Name: immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry
Uploaded: 2018-10-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry at JoVE.com

Forfatterne vil takke Dr. Jody Barbeau - for kritisk lesing og redigering av manuskriptet, og takke Ralph Manuel utforme kunstverk. Forfatterne vil også gjerne takke Crown Bioscience onkologi Immuno-onkologi biomarkør team og onkologi I Vivo team, for deres store teknisk innsats.

Alle protokoller og amendment(s) eller prosedyrer som omfatter omsorg og bruk av dyr er vurdert og godkjent av kronen Bioscience institusjon for dyr og bruke Committee (IACUC) før gjennomføring av studier. Den omsorg og bruk av dyr vil vanligvis utføres AAALAC (Association for vurdering og akkreditering av laboratoriet dyr omsorg) internasjonale retningslinjer som rapportert i Guide og bruk av forsøksdyr, National Research Rådet (2011). Alle dyr eksperimentelle prosedyrer vil være under sterile forhold på SPF (spe...

<ol>
	<li>Chevrier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Immune+Atlas+of+Clear+Cell+Renal+Cell+Carcinoma.">An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma.</a> Cell. 169 (4), 736-749 (2017).</li><li>Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+immune+responses+in+the+tumor+microenvironment.">Monitoring immune responses in the tumor microenvironment.</a> Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).</li><li>Mosely, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+Selection+of+Syngeneic+Preclinical+Tumor+Models+for+Immunotherapeutic+Drug+Discovery.">Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery.</a> Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).</li><li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+focal+adhesion+kinase+renders+pancreatic+cancers+responsive+to+checkpoint+immunotherapy.">Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy.</a> Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).</li><li>Gunderson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruton+Tyrosine+Kinase-Dependent+Immune+Cell+Cross-talk+Drives+Pancreas+Cancer.">Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer.</a> Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).</li><li>Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+modeling+for+immuno-oncology.">Experimental animal modeling for immuno-oncology.</a> Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).</li><li>Takao, K., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+greatly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).</li><li>Payne, K. J., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-cell+lineage+commitment:+translation+from+mice+to+humans.">Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans.</a> Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>von Herrath, M. G., Nepom, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+translation:+barriers+to+implementing+clinical+immunotherapeutics+for+autoimmunity.">Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity.</a> J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).</li><li>Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+to+evaluate+novel+and+conventional+therapeutic+strategies+for+cancer.">Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer.</a> Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).</li><li>Erdag, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotype+and+immunohistologic+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+are+associated+with+clinical+outcome+in+metastatic+melanoma.">Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma.</a> Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).</li><li>Guti&#233;rrez-Garcia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+and+not+immunophenotypic+algorithms+predicts+prognosis+in+patients+with+diffuse+large+B-cell+lymphoma+treated+with+immunochemotherapy.">Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy.</a> Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).</li><li>Paiva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1/PD-1+presence+in+the+tumor+microenvironment+and+activity+of+PD-1+blockade+in+multiple+myeloma.">PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma.</a> Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).</li><li>Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+nature+of+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice.">Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Landscape+in+Early+Lung+Adenocarcinoma+by+Paired+Single-Cell+Analyses.">Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses.</a> Cell. 169 (4), 750-765 (2017).</li><li>Mahoney, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Antibodies+to+Its+Cytoplasmic+Domain+Most+Clearly+Delineate+Cell+Membranes+in+Immunohistochemical+Staining+of+Tumor+Cells.">PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).</li><li>Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+expression+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+is+a+poor+prognostic+factor+in+patients+with+high+CD8++tumor-infiltrating+lymphocytes:+highly+sensitive+detection+using+phosphor-integrated+dot+staining.">PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining.</a> Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImmunoScore+Signature:+A+Prognostic+and+Predictive+Tool+in+Gastric+Cancer.">ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer.</a> Ann. Surg. , (2016).</li><li>Ribas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+Blockade+Expands+Intratumoral+Memory+T+Cells.">PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).</li></ol>

Selv om studier med SC svulster er mer gjennomført, kan orthotopically implantert svulster modeller potensielt være mer relevant for prekliniske farmakologi studier (spesielt I/O undersøkelser) å gi forbedret translatability. Denne rapporten tar sikte på å hjelpe interesserte lesere/publikum å visualisere direkte teknisk prosedyrer som kan brukes i deres respektive forskning. Våre protokoller viser at orthotopic implantering av PDAC kan føre til effektiv tumor vekst, ligner på SC implantasjon. Våre observasjon...

Bukspyttkjertelen ductal adenocarcinoma (PDAC) fører til nesten en halv en million dødelighet verden årlig, en av de topp 5 kreft morderne. Det er noen effektive behandlingstilbud og ikke godkjente immunotherapies; Derfor trengte nye behandlinger desperat. Kreft blir stadig mer anerkjent som immunologiske sykdommer, inkludert PDAC, i tillegg til de genetiske sykdommene som kjent i dag. Immunologiske og genetiske faktorer vil trolig avgjøre sykdom prognose samt behandling resultater. Svulster unngå vert immun overvåking og til slutt fremme for å føre til døden. Mange av disse immun prosesser skjer innenfor svulst microenvironment (TME)1,2,3,4 der ulike immunceller samhandle med kreftceller, med hverandre og med andre svulst stromal komponenter, direkte eller indirekte via cytokiner som til slutt bestemmer sykdom utfallet. Derfor er karakteristikk av svulst immun komponentene TME eller svulst immunophenotyping, inkludert subtyping, numeration og lokalisering av ulike linjene av immunceller, avgjørende for å forstå anti-tumor immunitet. Ved PDAC, det har blitt foreslått at forhøyet svulst-infiltrere undertrykkende makrofager (TAM) og B-celler har ført til forebygging av T-celle infiltrasjon og/eller aktivisering og høye nivåer av fibrosis5,6.
Den felles tilnærmingen til undersøker immun TMEs eksperimentelt ville være å bruke surrogat svulst prekliniske dyremodeller, hovedsakelig relevante musen svulst modeller7, spesielt musen syngeneic (homograft) eller genmodifisert musen modeller (GEMM) av kreft, på antatt likheten av mus og menneskelige for svulster og immunitet8,9. Det er forstått i virkeligheten at det er iboende forskjellene mellom de to arter10,11.
Transplantert musen tumorer har betydelig operativ fordeler fremfor spontan svulster7, nemlig synkronisert tumor utvikling, i motsetning til foreldre GEMM spontan tumor utvikling. Homografts av spontane murine svulster anses primære tumorer har aldri vært manipulert i vitroog speiling opprinnelige mus svulst histo- / molekylær patologi7, samt mulig immun profiler. Disse murine homografts anses ofte for å være "en mus versjon av pasient-avledede xenografts (PDXs)". De derfor har trolig en bedre translatability enn konvensjonelle syngeneic celle linje-avledet musen svulster12. Særlig er mange homografts avledet fra bestemte GEMM der bestemte menneskelig sykdom mekanismer, f.eks kreftfremkallende driveren mutasjoner, er konstruert, og disse homografts må derfor fordeler til sin kliniske relevans. Spesielt utvikle KPC GEMM musen PDAC i 15-20 ukens av alderen, som viser morphologically menneskelig sykdom med hovedsakelig godt - til moderat-differensiert kjertel arkitektur og høyanriket stroma. Denne modellen viser også genetisk funksjoner av menneskelig PDAC, nemlig Kras aktivering mutasjon og P53 tap av funksjon, som oppstår i 90% og 75% av human PDAC, henholdsvis5,6.
Områder av transplantasjon har også blitt foreslått for å spille en rolle i modellen translatability. Bestemt vev omgivelsene, for eksempel et tilsvarende orthotopic miljø, kan være en nisje for bestemte svulstene fremgang, i motsetning til uniform subcutaneous (SC) miljøer for ofte transplantert svulster. Det ville være av spesiell interesse hvis, og/eller, hva forskjell eksisterer mellom to transplantasjon områder, immun-microenvironment og relevansen til menneskelig kreft, f.eks. ved PDAC.
En av de viktigste aspektene av immun profilering, eller immunophenotyping, er å bestemme svulst-infiltrere immunceller av ulike linjene, tallene, relative andelen i svulster, samt aktivisering stater og steder. Dette inkluderer svulst-infiltratrating lymphoctyes (TILs, både T- og B-), tumor-infiltrere makrofager (TAMs), tumor-infiltrere naturlige drepe celler (NKs) og svulst-resident dendrittiske celler3,13,14 , 15 , 16 , 17og den subcellular lokaliseringen av visse celler18,19,20, etc. Fluorescens aktivert celle sortering (FACS) eller flow cytometri er en enkeltcelle registreringsteknologien som vanligvis brukes til å måle de spesifikke parameterne i en celle. Multi-farge flyt cytometri måler flere indikatorer på en enkelt celle3,4,21 , og er den mest brukte metoden for å bestemme tallene og relative andelen av forskjellige undergrupper av immunceller, inkludert de i svulster.
Denne rapporten beskriver fremgangsmåter for profilering svulst-infiltrere immunceller: 1) implantering av orthotopic PDAC musen svulst homografts, sammen med SC implantasjon; 2) tumor vev harvest og enkelt celle forberedelse via svulst avstandtagen; 3) flyt cytometri analyse av alle cellene stammer fra svulster som grunnlinjen; 4) sammenligning av planlagte profiler av begge transplantasjon tilnærminger.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine</td>
			<td>\</td>
			<td>SAS3119</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trocar 20</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>2mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotic and antimycotic</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Air chemical</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood</td>
			<td>AIRTECH</td>
			<td>BSC-1300IIA2</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibodies</td>
			<td>BD</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration</td>
			<td>BD</td>
			<td>354248</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffers</td>
			<td>BD</td>
			<td>554656</td>
			<td>Mincing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Staining Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>563794</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td>553142</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell filters</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>70&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>routine blood tube</td>
			<td>BD-Vacutainer</td>
			<td>365974</td>
			<td>2mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>vs 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3 Fix/Perm kit</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810R,5920R</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td>\</td>
			<td>vs 10.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable, sterile scalpels</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J12100</td>
			<td>11#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife handle</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J11010</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>Y00030</td>
			<td>Eye scissors 10cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>JD1060</td>
			<td>Eye tweezers 10cm with teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable liquid nitrogen tank</td>
			<td>Jinfeng</td>
			<td>YDS-175-216</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Metter Toledo</td>
			<td>AL204</td>
			<td>0-100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi C-tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi Gentle MACS with heater blocks</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-018-306</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryopreservation tube</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME</td>
			<td>PathClear</td>
			<td>3442-005-01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringes</td>
			<td>Shanghai MIWA medical industry</td>
			<td>\</td>
			<td>1-5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog software</td>
			<td>Studylog</td>
			<td>\</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Balance and supporting USB</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>SE601F</td>
			<td>Balance and supporting USB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Data line of vernier calipers</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>926.6721</td>
			<td>Data line of vernier calipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>910.1502.10</td>
			<td>Sylvac S-Cal pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339653</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339651</td>
			<td>15mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>KLCS-288</td>
			<td>4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PLF-276</td>
			<td>&#8212;20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>DW-862626</td>
			<td>&#8212;80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>am7021</td>
			<td>\</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry

Homograft (syngeneic) tumorer er arbeidshesten dagens immuno-onkologi (i/u) prekliniske forskning. Svulst microenvironment (TME), spesielt immun-komponentene, er avgjørende for prognose og prediksjon av behandlingsresultater, spesielt de av immunterapi. TME immun-komponenter består av forskjellige undergrupper av svulst-infiltrere immunceller assessable av multi-farge FACS. Bukspyttkjertelen ductal adenocarcinoma (PDAC) er blant de farligste malignances mangler gode behandlingstilbud, dermed et presserende og udekkede medisinske behov. En viktig årsak til den ikke-responsen på ulike behandling (kjemoterapi-, målrettet, I/O) har vært dens rikelig TME, bestående av fibroblaster og leukocytter som beskytte tumorceller fra disse behandlingsformer. Orthotopically implantert PDAC antas å mer nøyaktig gjenerobre TME av menneskelig pancreatic kreft enn konvensjonelle subcutaneous (SC) modeller.
Homograft svulster (KPC) er transplantasjon av musen spontan PDAC stammer fra genmodifiserte KPC-mus (KrasG12D / +/P53- / -/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). Det primære svulst vev er skåret i små fragmenter (~ 2 mm3) og transplantert subcutaneously (SC) til syngeneic mottakerne (C57BL/6, 7-9 uker gamle). Homografts ble deretter kirurgisk orthotopically transplantert til bukspyttkjertelen nye C57BL/6 mus, sammen med SC-implantasjon, som nådde svulst mengder 300-1000 mm3 17 dager. Bare svulster på 400-600 mm3 ble høstet per godkjent obduksjon prosedyre og renset for å fjerne tilstøtende ikke-tumor vev. De var dissosiert per protokoll en vev dissociator i én celle suspensjoner, etterfulgt av flekker med angitte paneler med fluorescently-merket antistoffer for ulike markører av ulike immunceller (lymfoide, myelogen og NK, DCs). Farget prøvene ble analysert bruker multi-farge FACS til å bestemme antall immunceller av ulike linjene, samt deres relative andelen i svulster. Immun profiler orthotopic svulster ble sammenlignet med de av SC svulster. De foreløpige dataene har vist betydelig opphøyet infiltrere TILs/TAMs i svulster over bukspyttkjertelen og høyere B-celle infiltrasjon i orthotopic i stedet for SC svulster.

Orthotopic implantering av PDAC resulterte i rask tumorveksten lik som sett for SC implantasjon. Etter donor svulst fragmenter ble implantert i mottakerens mus, både subcutaneously og orthotopically i henhold til protokoller beskrevet i trinnene 2.1 og 2.2, implantert KPC homograft svulstene vist lignende rask vekst som vist i figur 1A . KPC homograft svulster høstes ved ulike tidspunkt vises i figur 1B og representant H & E bi...

Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry at JoVE.com

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Den eksperimentelle prosedyren på immunophenotyping av murine orthotopic PDAC homografts tar sikte på profilering svulst immuno-microenvironment. Tumorer er orthotopically implantert via kirurgi. Svulster 200-600 mm3 størrelse var høstet og avstand for å forberede encellede suspensjoner, etterfulgt av flere immun markør FACS analyse ved hjelp av ulike fluorescently merket antistoffer.

Immunophenotyping av Orthotopic Homograft (Syngeneic) av Murine primære KPC bukspyttkjertelen Ductal Adenocarcinoma av flowcytometri

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Denne meldingen kan bidra til å svare på viktige spørsmål i Immunophenotyping i Murine-modeller, for eksempel markører som brukes til å identifisere forskjellige immunitetslinjer og aldringsstrategier. Den store fordelen med denne teknikken er at markøren og aldrende stategies, når immunofenotyping, kan brukes på en rekke murine modeller. Overvåk kroppsvekten til C57 Black 6-mus ved hjelp av en balanse.Også overvåke tumorvolumet av tumor varierende donor mus ved kalibremåling. Etter eutanasi av dyret i en biologiskhazard hette i henhold til protokollen, sterilisere huden rundt svulsten ved hjelp av Iodophor vattpinner. Etter kirurgisk fjerning av svulsten som beskrevet i tekstprotokollen, legg svulsten i en petriskål som inneholder 20 milliliter PBS som har blitt kjølt til 4 grader Celsius.Hvis det er forurensende blod, overfør svulsten til en annen petriskål og vask svulsten med PBS. Skjær svulsten i to. Fjern eventuell ekstra hud, kar, forkalkning og nekrose.Velg bare intakte biter av svulst og legg dem i et sterilt 50 milliliter sentrifugerør. Tilsett 20 milliliter PBS før du transporterer rør til et eget dyrerom for farmakologistudier. For å forberede ortotopisk implantasjon, fest en fullstendig bedøve mus på et eksperimentbord i riktig sidestilling.Desinfiser huden rundt milten med jod og de-iodinate med 75% etylalkohol. Finn medianpunktet i milten og lag et 1 centimeter vertikalt snitt på magen for å avsløre milten. Trekk forsiktig ut en del av bukspyttkjertelvevet under milten ved hjelp av flate tupp pinsett.Og sutro mus homograft tumor stykke fra C musen på bukspyttkjertelen av mottakeren musen av 9-O bsorbable kirurgisk sutur. Lukk magen med en 6-O silkesutur med dobbel søm. Oppnå homeostase ved kompresjon.Etter endt tumorimplantasjon, hold dyret i et varmt bur så lenge ingen blødning eller tumorvevslekkasje oppstår. Overvåk dyret til de gjenvinner tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency. Returner dyret til dyrerommet etter full gjenoppretting fra anestesi.Overvåk svulsten varierende mus ved palpering magen nær milten og velg ut musene bærer ortotopiske svulster. For hver svulst, forberede ett C-rør med tumor fordøyelsesbuffer. Bruk 3 milliliter fordøyelsesbuffer for tumorfragmenter mindre enn 0,8 gram for å sikre at svulsten er fullstendig fordøyd.Merk svulsten med studiekoden, svulsten, muse-ID-en, behandlingsgruppen og tumorvekten. Samle svulsten fra musen. Vask svulsten i kald PBS og rengjør vevet festet på svulsten.Plasser svulst i fordøyelsesmedier i en brønn av en steril 6-brønns plate. Hold svulsten på plass med sterile pinsett eller pinsett og skjær med en skalpell. Skjær svulsten godt nok til å bryte seg inn i mindre biter.Plasser nå svulstbitene tilbake i C-røret og bruk den gjenværende fordøyelsesbufferen til å vaske platen. Overfør væsken inn i C-røret og legg den på is til fordøyelsen. Slå deretter på dissosiatoren med varmeovner.Plasser tumordissosiasjonen C-rør opp ned i ermet på den ledige posisjonen. Juster statusen for rørposisjonen fra Fri til Valgt. Velg et dissosiasjonsprogram som følger av valget av den nødvendige mappen der listen over programmet vises.Etter avslutning av programmet, ta C-tube av dissosiatoren og spinn kort for å palle prøven. Nå, re-suspendere prøvene og sette dem inn i en celle sil over en 50 milliliter tube. Vask cellen gjennom cellesilen med 10 milliliter vaskebuffer for å gi en enkelt celle suspensjon.Etter sentrifugeringsrøret ved 300 G i 5 minutter, kast de overnaturante og re-suspendere cellene med 5 milliliter vaskebuffer. Telle levedyktige celler og justere cellekonsentrasjon til 1 million celle per rør eller per prøve. Utfør immunpaneldesign, immunstaining og fluorescens minus en kontroll som detaljer i tekstprotokollen.Forbered UltraComp-perler mens strømningsinstrumentene varmes opp ved å virvle dem grundig før bruk. Merk et separat 12 x 75 millimeter prøverør for hver fluorokrom konjugert antistoffer. Tilsett 100 mikroliter fargingsbuffer til hvert rør, følg av en full dråpe perlene.Legg til antistoffer og utfør fargeprosedyren som beskrevet i tekstprotokollen. Tilsett deretter 0,5 milliliter fargingsbuffer til hver perlepellet og fullstendig re-suspendere via virvel. Nå, sett Flow cytometri PMT spenning per målvev for det gitte eksperimentet.Kjør utvalget gjennom prøven gjennom Flow-cytometriet for datainnsamling ved å få på singlet perlepopulasjonen per fremoverspry og sidespryavlesninger. Angi strømningshastigheten rundt 200 til 300 hendelser per sekund. Angi riktig kompensasjon for en gitt fluorescein FITC-konjugeringsantistoffer ved hjelp av en FL1 versus FL1 dot plot.Plasser en kvadrantport slik at de negative perlene er innenfor nedre venstre kvadrant og de positive perlene er innenfor øvre eller nedre høyre kvadrant. Juster kompensasjonsverdiene til median fluoresceinintensitet for hver populasjon er omtrent lik. Gjenta disse trinnene for alle rør.Nå fortsetter du å anskaffe faktiske flekkprøver. Kjør kompensasjonsveiviseren, og lagre innstillingen med formatet:dato, eksperiment og initialene dine. Ortotopisk implantasjon av pankreas ductal adenokarsinom resulterte i rask tumorvekst som ligner på den som ble sett i subkutan implantasjon.Representative hematoksylin- og eosinfargingsbilder vises og viser lignende vekst av subkutane og ortotopiske implantater. Rimelig høye levedyktige celler avlinger ble hentet fra tumorprøven av begge typer implantasjon. Den representative FACS splat viser levedyktige celler fra svulst atskilt fra de døde cellene og celleavfall.Vist her, er en svulst som infiltrerer en immunprofilsammenligning av den store og tallcellepopulasjonen av flere viktige undergrupper av tumormunmunceller. Subkutan versus ortotopisk homograft av kreft i bukspyttkjertelen er vist. Dataene viser tydelig at svulsten har betydelig økning immuncelleinfiltrasjon sammenlignet med bukspyttkjertelen av friske mus.I tillegg ble det funnet ulike prosentandeler av tumorinfiltrerende immuncelleundergrupper i ortotopiske versus subkutane homografter. Det er for eksempel betydelig flere B-celler i ortopikisk enn i subkutan. Mens du prøver denne prosedyren er det viktig å huske å forberede alle tilknyttede materialer og reagenser på forhånd.Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en god forståelse av hvordan du utfører FACS-analyse for murine-modeller.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Fluorescent ortotopiske musemodell for kreft i bukspyttkjertelen

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

En musemodell av Fatigue indusert av Peripheral Bestråling

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

En Syngeneic bukspyttkjertelkreft musemodell å studere virkningene av Irreversible Electroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

En Bioluminescent og fluorescerende Orthotopic Syngeneic murint modell av Androgen-avhengige og kastrering-resistente prostatakreft

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic transplantasjon av Syngeneic lunge Adenocarcinoma celler å studere PD-L1 uttrykk

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Etterligne og manipulere bukspyttkjertelen Acinar til Ductal Metaplasi i 3-dimensjonale cellekultur

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolering og karakterisering av pasient-avledet bukspyttkjertelen ductal Adenokarsinom Organoid modeller

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultralyd-guidet Orthotopic implantation av murine bukspyttkjertelen ductal Adenokarsinom

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolering av proksimale væsker for å undersøke tumormikromiljøet i bukspyttkjerteladenokarsinom

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

En ortotopisk reseksjonell musemodell av kreft i bukspyttkjertelen

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...