</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>Y00030</td>
			<td>Eye scissors 10cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>JD1060</td>
			<td>Eye tweezers 10cm with teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable liquid nitrogen tank</td>
			<td>Jinfeng</td>
			<td>YDS-175-216</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Metter Toledo</td>
			<td>AL204</td>
			<td>0-100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi C-tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi Gentle MACS with heater blocks</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-018-306</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryopreservation tube</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME</td>
			<td>PathClear</td>
			<td>3442-005-01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringes</td>
			<td>Shanghai MIWA medical industry</td>
			<td>\</td>
			<td>1-5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog software</td>
			<td>Studylog</td>
			<td>\</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Balance and supporting USB</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>SE601F</td>
			<td>Balance and supporting USB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Data line of vernier calipers</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>926.6721</td>
			<td>Data line of vernier calipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>910.1502.10</td>
			<td>Sylvac S-Cal pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339653</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339651</td>
			<td>15mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>KLCS-288</td>
			<td>4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PLF-276</td>
			<td>&#8212;20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>DW-862626</td>
			<td>&#8212;80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>am7021</td>
			<td>\</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry

Homograft (syngeneic) 종양은 오늘날의 면역-종양학 (I/O) 전 임상 연구의 주력. 종양의 microenvironment (TME), 특히 면역-구성, 예 후 및 치료 결과, immunotherapy의 특히 그의 예측에 필수적입니다. TME 면역-구성 요소 다 색 FACS에 의해 평가할 수 있는 면역 세포를 종양 침투의 다른 하위 집합으로 구성 됩니다. 췌 장 ductal 선 암 (PDAC) 좋은 치료 옵션, 따라서는 긴급 하 고 미 충족 의료 필요를 부족 한 치명적인 malignances 중 하나입니다. 그것의 비-응답 다양 한 요법 (항 암 치료-, 타겟, I/O)에 대 한 중요 한 이유 중 하나는 섬유 아 세포 및 이러한 치료에서 종양 세포를 보호 하는 백혈구의 구성 된 그것의 풍부한 TME 되었습니다. Orthotopically 이식된 PDAC는으로 더 정확 하 게 기존의 피하 (SC) 모델 보다 인간의 췌장암의 TME 탈환.
Homograft 종양 (KPC)는 마우스 자발적인 PDAC 유전자 조작된 KPC-마우스에서 발생의 이식 (KrasG12D / +/P53-/-/Pdx1-다시C) (KPC-GEMM). 기본 종양 조직 (~ 2 m m3) 작은 조각으로 자르고 피하 이식 (SC) syngeneic 받는 사람 (C57BL/6, 7-9 주 이전)에 게. homografts 수술 후 했다 orthotopically에 SC-주입, 17 일에 의해 300-1000 m m3 의 종양 볼륨에 도달 함께 새로운 C57BL/6 마우스의 췌 장 이식. 400-600 m m3 의 종양만 승인된 부검 절차 당 수확 되었고 인접 한 비 종양 조직을 제거 하는 청소. 그들은 다른 면역 세포의 다양 한 표시에 대 한 항 체 붙일 레이블 지정 패널 얼룩 다음 단일 셀 정지로 조직 dissociator를 사용 하 여 프로토콜 당 해리 했다 (림프, 골수성 NK, Dc). 얼룩진된 샘플 종양 내에서 그들의 상대적인 비율 뿐 아니라 다른 계보의 면역 세포의 숫자를 결정 하기 위해 다 색 FACS를 사용 하 여 분석 되었다. Orthotopic 종양의 면역 프로필 다음 SC 종양의 그들에 비교 되었다. 예비 데이터 췌 장, 그리고 사우스 캐롤라이나 종양 보다는 오히려 orthotopic 높은 B-세포 침투 종양에서 상당히 높은 침투 TILs/Tam을 시연 했다.

PDAC Orthotopic 이식 결과 급속 한 종양 성장 SC 주입에 대 한 본 비슷합니다. 기증자 종양 조각을 받는 쥐로 이식 된 후 모두 피하 및 2.1과 2.2 프로토콜에 따라 orthotopically 단계에 설명 된, 그림 1A와 같이 이식된 KPC homograft 종양 유사한 급속 한 성장을 보여주었다 . KPC homograft 종양 다른 시간 지점에서 수확 그림 1B 에서 표시 되 고 대?...

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Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Murine orthotopic PDAC homografts immunophenotyping에 실험 절차는 종양 면역 microenvironment 프로 파일링 목표로 합니다. 종양은 수술을 통해 이식 하는 orthotopically. 종양 크기에 200-600 m m3 의 수확 되었고 단일 셀 정지, 여러 면역 표식 FACS 분석 다른 붙일 표시 된 항 체를 사용 하 여 다음을 준비 하는 해리.

Immunophenotyping Orthotopic Homograft (Syngeneic) Murine 기본 KPC 췌 장 Ductal 선 암의 Cytometry로의

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

이 메시지는 다른 면역 계보 및 노화 전략을 식별하는 데 사용되는 마커와 같은 Murine 모델의 면역 페노티핑의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 면역페노티핑시 마커 및 노화 상태기가 다양한 뮤린 모델에 적용될 수 있다는 것입니다. 균형을 이용하여 C57 블랙 6 마우스의 체중을 모니터링합니다.또한, 구경 측정에 의해 기증자 마우스를 변화종양의 종양 부피를 모니터링한다. 프로토콜에 따라 생물학적 위험에 지은 동물의 안락사를 따라, 이오도프르 면봉을 사용하여 종양 주위의 피부를 살균. 수술 후 종양을 텍스트 프로토콜에 자세히 설명한 대로, 종양을 PBS의 20 밀리리터를 함유한 페트리 접시에 놓는 것은 섭씨 4도까지 미리 냉각되었다.혈액을 오염시키는 경우에, 다른 Petri 접시로 종양을 전송하고 PBS로 종양을 세척합니다. 종양을 반으로 자른다. 여분의 피부, 혈관, 석회화 및 괴사를 제거하십시오.그대로 남아 있는 종양 조각만 선택하고 멸균 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 넣습니다. 약리학 연구를 위한 별도의 동물 방에 튜브를 수송하기 전에 PBS의 20 밀리리터를 추가합니다. 직교 이식을 준비하려면 오른쪽 측면 위치에있는 실험 보드에 완전히 마취 마우스를 수정하십시오.이도딘으로 비장 주위의 피부를 소독한 다음 75 %의 에틸 알코올로 디이디네이트를 제거하십시오. 비장의 중앙값을 찾아 복부에 1센티미터 수직 절개를 하여 비장을 노출시합니다. 부드럽게, 평평한 팁 핀셋을 사용하여 비장 아래에 췌장 조직의 일부를 그립니다.및 9-O bsorbable 수술 봉합사에 의해 받는 마우스의 췌장에 C 마우스에서 마우스 균질 이식 종양 조각을 sutro. 복부락을 6-O 실크 봉합사로 이중 솔기로 닫습니다. 압축으로 항상성을 달성합니다.종양 이식을 마친 후 출혈이나 종양 조직 누출이 발생하지 않는 한 동물을 따뜻한 케이지에 보관하십시오. 동물을 감시하여 흉골 의식으로 충분한 의식을 회복할 때까지 모니터링합니다. 마취에서 완전히 회복 한 후 동물 방으로 동물을 반환합니다.비장 근처의 복부를 만지켜서 종양이 변화하는 마우스를 모니터링하고 직교 종양을 베어링 하는 마우스를 선택합니다. 각 종양에 대해 종양 소화 완충제로 C 튜브 1개를 준비합니다. 종양이 완전히 소화되도록 종양 단편0.8 그램 미만의 소화 완충제 3 밀리리터를 사용하십시오.연구 코드, 종양, 마우스 ID, 치료 그룹 및 종양 중량으로 종양에 라벨을 부착합니다. 마우스에서 종양을 수집합니다. 감기 PBS에서 종양을 씻고 종양에 부착 된 조직을 청소하십시오.멸균 6웰 플레이트의 한 웰에 종양을 소화 매체에 놓습니다. 멸균 핀셋이나 집게로 종양을 제자리에 고정하고 메스로 슬라이스하십시오. 종양을 잘 슬라이스하여 작은 조각으로 부서질 수 있습니다.이제 종양 조각을 C-튜브에 다시 넣고 나머지 소화 버퍼를 사용하여 접시를 씻습니다. 액체를 C-튜브로 옮기고 소화될 때까지 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 히터로 해리를 켭니다.종양 해리 C-튜브를 빈 위치의 소매에 거꾸로 놓습니다. 무료에서 선택됨으로 튜브 위치 상태를 조정합니다. 프로그램 목록이 표시되는 필수 폴더를 선택하여 해리 프로그램을 선택합니다.프로그램이 종료된 후, C-튜브를 소각기에서 꺼내 서 샘플을 팔레트로 간단히 돌보세요. 이제 샘플을 다시 중단하고 50 밀리리터 튜브 위의 세포 여과기에 넣습니다. 셀 스트레이너를 통해 셀을 세척하여 10 밀리리터의 세척 버퍼를 사용하여 단일 셀 서스펜션을 제공합니다.300 G에서 5분 동안 원심분리한 후, 수퍼네티드를 버리고 5밀리리터의 세척 버퍼로 세포를 다시 중단합니다. 실행 가능한 세포를 계산하고 튜브 당 또는 샘플 당 1백만 세포로 세포 농도를 조정합니다. 면역 패널 설계, 면역 염색 및 형광을 텍스트 프로토콜의 세부 사항으로 하나의 컨트롤을 뺀 수행합니다.유동 악기가 사용하기 전에 철저히 소용돌이로 워밍업하는 동안 UltraComp 구슬을 준비하십시오. 각 플루오로크롬스 공액 항체에 대해 별도의 12 x 75 밀리미터 샘플 튜브에 라벨을 부착합니다. 각 튜브에 100 마이크로리터의 염색 버퍼를 추가하여 구슬한 방울을 한 방울만 떨어뜨립니다.항체를 추가하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 염색 절차를 수행합니다. 그런 다음 각 비드 펠릿에 0.5 밀리리터의 염색 버퍼를 추가하고 소용돌이를 통해 완전히 다시 중단하십시오. 이제 주어진 실험을 위해 대상 조직당 유동 세포측정 PMT 전압을 설정합니다.전방 분산 및 측면 분산 판독값당 단일 비드 집단을 확보하여 데이터 수집을 위한 흐름 세포측정을 통해 샘플을 실행합니다. 초당 약 200~300개의 이벤트의 유량을 설정합니다. FL1 대 FL1 도트 플롯을 사용하여 주어진 형광FITC 컨쥬게이션 항체에 대한 적절한 보상을 설정합니다.네거티브 구슬이 왼쪽 아래 사분면 내에 있고 양수 구슬이 오른쪽 위 또는 아래 쪽 사분면 내에 있도록 사분면 게이트를 배치합니다. 각 집단의 중간 형광강도가 약 같을 때까지 보상 값을 조정합니다. 모든 튜브에 대해 이 단계를 반복합니다.지금, 실제 얼룩 견본을 취득하기 위하여 진행하십시오. 보상 마법사를 실행하고 날짜, 실험 및 이시사항의 형식으로 설정을 저장합니다. 췌장 덕트 선암의 정형소 이식은 피하 이식에서 본 것과 유사한 급속한 종양 성장을 초래했습니다.대표적인 헤마톡시린과 에오신 염색 이미지가 표시되고 피하 및 정형소 임플란트의 유사한 성장을 보여줍니다. 합리적으로 높은 실행 가능한 세포 수율은 두 유형의 이식의 종양 샘플로부터 수득하였다. 대표적인 FACS 스플랫은 죽은 세포 및 세포 파편에서 분리된 종양으로부터 실행 가능한 세포를 보여줍니다.여기에 도시된 종양은 종양 면역 세포의 여러 주요 하위 집합의 주요 및 분자 세포 집단의 면역 프로파일 비교에 침투하는 종양이다. 췌장암의 피하 대 정형소 동종 이식이 나타난다. 데이터는 명확하게 종양이 건강한 마우스의 췌장과 비교되는 때 면역 세포 침투를 현저하게 증가한다는 것을 보여줍니다.또한, 면역 세포 하위 집합에 침투하는 종양의 다른 백분율은 피하 균형 이식대 직교에서 발견되었다. 예를 들어, 피하보다 정형소에 있는 훨씬 더 많은 B 세포가 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 사전에 모든 관련 재료와 시약을 준비하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 비디오를 시청한 후에는 뮤린 모델에 대한 FACS 분석을 수행하는 방법에 대해 잘 이해해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

췌장암의 형광 동소 이식 마우스 모델

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

연구

암 연구학

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

주변 방사선 조사에 의해 유도 된 피로의 마우스 모델

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

돌이킬 수 없는 Electroporation의 효과 공부 하는 Syngeneic 췌 장 암 마우스 모델

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

발광 및 형광 Orthotopic Syngeneic Murine 모델 Androgen 종속 및 거세 내성 전립선 암

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic PD L1 식 공부 Syngeneic 폐 선 암 세포의 이식

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

흉내 낸 고 3 차원 세포 배양에서 췌 장 Acinar-Ductal Metaplasia 조작

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

환자 유래 췌장 선암 조직형 모델의 격리 및 특성 분석

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

뮤린 췌장 연성 선암의 초음파 유도 정형 외 이식

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

췌장 선암의 종양 미세 환경을 조사하기위한 근위액 분리

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

췌장암의 정형소 절제술 마우스 모델

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...