Name: immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry
Uploaded: 2018-10-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry at JoVE.com

Авторы бы поблагодарить д-ра Джоди Барбо - для критического чтения и редактирования рукописи и благодарю Ральф Мануэль для проектирования произведения искусства. Авторы хотели бы также поблагодарить Корона Bioscience онкологии иммуно-онкология биомаркер команды и команды онкологии В естественных условиях , за их большие усилия технического.

Все протоколы и присутствующими или процедур с участием уход и использование животных будут рассмотрены и одобрены Корона Bioscience институциональный уход за животными и использовать Комитет (IACUC) до проведения исследований. Уход и использование животных, обычно будет проводиться в соотв...

<ol>
	<li>Chevrier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Immune+Atlas+of+Clear+Cell+Renal+Cell+Carcinoma.">An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma.</a> Cell. 169 (4), 736-749 (2017).</li><li>Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+immune+responses+in+the+tumor+microenvironment.">Monitoring immune responses in the tumor microenvironment.</a> Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).</li><li>Mosely, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+Selection+of+Syngeneic+Preclinical+Tumor+Models+for+Immunotherapeutic+Drug+Discovery.">Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery.</a> Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).</li><li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+focal+adhesion+kinase+renders+pancreatic+cancers+responsive+to+checkpoint+immunotherapy.">Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy.</a> Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).</li><li>Gunderson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruton+Tyrosine+Kinase-Dependent+Immune+Cell+Cross-talk+Drives+Pancreas+Cancer.">Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer.</a> Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).</li><li>Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+modeling+for+immuno-oncology.">Experimental animal modeling for immuno-oncology.</a> Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).</li><li>Takao, K., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+greatly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).</li><li>Payne, K. J., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-cell+lineage+commitment:+translation+from+mice+to+humans.">Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans.</a> Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>von Herrath, M. G., Nepom, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+translation:+barriers+to+implementing+clinical+immunotherapeutics+for+autoimmunity.">Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity.</a> J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).</li><li>Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+to+evaluate+novel+and+conventional+therapeutic+strategies+for+cancer.">Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer.</a> Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).</li><li>Erdag, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotype+and+immunohistologic+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+are+associated+with+clinical+outcome+in+metastatic+melanoma.">Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma.</a> Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).</li><li>Guti&#233;rrez-Garcia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+and+not+immunophenotypic+algorithms+predicts+prognosis+in+patients+with+diffuse+large+B-cell+lymphoma+treated+with+immunochemotherapy.">Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy.</a> Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).</li><li>Paiva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1/PD-1+presence+in+the+tumor+microenvironment+and+activity+of+PD-1+blockade+in+multiple+myeloma.">PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma.</a> Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).</li><li>Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+nature+of+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice.">Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Landscape+in+Early+Lung+Adenocarcinoma+by+Paired+Single-Cell+Analyses.">Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses.</a> Cell. 169 (4), 750-765 (2017).</li><li>Mahoney, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Antibodies+to+Its+Cytoplasmic+Domain+Most+Clearly+Delineate+Cell+Membranes+in+Immunohistochemical+Staining+of+Tumor+Cells.">PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).</li><li>Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+expression+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+is+a+poor+prognostic+factor+in+patients+with+high+CD8++tumor-infiltrating+lymphocytes:+highly+sensitive+detection+using+phosphor-integrated+dot+staining.">PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining.</a> Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImmunoScore+Signature:+A+Prognostic+and+Predictive+Tool+in+Gastric+Cancer.">ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer.</a> Ann. Surg. , (2016).</li><li>Ribas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+Blockade+Expands+Intratumoral+Memory+T+Cells.">PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).</li></ol>

Хотя более легко проводятся исследования с использованием SC опухоли, имплантированных orthotopically опухолей модели может быть более актуальной для доклинических фармакологии исследования (особенно расследования операций ввода-вывода) для обеспечения расширенной переводимости. Этот док?...

Протока поджелудочной железы аденокарцинома (PDAC) вызывает почти половины миллиона смертность всемирно ежегодно, один из убийц рака Топ 5. Существует несколько вариантов эффективного лечения и не утвержденных immunotherapies; Таким образом отчаянно необходимы новые методы лечения. Раковые заболевания получают все большее признание как иммунологических заболеваний, включая PDAC, помимо генетических заболеваний, как известно сегодня. Иммунологические и генетические факторы скорее всего будет определять прогноза заболевания, а также лечения результаты. Опухоли уклониться от принимающей иммунной наблюдения и в конечном итоге заранее вызвать смерть. Многие из этих иммунных процессов происходят в микроокружения опухоли (ТМЕ)1,2,3,4 , где различные типы иммунных клеток взаимодействуют с опухолевых клеток, друг с другом и с другими опухоли Стромальные компоненты, прямо или косвенно через цитокины, которые в конечном итоге определяют исход заболевания. Таким образом характеристика опухоли иммунной компонентов TME, или иммунофенотипирования опухолевых, включая подтипов, нумерация и локализация различных линий иммунных клеток, имеет решающее значение для понимания противоопухолевый иммунитет. В случае PDAC, было предложено, что повышенные проникновения опухоли подавляющих макрофагов (TAM) и B-клетки привели к предотвращению Т-клеточная инфильтрация и/или активации и высокий уровень фиброза5,6.
Общий подход к расследованию иммунной TMEs экспериментально бы с помощью суррогатного опухоли доклинических животных моделей, главным образом соответствующие мыши опухоли модели7, особенно мышь сингенных (homograft) или генетически модифицированные мыши модели (ГЭММ) рака, на себя подобии человека опухоли и иммунитет8,9и мыши. В действительности понимается, что есть присущи различия между двумя видами10,11.
Пересаженные мыши опухоли имеют значительные оперативные преимущества перед спонтанные опухоли7, а именно развитие синхронизированные опухоли, в отличие от родителей ГЭММ спонтанные опухоли развития. Homografts спонтанные мышиных опухоли считаются первичной опухоли никогда не был манипулировать в пробиркеи зеркального отображения исходного мыши опухоли гисто- / молекулярной патологии7, а также возможных иммунной профилей. Часто эти мышиных homografts считаются «мыши версию пациента производные ксенотрасплантатов (PDXs)». Поэтому они скорее всего есть лучше переводимости чем обычные сингенных клеток линии производные мыши опухоли12. В частности многие homografts являются производными от конкретных ГЭММ, где конкретные болезни человека механизмы, например драйвер онкогенных мутаций, инженерии, и эти homografts, следовательно, должны иметь преимущества для их клиническое значение. В частности КЗК ГЭММ развивать мыши PDAC в течение 15 – 20 недель возраста, что морфологически резюмирует заболеваний человека с преимущественно хорошо умеренно продифференцированным железистой архитектуры и высокообогащенного стромы. Эта модель также резюмирует наиболее распространенных генетических особенностей человека PDAC, а именно крас, активизируя мутации и P53-из функция потерь, которые происходят в 90% и 75% человеческого PDAC, соответственно5,6.
Сайты о трансплантации также было предложено играть свою роль в модели переводимости. Конкретные окружающей среде ткани, например в соответствующей среде ортотопическая, может быть нишу для конкретной опухоли в прогресс, в отличие от единой подкожной (SC) средах для часто пересаженных опухоли. Он будет представлять особый интерес, если, и, какая разница существует между двумя сайтами трансплантации, с точки зрения иммунной микроокружения и значение для человека рак, например. в случае PDAC.
Одним из наиболее важных аспектов иммунной профилирования, или иммунофенотипирование, необходимо определить проникновения опухоли иммунные клетки различных линий, числа, относительная доля в опухоли, а также их активации государств и местах. Это включает в себя опухоли infiltratrating lymphoctyes (Тилс, как T - и B-), проникновения опухоли макрофагов (ТАМС), проникновения опухоли естественных клеток-киллеров (НКС) и опухоли резидентов дендритных клеток,3,13,14 , 15 , 16 , 17и внутриклеточных локализации некоторых ячеек18,19,20, и т.д. Флуоресценции активирован ячейку Сортировка (FACS) или потока цитометрии является технология обнаружения одной ячейки, которая обычно используется для определения конкретных параметров ячейки. Разноцветный поток цитометрии меры несколько маркеров на одну ячейку3,4,21 и является наиболее часто используемым методом для определения числа и относительная доля различных подмножеств иммунных клеток, включая те внутри опухоли.
В настоящем докладе описываются процедуры для профилирования проникновения опухоли клетки иммунной системы: 1) имплантация ортотопическая PDAC мыши опухоль homografts, наряду с SC имплантации; 2) опухоль ткани урожай и подготовка одной клетки через диссоциации опухоли; 3) потока cytometry анализ всех клеток, производный от опухоли в качестве базовых данных; 4) сравнение базовые характеристики обоих подходов трансплантации.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine</td>
			<td>\</td>
			<td>SAS3119</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trocar 20</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>2mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotic and antimycotic</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Air chemical</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood</td>
			<td>AIRTECH</td>
			<td>BSC-1300IIA2</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibodies</td>
			<td>BD</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration</td>
			<td>BD</td>
			<td>354248</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffers</td>
			<td>BD</td>
			<td>554656</td>
			<td>Mincing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Staining Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>563794</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td>553142</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell filters</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>70&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>routine blood tube</td>
			<td>BD-Vacutainer</td>
			<td>365974</td>
			<td>2mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>vs 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3 Fix/Perm kit</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810R,5920R</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td>\</td>
			<td>vs 10.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable, sterile scalpels</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J12100</td>
			<td>11#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife handle</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J11010</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>Y00030</td>
			<td>Eye scissors 10cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>JD1060</td>
			<td>Eye tweezers 10cm with teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable liquid nitrogen tank</td>
			<td>Jinfeng</td>
			<td>YDS-175-216</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Metter Toledo</td>
			<td>AL204</td>
			<td>0-100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi C-tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi Gentle MACS with heater blocks</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-018-306</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryopreservation tube</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME</td>
			<td>PathClear</td>
			<td>3442-005-01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringes</td>
			<td>Shanghai MIWA medical industry</td>
			<td>\</td>
			<td>1-5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog software</td>
			<td>Studylog</td>
			<td>\</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Balance and supporting USB</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>SE601F</td>
			<td>Balance and supporting USB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Data line of vernier calipers</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>926.6721</td>
			<td>Data line of vernier calipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>910.1502.10</td>
			<td>Sylvac S-Cal pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339653</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339651</td>
			<td>15mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>KLCS-288</td>
			<td>4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PLF-276</td>
			<td>&#8212;20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>DW-862626</td>
			<td>&#8212;80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>am7021</td>
			<td>\</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry

Homograft (сингенных) опухоли являются рабочая лошадка сегодняшних иммуно онкология (ввода/вывода) доклинических исследований. Микроокружения опухоли (ТМЕ), особенно его иммунной компонентов, имеет жизненно важное значение для прогнозирования и прогнозирования результатов лечения, особенно иммунотерапии. TME иммунной компоненты состоят из различных подмножеств проникновения опухоли иммунных клеток оценимый многоцветные СУИМ. Протока поджелудочной железы аденокарцинома (PDAC) — среди страшных malignances, не хватает хорошего лечения, таким образом срочных и неудовлетворенные медицинской необходимости. Одной из важных причин для его способности реагировать различные терапии (химио-, целенаправленных, ввода-вывода) был обильным TME, состоящий из фибробластов и лейкоциты, которые защищают клетки тумора от этих методов лечения. Orthotopically, имплантированных PDAC считается более точно отбить TME человека поджелудочной железой, чем обычные модели подкожной (SC).
Homograft опухоли (КЗК), пересадке мыши спонтанное PDAC, происходящих от генетически КЗК мышей (KРАНG12D / +/P53- / -/Pdx1--Cре) (КПК-ГЭММ). Главным образом тумор ткани разрезать на небольшие фрагменты (3~ 2 мм) и пересаженные подкожно (SC) сингенных получателям (C57BL/6, 7-9 недель). Homografts были затем хирургическим orthotopically пересадили на поджелудочной железы новых мышей C57BL/6, наряду с SC-имплантации, который достиг опухоли объемов 300 – 1000 мм3 17 дней. Только опухоли 400 – 600 мм3 были собирают в утвержденных вскрытие процедуры и очищены, чтобы удалить прилегающих тканей не опухоль. Они были отделены в протокол, с помощью диссоциатором ткани в сингл клеточных суспензий, следуют окрашивание с назначенными группами дневно обозначенного антитела для различных маркеров различных иммунных клеток (лимфоидной, миелоидной и НК, DCs). Окрашенные Образцы анализировались с использованием многоцветные СУИМ для определения количества иммунокомпетентных клеток различных линий, а также их относительная доля в опухоли. Иммунных профили ортотопическая опухоли были затем по сравнению с теми SC опухолей. Предварительные данные продемонстрировал значительно повышенные инфильтрирующие Тилс/ТАМС в опухоли поджелудочной железы, и выше B-клеточной инфильтрации в ортотопическая, вместо того, чтобы SC опухоли.

Имплантация ортотопическая PDAC привело к быстрой опухолевого роста, подобные тому, которое наблюдалось для имплантации SC. После того, как доноры опухоли фрагменты были имплантированы в получателей мышей, как подкожно и orthotopically согласно протоколам описано в шагах 2.1 и 2....

Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry at JoVE.com

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Экспериментальная процедура на Иммунофенотипирование мышиных ортотопическая PDAC homografts направлена на профилирование иммуно микроокружения опухоли. Опухоли являются orthotopically, имплантируются через хирургии. Опухоли3 200 – 600 мм в размере были собраны и отделить подготовить одноклеточных суспензий, следуют мульти иммунных маркеров СУИМ анализ с использованием различных дневно обозначенного антитела.

Иммунофенотипирование ортотопическая Homograft (сингенных) из мышиных первичной КЗК аденокарциномы поджелудочной железы протоковой подачей Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Это сообщение может помочь ответить на ключевые вопросы в иммунофенотипинге в моделях Murine, таких как маркеры, используемые для выявления различных линий иммунитета и стратегий старения. Основным преимуществом этого метода является то, что маркер и старение stategies, при иммунофенотипинге, могут быть применяться к различным моделям мурина. Мониторинг массы тела C57 Черный 6 мышей с помощью баланса.Кроме того, контролировать объем опухоли опухоли различных мышей-доноров по калибру измерения. После эвтаназии животного в биоопасном капюшоне в соответствии с протоколом, стерилизовать кожу вокруг опухоли с помощью мазков Иодофора. После хирургического удаления опухоли, как описано в текстовом протоколе, поместите опухоль в чашку Петри, содержащую 20 миллилитров PBS, который был предварительно охлажден до 4 градусов по Цельсию.Если есть загрязняющие крови, передать опухоль в другую чашку Петри и мыть опухоль с PBS. Разрежьте опухоль пополам. Удалите любую дополнительную кожу, сосуды, кальцификации и некроза.Выберите только нетронутые кусочки опухоли и поместите их в стерильную 50-миллилитровую центрифугу. Добавьте 20 миллилитров PBS перед транспортировкой трубки в отдельную комнату для фармакологии. Чтобы подготовиться к ортопедической имплантации, зафиксируйте полностью анестезированной мыши на экспериментальной доске в правом боковом положении.Дезинфицировать кожу вокруг селезенки с идодином, а затем де-йодинат с 75%этилового спирта. Найти среднюю точку селезенки и сделать 1 сантиметр вертикальный разрез на животе, чтобы разоблачить селезенки. Аккуратно вытянуть часть ткани поджелудочной железы под селезенку с помощью плоского кончика пинцета.И сутро мыши гомотрансплантата опухоли кусок от мыши C на поджелудочной железе мыши-получателя 9-O bsorbable хирургический шов. Закройте брюшную полость 6-O шелковым швом двойным швом. Достичь гомеостаза путем сжатия.После окончания имплантации опухоли, держать животное в теплой клетке до тех пор, пока не кровотечения или утечки опухолевых тканей происходит. Следите за животным до тех пор, пока они не обретут достаточное сознание для поддержания лежачих кормов. Верните животное в комнату животного после полного выздоровления от наркоза.Мониторинг опухоли различных мышей путем пальпирования живота вблизи селезенки и выбрать мышей, несущих ортопедические опухоли. Для каждой опухоли подготовьтесь к одной трубке С с буфером пищеварения опухоли. Используйте 3 миллилитра буфера пищеварения для фрагментов опухоли менее 0,8 грамма, чтобы убедиться, что опухоль полностью переваривается.Наклеить этикетку опухоли с кодом исследования, опухоли, мыши ID, группы лечения, и вес опухоли. Соберите опухоль с мыши. Вымойте опухоль в холодном PBS и очистить ткани, прикрепленные к опухоли.Поместите опухоль в средства пищеварения в один колодец стерильной пластины 6-колодец. Держите опухоль на месте стерильными пинцетами или типсами и нарежьте скальпелем. Нарежьте опухоль достаточно хорошо, чтобы разбить на более мелкие кусочки.Теперь поместите кусочки опухоли обратно в C-трубку и используйте оставшийся буфер пищеварения для мытья пластины. Перенесите жидкость в C-трубку и поместите ее на лед до пищеварения. Затем включите диссоциатор с обогревателями.Поместите диссоциацию опухоли C-трубки вверх дном в рукав вакантного положения. Отрегулируйте состояние положения трубки от Свободного до Выбранного. Выберите программу диссоциации, следуют выбор требуемой папки, где отображается список программы.После завершения программы свяжи C-трубку с диссоциатора и ненадолго закрутим, чтобы поддонировать образец. Теперь, повторно приостановить образцы и положить их в клетку ситечко выше 50 миллилитров трубки. Вымойте клетку через клеточный ситечко с 10 миллилитров буфера мытья, чтобы обеспечить одну подвеску клетки.После центрифугирования трубки при 300 Г в течение 5 минут, отбросьте супернатант и повторно приостановьте клетки 5 миллилитров буфера стирки. Подсчитайте жизнеспособные клетки и отрегулируйте концентрацию клеток до 1 миллиона клеток на трубку или на образец. Выполните дизайн иммунной панели, иммуностимулятор и флуоресценцию минус один контроль в качестве детализации в текстовом протоколе.Подготовка UltraComp шарики в то время как поток инструментов разогрева путем вихрей их тщательно перед использованием. Наклейте этикетку на отдельную 12 х 75 миллиметровую пробную трубку для каждого конъюгированных антител флюорохромов. Добавьте 100 микролитров буфера окрашивания в каждую трубку, следуют по одной полной капле бисера.Добавить антитела и выполнить процедуру окрашивания, как описано в текстовом протоколе. Затем добавьте 0,5 миллилитра буфера окрашивания в каждую гранулу бисера и полностью переостановите через вихрь. Теперь установите цитометрию потока PMT напряжения на целевую ткань для данного эксперимента.Вы запустите выборку через выборку через цитометрию потока для получения данных, набирая на однопалатную популяцию шарика на форвардный рассеяние и показания бокового рассеяния. Установите скорость потока около 200 до 300 событий в секунду. Установите соответствующую компенсацию за данный флуоресцентный FITC спряжения антител с помощью FL1 против FL1 точка участка.Поместите квадрантные ворота так, чтобы отрицательные бусы были в левом нижнем квадранте, а положительные бусинки находятся в верхнем или нижнем правом квадранте. Отрегулируйте значения компенсации до тех пор, пока средняя интенсивность флуоресцентных данных каждой популяции не будет примерно равной. Повторите эти шаги для всех трубок.Теперь приступайте к приобретению фактических образцов пятен. Запустите мастер компенсации и сохраните настройки с форматом:дата, эксперимент и ваши инициалы. Ортопедическая имплантация аденокарциномы протоков поджелудочной железы привела к быстрому росту опухоли, аналогичному тому, что наблюдается при подкожной имплантации.Показаны репрезентативные изображения окрашивания гематоксилина и эозин и демонстрируется аналогичный рост подкожных и ортопедических имплантатов. Разумно высокие жизнеспособные выходы клеток были получить из образца опухоли обоих типов имплантации. Представитель FACS splat показывает жизнеспособные клетки от опухоли, отделенной от мертвых клеток и клеточного мусора.Показано здесь, является опухоль проникает иммунного профиля сравнения основных и числительной клеточной популяции нескольких ключевых подмножего опухолевых иммунных клеток. Показаны подкожные против ортопедического гомотрансплантата рака поджелудочной железы. Данные ясно показывают, что опухоль значительно увеличить инфильтрацию иммунных клеток по сравнению с поджелудочной железой здоровых мышей.Кроме того, различные проценты опухоли проникновения подмножества иммунных клеток были найдены в ортопедических по сравнению с подкожными гомотрансплантами. Например, в ортопедических клетках значительно больше В, чем в подкожных. При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы подготовить все связанные материалы и реагенты заранее.После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как выполнить анализ FACS для моделей murine.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Флуоресцентные Ортотопическая Мышь Модель панкреатического рака

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Мышь Модель усталости, индуцированный Peripheral Облучение

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Модель мышь сингенных рака поджелудочной железы для изучения последствий необратимой электропорации

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Биолюминесцентных и флуоресцентный ортотопическая сингенных мышиных модель андроген зависимых и кастрация стойкие рака простаты

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Ортотопическая трансплантация клеток аденокарциномы сингенных легкого учиться выражение PD-L1

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Подражая и манипулирования поджелудочной железы ацинарной протоковой метаплазии в 3-мерной клеточной культуре

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Изоляция и характеристика пациента полученных поджелудочной железы Ductal Аденокарцинома ОрганоидНые Модели

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ультразвуковая ортотопическая имплантация мурин поджелудочной железы Ductal Аденокарцинома

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Выделение проксимальных жидкостей для исследования микроокружения опухоли аденокарциномы поджелудочной железы

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

Ортотопическая резекционная мышиная модель рака поджелудочной железы

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...