Name: immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry
Uploaded: 2018-10-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry at JoVE.com

Os autores gostaria de agradecer o Dr. Jody Barbeau - leitura crítica e edição do manuscrito e graças a Ralph Manuel para a concepção de obras de arte. Os autores também gostaria de agradecer a equipe de coroa Bioscience biomarcador de imuno-Oncologia Oncologia e a equipe de Oncologia In Vivo , por seus grandes esforços técnicos.

Todos os protocolos e aditamentos ou procedimentos que envolvem o cuidado e a utilização de animais serão revistos e aprovados pela coroa Bioscience institucional Animal Care e Use Comité (IACUC) antes da realização de estudos. O cuidado e a utilização de animais serão normalmente conduzidas em conformidade com as diretrizes internacionais AAALAC (Associação para a avaliação e acreditação of Laboratory Animal Care) conforme relatado no guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório, pesquisa nacion...

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	<li>Chevrier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Immune+Atlas+of+Clear+Cell+Renal+Cell+Carcinoma.">An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma.</a> Cell. 169 (4), 736-749 (2017).</li><li>Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+immune+responses+in+the+tumor+microenvironment.">Monitoring immune responses in the tumor microenvironment.</a> Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).</li><li>Mosely, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+Selection+of+Syngeneic+Preclinical+Tumor+Models+for+Immunotherapeutic+Drug+Discovery.">Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery.</a> Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).</li><li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+focal+adhesion+kinase+renders+pancreatic+cancers+responsive+to+checkpoint+immunotherapy.">Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy.</a> Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).</li><li>Gunderson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruton+Tyrosine+Kinase-Dependent+Immune+Cell+Cross-talk+Drives+Pancreas+Cancer.">Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer.</a> Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).</li><li>Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+modeling+for+immuno-oncology.">Experimental animal modeling for immuno-oncology.</a> Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).</li><li>Takao, K., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+greatly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).</li><li>Payne, K. J., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-cell+lineage+commitment:+translation+from+mice+to+humans.">Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans.</a> Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>von Herrath, M. G., Nepom, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+translation:+barriers+to+implementing+clinical+immunotherapeutics+for+autoimmunity.">Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity.</a> J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).</li><li>Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+to+evaluate+novel+and+conventional+therapeutic+strategies+for+cancer.">Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer.</a> Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).</li><li>Erdag, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotype+and+immunohistologic+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+are+associated+with+clinical+outcome+in+metastatic+melanoma.">Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma.</a> Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).</li><li>Guti&#233;rrez-Garcia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+and+not+immunophenotypic+algorithms+predicts+prognosis+in+patients+with+diffuse+large+B-cell+lymphoma+treated+with+immunochemotherapy.">Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy.</a> Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).</li><li>Paiva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1/PD-1+presence+in+the+tumor+microenvironment+and+activity+of+PD-1+blockade+in+multiple+myeloma.">PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma.</a> Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).</li><li>Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+nature+of+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice.">Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Landscape+in+Early+Lung+Adenocarcinoma+by+Paired+Single-Cell+Analyses.">Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses.</a> Cell. 169 (4), 750-765 (2017).</li><li>Mahoney, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Antibodies+to+Its+Cytoplasmic+Domain+Most+Clearly+Delineate+Cell+Membranes+in+Immunohistochemical+Staining+of+Tumor+Cells.">PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).</li><li>Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+expression+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+is+a+poor+prognostic+factor+in+patients+with+high+CD8++tumor-infiltrating+lymphocytes:+highly+sensitive+detection+using+phosphor-integrated+dot+staining.">PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining.</a> Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImmunoScore+Signature:+A+Prognostic+and+Predictive+Tool+in+Gastric+Cancer.">ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer.</a> Ann. Surg. , (2016).</li><li>Ribas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+Blockade+Expands+Intratumoral+Memory+T+Cells.">PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).</li></ol>

Embora estudos utilizando tumores de SC são mais facilmente conduzidos, modelos de tumores orthotopically implantado podem potencialmente ter mais relevantes para os estudos de farmacologia pré-clínica (particularmente as investigações I/O) fornecer Traduzibilidade próprios reforçado. Este relatório visa ajudar o leitores/público interessado para ser capaz de Visualizar diretamente os procedimentos técnicos que podem ser usados em suas respectivas pesquisas. Nossos protocolos de demonstram essa ortotópico impl...

Adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) faz com que quase a metade um milhão mortalidade mundial anualmente, um dos top 5 câncer assassinos. Há poucas opções de tratamento eficazes e imunoterapias não aprovadas; Portanto, novos tratamentos são desesperadamente necessários. Cancros são cada vez mais sendo reconhecidos como doenças imunológicas, incluindo PDAC, além das doenças genéticas, como conhecido hoje. Fatores imunológicos e genéticos provavelmente iria determinar o prognóstico da doença, bem como tratamento os resultados. Tumores de iludir a vigilância imune hospedeiro e eventualmente avançam para causar a morte. Muitos destes processos imunes ocorrerem dentro o microambiente do tumor (TME)1,2,3,4 onde diferentes tipos de células do sistema imunológico interagem com células tumorais, com o outro e com outro tumor componentes do estroma, diretamente ou indiretamente através de citocinas que, finalmente, determinar o resultado de doença. Portanto, a caracterização dos componentes imunes tumor da TME ou tumor immunophenotyping, incluindo subtipos, numeração e localização de diferentes linhagens de células do sistema imunológico, é fundamental para compreensão imunidade anti-tumoral. No caso do PDAC, foi proposto que elevou o tumor infiltrando supressivos macrófagos (TAM) e células B conduziram a prevenção da infiltração de células T e/ou ativação e níveis elevados de fibrose5,6.
A abordagem comum para TMEs imunes a investigar experimentalmente estaria usando modelos animais pré-clínicos de substituto tumor, tumor de rato principalmente relevante os modelos7, particularmente do mouse syngeneic (homograft) ou modelos de rato geneticamente modificados (GEMM) de câncer, na similaridade assumida de rato e humanos para tumores e imunidade8,9. Entende-se na realidade que existem diferenças inerentes entre as duas espécies de10,11.
Transplantado rato tumores têm vantagens operacionais significativas sobre tumores espontânea7, ou seja desenvolvimento de tumor sincronizado, em contraste com o desenvolvimento de tumor espontânea GEMM parental. Stent de tumores murino espontâneas é considerados tumores primários nunca tendo sido manipularam in vitroe espelhamento original rato tumor histo - molecular patologia7, bem como possíveis perfis imunes. Estes murino stent é muitas vezes consideradas ser "uma versão do mouse do paciente-derivado xenografts (PDXs)". Portanto eles provavelmente têm um melhor Traduzibilidade próprios que cela syngeneic convencional linha-derivado do mouse tumores12. Em particular, muitos stent é derivadas do GEMM específico onde mecanismos de doenças humanas específicas, por exemplo, as mutações de motorista oncogênica, são projetados, e estes stent, portanto, deve ter vantagens para sua relevância clínica. Em particular, a KPC GEMM desenvolver rato PDAC dentro de 15-20 semanas de idade, que recapitula morfologicamente a doença humana com predominantemente bem a moderadamente-diferenciadas de arquitetura glandular e altamente enriquecido o estroma. Este modelo também recapitula as características genéticas mais comuns de PDAC humana, nomeadamente Kras ativando mutação e perda-de-função P53, que ocorrem em 90% e 75% do PDAC humana, respectivamente de5,6.
Sites de transplante também sugeridos que desempenham um papel na Traduzibilidade próprios do modelo. Específicos do ambiente circundante de tecido, como um ambiente ortotópico correspondente, poderia ser um nicho para tumores específicos para ambientes de progresso, em oposição a uniforme subcutânea (SC) para tumores comumente transplantados. Seria de particular interesse se, e/ou, que diferença existe entre os dois locais de transplante, em termos de microambiente imunológico e a relevância para câncer humano, por exemplo. no caso do PDAC.
Um dos aspectos mais importantes da criação de perfil imune, ou immunophenotyping, é determinar o tumor infiltrando as células imunes de linhagens diferentes, os números, percentual relativo dentro tumores, bem como seus Estados de ativação e locais. Isso inclui o tumor-infiltratrating lymphoctyes (TILs, ambos T - e B-), tumor infiltrando macrófagos (TAMs), tumor infiltrando células assassinas naturais (NKs) e residente em tumor dendrítica células3,13,14 , 15 , 16 , 17e a Localização subcellular de certas células18,19,20, etc. Fluorescência citometria de fluxo ou classificação de celular ativado (FACS) é uma tecnologia de deteção de célula única que é comumente usada para medir os parâmetros específicos de uma célula. Multi cor medidas de citometria de fluxo vários marcadores em uma única célula3,4,21 e é o método mais comumente utilizado para determinar o número e a percentagem relativa de diferentes subconjuntos de células do sistema imunológico, incluindo aqueles dentro de tumores.
Este relatório descreve procedimentos para perfilação tumor infiltrando células do sistema imunológico: 1) implantação de ortotópico PDAC rato tumor stent, juntamente com a implantação de SC; 2) tumor tecido colheita e preparação única célula através de dissociação de tumor; 3) análise de citometria de fluxo de todas as células derivadas de tumores, como uma linha de base; 4) comparação dos perfis de linha de base de ambas as abordagens de transplante.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine</td>
			<td>\</td>
			<td>SAS3119</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trocar 20</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>2mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotic and antimycotic</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Air chemical</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood</td>
			<td>AIRTECH</td>
			<td>BSC-1300IIA2</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibodies</td>
			<td>BD</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration</td>
			<td>BD</td>
			<td>354248</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffers</td>
			<td>BD</td>
			<td>554656</td>
			<td>Mincing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Staining Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>563794</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td>553142</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell filters</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>70&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>routine blood tube</td>
			<td>BD-Vacutainer</td>
			<td>365974</td>
			<td>2mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>vs 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3 Fix/Perm kit</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810R,5920R</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td>\</td>
			<td>vs 10.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable, sterile scalpels</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J12100</td>
			<td>11#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife handle</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J11010</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>Y00030</td>
			<td>Eye scissors 10cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>JD1060</td>
			<td>Eye tweezers 10cm with teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable liquid nitrogen tank</td>
			<td>Jinfeng</td>
			<td>YDS-175-216</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Metter Toledo</td>
			<td>AL204</td>
			<td>0-100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi C-tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi Gentle MACS with heater blocks</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-018-306</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryopreservation tube</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME</td>
			<td>PathClear</td>
			<td>3442-005-01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringes</td>
			<td>Shanghai MIWA medical industry</td>
			<td>\</td>
			<td>1-5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog software</td>
			<td>Studylog</td>
			<td>\</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Balance and supporting USB</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>SE601F</td>
			<td>Balance and supporting USB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Data line of vernier calipers</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>926.6721</td>
			<td>Data line of vernier calipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>910.1502.10</td>
			<td>Sylvac S-Cal pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339653</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339651</td>
			<td>15mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>KLCS-288</td>
			<td>4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PLF-276</td>
			<td>&#8212;20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>DW-862626</td>
			<td>&#8212;80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>am7021</td>
			<td>\</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry

Homograft (syngeneic) tumores são o carro-chefe de pesquisa pré-clínica do hoje imuno-Oncologia (i/o). O microambiente do tumor (TME), particularmente seus componentes-imunológico, é vital para o prognóstico e previsão de resultados dos tratamentos, especialmente aqueles de imunoterapia. TME imune-componentes são compostos de diferentes subconjuntos de tumor infiltrando as células imunes avaliável por multi cor FACS. Adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) está entre os mais mortíferos malignances falta de opções de tratamento bom, assim, uma necessidade urgente e insatisfeita médica. Uma razão importante para a sua não-capacidade de resposta às diversas terapias (quimioterapia-, alvo, I/O) tem sido seu TME abundante, composta por fibroblastos e leucócitos que protegem as células do tumor destas terapias. Orthotopically implantado PDAC acredita-se que mais precisão recapturar o TME de cânceres pancreáticos humanos do que os modelos convencionais de subcutânea (SC).
Tumores homograft (KPC) são transplantes de rato espontânea PDAC originários de KPC-ratos geneticamente modificados (K-rasG12D / +/P53- / -/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). O tecido do tumor primário é cortado em pequenos fragmentos (~ 2 mm3) e transplantado por via subcutânea (SC) para os destinatários syngeneic (C57BL/6, 7-9 semanas de idade). O stent foram então cirurgicamente orthotopically transplantado para o pâncreas de novos camundongos C57BL/6, juntamente com SC-implantação, que atingiram volumes de tumor de 300 – 1.000 mm3 por 17 dias. Somente os tumores de 400 – 600 mm3 foram colhidos por procedimento aprovado autópsia e limpo para remover os tecidos de tumor não adjacentes. Eles foram dissociados por protocolo usando um dissociador tecido em suspensões de célula única, seguidas por coloração com painéis designados de fluorescente etiquetado anticorpos para os vários marcadores de diferentes células do sistema imunológico (linfoide, mieloide e NK, DCs). As amostras coradas foram analisadas usando FACS multi cor para determinar o número de células do sistema imunológico de linhagens diferentes, bem como a sua percentagem relativa dentro de tumores. Os perfis imunes de ortotópico tumores foram então comparados dos tumores do SC. Os dados preliminares demonstraram TILs/TAMs infiltrante significativamente elevados em tumores sobre o pâncreas e infiltração de células B maior ortotópico em vez de tumores do SC.

Ortotópico implantação do PDAC resultou no crescimento do tumor rápida semelhante à observada para implantação de SC. Depois que os fragmentos de tumor de doadores foram implantados em ratos destinatários, tanto por via subcutânea e orthotopically de acordo com os protocolos descrito nos passos 2.1 e 2.2, os tumores de homograft KPC implantados demonstraram semelhante rápido crescimento, como mostrado em figura 1A . Tumores de homograft KPC colhidas...

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Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

O procedimento experimental sobre o immunophenotyping de stent de murino ortotópico PDAC visa perfilação a imuno-microambiente do tumor. Os tumores são orthotopically implantado através de cirurgia. Tumores de 200-600 mm3 no tamanho foram colhidos e dissociados para preparar suspensões de célula única, seguidas de análise multi imune marcador FACS usando diferentes anticorpos fluorescente-etiquetadas.

Immunophenotyping de ortotópico Homograft (Syngeneic) de murino KPC primário de Adenocarcinoma Ductal do pâncreas por citometria de fluxo

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Esta mensagem pode ajudar a responder a perguntas-chave em Imunofenofoteping em modelos murinos, como marcadores usados para identificar diferentes linhagens de imunidade e estratégias de envelhecimento. A maior vantagem desta técnica é que o marcador e o envelhecimento, quando imunofenofoteping, podem ser aplicados a uma variedade de modelos murinos. Monitore o peso corporal de C57 Black 6 camundongos usando um equilíbrio.Além disso, monitore o volume tumoral de camundongos doadores variados por medição de calibre. Seguindo a eutanásia do animal em um capô de risco biológico conforme o protocolo, esterilize a pele ao redor do tumor usando cotonetes de iodophor. Após a remoção cirúrgica do tumor conforme detalhado no protocolo de texto, coloque o tumor em uma placa de petri contendo 20 mililitros de PBS que foi pré-refrigerado a 4 graus Celsius.Se houver sangue contaminante, transfira o tumor para outra placa de Petri e lave o tumor com PBS. Corte o tumor ao meio. Remova qualquer pele extra, vasos, calcificação e necrose.Escolha apenas pedaços intactos de tumor e coloque-os em um tubo de centrífuga de 50 mililitros estéril. Adicione 20 mililitros de PBS antes de transportar tubo para uma sala animal separada para estudos de farmacologia. Para se preparar para a implantação ortotópica, fixe um mouse totalmente anestesiado em uma placa de experimento na posição lateral direita.Desinfete a pele ao redor do baço com idodine e depois desodinada com 75% de álcool etílico. Encontre o ponto mediano do baço e faça uma incisão vertical de 1 centímetro no abdômen para expor o baço. Suavemente, retire parte do tecido do pâncreas sob o baço usando pinças de ponta plana.E sutro rato homoenergrafal peça tumor do rato C para o pâncreas do rato receptor por 9-O bsorbable surgical sutura. Feche o abdômen com uma sutura de seda 6-O por costura dupla. Alcance a homeostase por compressão.Após o término da implantação do tumor, mantenha o animal em uma gaiola quente, desde que não ocorra sangramento ou vazamento de tecido tumoral. Monitore o animal até que recuperem a consciência suficiente para manter a recumbência severa. Devolva o animal para a sala dos animais após a recuperação completa da anestesia.Monitore o tumor variando camundongos palpando o abdômen perto do baço e selecione os camundongos com tumores ortotópicos. Para cada tumor, prepare um tubo C com tampão de digestão tumoral. Use 3 mililitros de tampão de digestão para fragmentos tumorais inferiores a 0,8 gramas para garantir que o tumor esteja totalmente digerido.Rotule o tumor com o código de estudo, tumor, RG do rato, grupo de tratamento e peso tumoral. Pegue o tumor do rato. Lave o tumor em PBS frio e limpe o tecido ligado ao tumor.Coloque tumor na mídia de digestão em um poço de uma placa estéril de 6 poços. Segure o tumor no lugar com pinças estéreis ou fórceps e corte com um bisturi. Corte o tumor bem o suficiente para quebrar em pedaços menores.Agora, coloque os pedaços do tumor de volta no tubo C e use o tampão de digestão restante para lavar a placa. Transfira o fluido para o tubo C e coloque-o no gelo até a digestão. Em seguida, ligue o dissociador com aquecedores.Coloque a dissociação do tumor C-tube de cabeça para baixo na manga da posição vaga. Ajuste o status da posição do tubo de Livre para Selecionado. Escolha um programa de dissociação siga pela seleção da pasta necessária onde a lista de programas é exibida.Após o término do programa, tire o tubo C do dissociador e gire brevemente para palete a amostra. Agora, suspenda as amostras e coloque-as em um coador de células acima de um tubo de 50 mililitros. Lave a célula através do coador celular com 10 mililitros de tampão de lavagem para fornecer uma única suspensão celular.Depois de centrifugar tubo a 300 G por 5 minutos, descarte o supernasciente e suspenda as células com 5 mililitros de tampão de lavagem. Conte células viáveis e ajuste a concentração celular para 1 milhão de células por tubo ou por amostra. Realize o design do painel imunológico, imunostaining e fluorescência menos um controle como detalhe no protocolo de texto.Prepare as contas UltraComp enquanto os instrumentos de fluxo estão aquecendo-os completamente antes do uso. Rotule um tubo de amostra separado de 12 x 75 milímetros para cada anticorpo conjugado fluorocromático. Adicione 100 microliter de tampão de coloração a cada tubo seguido por uma gota completa das contas.Adicione anticorpos e realize o procedimento de coloração conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, adicione 0,5 mililitro de tampão de coloração a cada pelota de contas e suspenda completamente via vórtice. Agora, defina a tensão PMT de citometria de fluxo por tecido alvo para o experimento dado.Execute a amostra através da citometria Flow para aquisição de dados, ganhando na população de contas únicas por dispersão de frente e leituras de dispersão lateral. Defina a vazão em torno de 200 a 300 eventos por segundo. Defina a compensação apropriada para um determinado anticorpo de conjugação fluorescein FITC usando um gráfico de pontos FL1 versus FL1.Coloque um portão do quadrante para que as contas negativas estejam dentro do quadrante inferior esquerdo e as contas positivas estejam dentro do quadrante superior ou inferior direito. Ajuste os valores de compensação até que a intensidade mediana de fluoresceína de cada população seja aproximadamente igual. Repita estes passos para todos os tubos.Agora, prossiga para a aquisição de amostras de manchas reais. Execute o assistente de compensação e salve a configuração com o formato:data, experimento e suas iniciais. A implantação ortotópica do adenocarcinoma ductal pancreático resultou em crescimento rápido do tumor semelhante ao observado na implantação subcutânea.Imagens representativas de hematoxílina e eosina são mostradas e demonstram crescimento semelhante de implantes subcutâneos e ortotópicos. Foram obtidos rendimentos razoavelmente elevados de células viáveis a partir da amostra tumoral de ambos os tipos de implantação. O representante FACS splat mostra células viáveis do tumor separados das células mortas e detritos celulares.Mostrado aqui, é um tumor infiltrando-se em um perfil imunológico comparando a população de células principais e numeradores de vários subconjuntos-chave de células imunes tumorais. Homoenerxerto subcutâneo versus ortotópico de câncer de pâncreas são mostrados. Os dados mostram claramente que o tumor aumentou significativamente a infiltração de células imunes em comparação com o pâncreas de camundongos saudáveis.Além disso, diferentes percentuais de subconjuntos de células imunes infiltrados de tumor foram encontrados em homoenerxertos ortotópicos versus subcutâneos. Por exemplo, há significativamente mais células B em ortotópico do que em subcutâneos. Ao tentar este procedimento é importante lembrar de preparar todos os materiais e reagentes associados com antecedência.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar análises FACS para modelos murine.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Fluorescente modelo de camundongo ortotópico de câncer de pâncreas

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Pesquisa do câncer

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Um mouse modelo de fadiga induzida por irradiação periférica

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Um modelo de Mouse Syngeneic câncer pancreático para estudar os efeitos da eletroporação irreversível

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Um modelo murino de ortotópico bioluminescentes e fluorescente Syngeneic de câncer de próstata andrógeno-dependentes e castração resistente

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Ortotópico transplante de células de Adenocarcinoma de pulmão Syngeneic para estudar a expressão de PD-L1

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Imitando e manipulando Metaplasia acinares-para-Ductal pancreático na cultura de pilha 3-dimensional

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolamento e caracterização de modelos organóides de adenocarcinoma ductatopansa pâncreas derivados do paciente

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Implantação ortotópica guiada por ultrassom do Adenocarcinoma Ductal Pancreático murine

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolamento de Fluidos Proximais para Investigar o Microambiente Tumoral do Adenocarcinoma Pancreático

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

Um modelo de rato resemcional ortotópico de câncer pancreático

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...