Name: immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry
Uploaded: 2018-10-09T12:30:00
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Los autores le agradezco Dr. Jody Barbeau - crítica de la lectura y edición del manuscrito y gracias a Ralph Manuel para el diseño de obras de arte. Los autores quisieran agradecer al equipo corona Bioscience Oncología inmuno-Oncología biomarcadores y equipo de Oncología En el Vivo , por su gran esfuerzo técnico.

Todos los protocolos y enmiendas o procedimientos que involucran el cuidado y uso de animales serán revisados y aprobados por la corona Bioscience atención Animal institucional y el Comité uso (IACUC) antes de la realización de estudios. El cuidado y uso de los animales generalmente se realizará conforme a las directrices internacionales de AAALAC (Asociación para la evaluación y acreditación del cuidado de animales de laboratorio) como se informó en la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, inv...

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	<li>Chevrier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Immune+Atlas+of+Clear+Cell+Renal+Cell+Carcinoma.">An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma.</a> Cell. 169 (4), 736-749 (2017).</li><li>Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+immune+responses+in+the+tumor+microenvironment.">Monitoring immune responses in the tumor microenvironment.</a> Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).</li><li>Mosely, S. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Antibodies+to+Its+Cytoplasmic+Domain+Most+Clearly+Delineate+Cell+Membranes+in+Immunohistochemical+Staining+of+Tumor+Cells.">PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).</li><li>Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+expression+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+is+a+poor+prognostic+factor+in+patients+with+high+CD8++tumor-infiltrating+lymphocytes:+highly+sensitive+detection+using+phosphor-integrated+dot+staining.">PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining.</a> Int. J. Clin. 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Aunque estudios con tumores SC se realizan más fácilmente, orthotopically implantado modelos de tumores pueden ser potencialmente más relevantes para los estudios de Farmacología Preclínica (particularmente las investigaciones I/O) para proporcionar la traducción mejorada. Este informe tiene como objetivo ayudar a la lectores/audiencia interesada a ser capaces de visualizar directamente los procedimientos técnicos que se pueden utilizar en sus investigaciones respectivas. Nuestros protocolos demuestran que orthoto...

Adenocarcinoma ductal pancreática (PDAC) provoca casi la mitad un millón mortalidades por todo el mundo anualmente, uno de los asesinos de cáncer top 5. Hay pocas opciones de tratamiento eficaz y no inmunoterapias aprobadas; por lo tanto, se necesitan desesperadamente nuevos tratamientos. Tipos de cáncer están siendo reconocidos cada vez más como enfermedades inmunológicas, incluyendo la PDAC, además de las enfermedades genéticas como hoy. Factores inmunológicos y genéticos probablemente determinaría pronóstico de la enfermedad así como el tratamiento de los resultados. Los tumores evaden la vigilancia inmune del anfitrión y eventualmente avanzan para causar la muerte. Muchos de estos procesos inmunes producen en el microambiente tumoral (TME)1,2,3,4 donde diferentes tipos de células inmunes interactúan con las células del tumor, uno con el otro y con otro tumor componentes stromal, directamente o indirectamente vía citoquinas que determinan en última instancia, resultado de la enfermedad. Por lo tanto, caracterización de los componentes inmunes de tumor de la TME o tumor immunophenotyping, incluyendo subtyping, numeración y localización de distintos linajes de células inmunes, es fundamental para la comprensión de la inmunidad antitumoral. En el caso de PDAC, se ha propuesto que elevado macrófagos supresores tumorales infiltrantes (TAM) y células B han llevado a la prevención de la infiltración de células T y la activación y los niveles de fibrosis5,6.
El enfoque común para investigar experimentalmente TMEs inmunes sería usando sustituto modelos animales preclínicos de tumor, tumor de ratón principalmente relevantes modelos7, especialmente ratón syngeneic (homoinjerto) o modelos de ratón modificados genéticamente (GEMM) de cánceres, en la supuesta semejanza de ratón y humano para tumores e inmunidad8,9. Se entiende en realidad que hay diferencias inherentes entre los dos especies10,11.
Los tumores de ratón trasplantado tienen ventajas operacionales significativas en tumores espontáneos7, es decir, un desarrollo de tumores sincronizado, en contraste con el desarrollo de espontánea del tumor parental de GEMM. Homoinjertos de tumores murinos espontáneos se consideran tumores primarios nunca haber sido manipularon in vitroy ratón original espejado tumor histo- / molecular patología7, así como posibles perfiles inmunes. Estos homoinjertos murinos son considerados a menudo "una versión del ratón de xenoinjertos derivados del paciente (PDXs)". Por lo tanto tienen probablemente una mejor traducción de syngeneic de la célula convencional línea derivada ratón tumores12. En particular, muchos homoinjertos se derivan de GEMM específico donde se han diseñado mecanismos de enfermedades humanas específicas, por ejemplo mutaciones oncogénicas driver, y estos homoinjertos deben por lo tanto tienen ventajas a su relevancia clínica. En particular, la KPC GEMM desarrollar ratón PDAC dentro de 15 a 20 semanas de edad, que recapitula morfológicamente enfermedad humana predominantemente bien-moderadamente-distinguido arquitectura glandular y altamente enriquecido estroma. Este modelo también recoge las características genéticas más comunes de PDAC humano, es decir, Kras activa la mutación y pérdida-de-función P53, que ocurren en el 90% y 75% de PDAC humano, respectivamente de5,6.
Sitios del trasplante también se han sugerido para desempeñar un papel en la traducibilidad de la modelo. El específico entorno de tejido, como un entorno de orthotopic correspondiente, podría ser un nicho para tumores específicos para entornos de progreso, en contraposición a la subcutánea (SC) de uniforme para los tumores comúnmente trasplantados. Sería de particular interés if, o, qué diferencia existe entre los dos sitios de trasplante, en términos de microambiente inmunológico y la relevancia en cáncer en humanos, por ejemplo. en el caso de la PDAC.
Uno de los aspectos más importantes del perfil inmune o Inmunofenotipificación, es determinar infiltrantes de tumor de las células inmunes de diferentes linajes, los números, porcentaje relativo dentro de los tumores, así como sus Estados de activación y ubicaciones. Esto incluye lymphoctyes de infiltratrating de tumor (TILs, tanto T - y B-), macrófagos infiltrantes de tumor (TAMs), infiltrantes de tumor de células de asesino naturales (NKs) y reside en el tumor dendrítico de las células3,13,14 , 15 , 16 , 17y la localización subcelular de ciertas células18,19,20, etcetera. Fluorescencia activada célula clasificación (FACS) o flujo cytometry es una tecnología de detección unicelular que comúnmente se utiliza para medir los parámetros específicos de una célula. Varios colores las medidas de la citometría de flujo marcadores múltiples en una sola celda3,4,21 y es el método más comúnmente utilizado para determinar el número y porcentaje relativo de diferentes subconjuntos de células inmunes, las de los tumores incluidas.
Este informe describe los procedimientos para el perfilado de tumor infiltrante de células inmunes: 1) implantación de homoinjertos tumor orthotopic PDAC ratón, junto con la implantación de SC; 2) tumor tejido cosecha y preparación de la célula vía disociación del tumor; 3) análisis de citometría de flujo de todas las células derivadas de tumores, como una línea de base; 4) comparación de perfiles de línea de base de ambos enfoques de trasplante.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine</td>
			<td>\</td>
			<td>SAS3119</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trocar 20</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>2mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotic and antimycotic</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Air chemical</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood</td>
			<td>AIRTECH</td>
			<td>BSC-1300IIA2</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibodies</td>
			<td>BD</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration</td>
			<td>BD</td>
			<td>354248</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffers</td>
			<td>BD</td>
			<td>554656</td>
			<td>Mincing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Staining Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>563794</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td>553142</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell filters</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>70&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>routine blood tube</td>
			<td>BD-Vacutainer</td>
			<td>365974</td>
			<td>2mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>vs 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3 Fix/Perm kit</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810R,5920R</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td>\</td>
			<td>vs 10.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable, sterile scalpels</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J12100</td>
			<td>11#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife handle</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J11010</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>Y00030</td>
			<td>Eye scissors 10cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>JD1060</td>
			<td>Eye tweezers 10cm with teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable liquid nitrogen tank</td>
			<td>Jinfeng</td>
			<td>YDS-175-216</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Metter Toledo</td>
			<td>AL204</td>
			<td>0-100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi C-tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi Gentle MACS with heater blocks</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-018-306</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryopreservation tube</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME</td>
			<td>PathClear</td>
			<td>3442-005-01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringes</td>
			<td>Shanghai MIWA medical industry</td>
			<td>\</td>
			<td>1-5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog software</td>
			<td>Studylog</td>
			<td>\</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Balance and supporting USB</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>SE601F</td>
			<td>Balance and supporting USB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Data line of vernier calipers</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>926.6721</td>
			<td>Data line of vernier calipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>910.1502.10</td>
			<td>Sylvac S-Cal pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339653</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339651</td>
			<td>15mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>KLCS-288</td>
			<td>4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PLF-276</td>
			<td>&#8212;20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>DW-862626</td>
			<td>&#8212;80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>am7021</td>
			<td>\</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry

Tumores (syngeneic) homoplastia son el caballo de batalla de investigación preclínica de la inmuno-Oncología (entrada-salida) de hoy. El microambiente del tumor (TME), particularmente sus inmune-componentes, es de vital importancia para el pronóstico y la predicción de los resultados del tratamiento, especialmente los de inmunoterapia. TME inmune-componentes están compuestos de diferentes subconjuntos de células inmunes tumor-infiltración evaluables por FACS de varios colores. Adenocarcinoma ductal pancreática (PDAC) es entre el malignances mortales falta de opciones de buen trato, así una necesidad médica urgente y no satisfecha. Una razón importante para su no respuesta a diversos tratamientos (quimio-, apunta, I/O) ha sido su abundante TME, formado por fibroblastos y leucocitos que protegen las células del tumor de estas terapias. Orthotopically PDAC implantada parece más precisa recuperar la TME de los cánceres pancreáticos humanos que los modelos convencionales de (SC) subcutáneos.
Tumores de la homoplastia (KPC) son transplantes de ratón espontáneo PDAC origina KPC-ratones transgénicos (KrasG12D / +/ /Pdx1-53- / -PCre) (KPC-GEMM). El tejido del tumor primario se corta en fragmentos pequeños (~ 2 mm3) y trasplantado por vía subcutánea (SC) a los destinatarios syngeneic (C57BL/6, 7 – 9 semanas de edad). Los homoinjertos fueron entonces quirúrgico orthotopically trasplantado en el páncreas de ratones C57BL/6 nueva junto con la implantación de SC, que volúmenes tumor de 300 – 1.000 mm3 por 17 días. Sólo tumores de 400 – 600 mm3 fueron cosechados por el procedimiento de autopsia aprobado y limpiarse para eliminar los tejidos no tumorales adyacentes. Se disocia según el protocolo utilizando un Disociador de tejido en suspensión unicelular, seguida de tinción con paneles designados de anticuerpos marcados con fluorescencia para diversos marcadores de células inmunes diferentes (linfoide, mieloide y NK, DCs). Las muestras teñidas se analizaron varios colores FACS para determinar el número de células inmunes de diferentes linajes, así como su porcentaje relativo dentro de los tumores. Los perfiles inmunes de los tumores ortotópicos entonces fueron comparados con los de tumores de SC. Los datos preliminares demostraron significativamente elevadas infiltración TILs/TAMs en tumores en el páncreas y mayor infiltración de células B en orthotopic en lugar de tumores SC.

Implantación ortotópica de PDAC dio lugar a crecimiento rápido del tumor similar al visto para la implantación de SC. Después de que los fragmentos de tumor donantes fueron implantados en ratones receptores, tanto por vía subcutánea y orthotopically según los protocolos descritos en los pasos 2.1 y 2.2, los tumores de la homoplastia KPC implantados demostraron crecimiento similar como se muestra en el figura 1A . Tumores de la homoplastia KPC cosechad...

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Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

El procedimiento experimental en el immunophenotyping de homoinjertos PDAC Murino ortotópico pretende perfilar el inmuno-microambiente tumoral. Los tumores son orthotopically implantado mediante cirugía. Tumores de 200 – 600 mm3 en tamaño fueron cosechados y disociados para preparar suspensiones de unicelular, seguidos del análisis de marcador múltiple inmunológico FACS utilizando diferentes anticuerpos marcados con fluorescencia.

Immunophenotyping de Orthotopic la homoplastia (Syngeneic) de Adenocarcinoma Ductal pancreática KPC primaria murinas por citometría de flujo

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Este mensaje puede ayudar a responder preguntas clave en Inmunofenotipado en modelos Murine, como marcadores utilizados para identificar diferentes linajes de inmunidad y estrategias de envejecimiento. La principal ventaja de esta técnica es que el marcador y los estados de envejecimiento, al inmunofenotipado, se pueden aplicar a una variedad de modelos murinos. Monitoriza el peso corporal de los ratones C57 Black 6 usando un equilibrio.Además, controlar el volumen tumoral de los ratones donantes variables del tumor por medición de calibre. Después de la eutanasia del animal en una capucha de riesgo biológico según el protocolo, esterilizar la piel alrededor del tumor utilizando hisopos de iodofor. Después de extirpar el tumor como se detalla en el protocolo de texto, coloque el tumor en una placa de petri que contenga 20 mililitros de PBS que haya sido pre-enfriado a 4 grados Celsius.Si hay sangre contaminante, transfiera el tumor a otra placa de Petri y lave el tumor con PBS. Corta el tumor por la mitad. Retire cualquier piel, vasos, calcificación y necrosis adicionales.Elija sólo piezas intactas de tumor y colóquelas en un tubo estéril de centrífuga de 50 mililitros. Añadir 20 mililitros de PBS antes de transportar el tubo a una sala de animales separada para estudios de farmacología. Para prepararse para la implantación ortotópica, fije un ratón completamente anestesiado en una placa de experimento en la posición lateral derecha.Desinfectar la piel alrededor del bazo con idodine y luego des-yodinate con 75%alcohol etílico. Encuentra el punto medio del bazo y haz una incisión vertical de 1 centímetro en el abdomen para exponer el bazo. Suavemente, extraiga parte del tejido del páncreas debajo del bazo usando pinzas de punta planas.Y pieza tumoral homoinjerto de ratón sutro del ratón C en el páncreas del ratón receptor por sutura quirúrgica bsorbible de 9-O. Cierre el abdomen con una sutura de seda 6-O por costura doble. Lograr la homeostasis por compresión.Después de terminar la implantación del tumor, mantenga al animal en una jaula caliente mientras no se produzca sangrado o fuga de tejido tumoral. Monitorear al animal hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la recumbencia esternal. Devolver el animal a la habitación del animal después de la recuperación completa de la anestesia.Monitoree los ratones que varían del tumor palpando el abdomen cerca del bazo y seleccione los ratones que tienen tumores ortotópicos. Para cada tumor, prepara un tubo C con tampón de digestión tumoral. Utilice 3 mililitros de tampón de digestión para fragmentos tumorales inferiores a 0,8 gramos para garantizar que el tumor se digiere por completo.Etiquete el tumor con el código de estudio, el tumor, la identificación del ratón, el grupo de tratamiento y el peso del tumor. Recoge el tumor del ratón. Lave el tumor en PBS frío y limpie el tejido conectado al tumor.Coloque el tumor en medios de digestión en un pozo de una placa estéril de 6 pozos. Sostenga el tumor en su lugar con pinzas estériles o fórceps y corte con un bisturí. Corta el tumor lo suficientemente bien como para romperse en trozos más pequeños.Ahora, vuelva a colocar las piezas del tumor en el tubo C y use el tampón de digestión restante para lavar la placa. Transfiera el líquido al tubo C y colóquelo sobre hielo hasta la digestión. A continuación, encienda el disociador con calentadores.Coloque el tubo C de disociación tumoral boca abajo en la manga de la posición vacante. Ajuste el estado de la posición del tubo de Libre a Seleccionado. Elija un programa de disociación seguido de la selección de la carpeta requerida donde se muestra la lista de programas.Después de la terminación del programa, quite el tubo C del disociador y gire brevemente para paletr la muestra. Ahora, vuelva a suspender las muestras y colóquelas en un colador celular por encima de un tubo de 50 mililitros. Lave la célula a través del colador celular con 10 mililitros de tampón de lavado para proporcionar una suspensión de una sola célula.Después de centrifugar el tubo a 300 G durante 5 minutos, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células con 5 mililitros de tampón de lavado. Cuente las células viables y ajuste la concentración celular a 1 millón de células por tubo o por muestra. Realizar el diseño del panel inmune, inmunosuculción y fluorescencia menos un control como detalle en el protocolo de texto.Prepare las perlas UltraComp mientras los instrumentos de flujo se calientan vórticándolos a fondo antes de su uso. Etiquete un tubo de muestra separado de 12 x 75 milímetros para cada anticuerpo conjugado fluorocromo. Añadir 100 microlitros de tampón de tinción a cada tubo seguir por una gota completa de las cuentas.Añadir anticuerpos y realizar el procedimiento de tinción como se describe en el protocolo de texto. A continuación, agregue 0,5 mililitros de tampón de tinción a cada pellet de cordón y vuelva a suspender completamente a través del vórtice. Ahora, establezca el voltaje de citometría de flujo PMT por tejido objetivo para el experimento dado.Ejecute la muestra a través de la citometría de flujo para la adquisición de datos ganando en la población de cuentas de un solo lado por dispersión hacia delante y lecturas de dispersión lateral. Establezca el caudal de alrededor de 200 a 300 eventos por segundo. Establezca la compensación adecuada para un determinado anticuerpos de conjugación FITC de fluoresceína utilizando una gráfica de puntos FL1 frente a FL1.Coloque una puerta cuadrante para que las cuentas negativas estén dentro del cuadrante inferior izquierdo y las cuentas positivas estén dentro del cuadrante superior o inferior derecho. Ajuste los valores de compensación hasta que la intensidad media de fluoresceína de cada población sea aproximadamente igual. Repita estos pasos para todos los tubos.Ahora, proceda a la adquisición de muestras de manchas reales. Ejecute el asistente de compensación y guarde la configuración con el format:date, experiment y sus iniciales. La implantación ortotópica del adenocarcinoma ductal pancreático dio lugar a un rápido crecimiento tumoral similar al observado en la implantación subcutánea.Se muestran imágenes representativas de tinción de hematoxilina y eosina y demuestran un crecimiento similar de implantes subcutáneos y ortotópicos. Se obtuvieron rendimientos razonablemente altos de células viables a partir de la muestra tumoral de ambos tipos de implantación. El splat representativo FACS muestra células viables del tumor separado de las células muertas y los desechos celulares.Aquí se muestra un tumor que se infiltra en una comparación de perfil inmune de la población de células principales y numeradoras de varios subconjuntos clave de células inmunitarias tumorales. Se muestran homoinjertos subcutáneos frente a ortotópicos del cáncer de páncreas. Los datos muestran claramente que el tumor ha aumentado significativamente la infiltración de células inmunitarias en comparación con el páncreas de ratones sanos.Además, se encontraron diferentes porcentajes de subconjuntos de células inmunitarias infiltrantes de tumores en homoinjertos ortotópicos frente a subcutáneos. Por ejemplo, hay significativamente más células B en ortotópicas que en subcutáneas. Al intentar este procedimiento es importante recordar preparar todos los materiales y reactivos asociados con antelación.Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo realizar el análisis FACS para modelos murine.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Fluorescente modelo de ratón ortotópico de cáncer de páncreas

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Un modelo de ratón de la fatiga inducida por irradiación periférica

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Un modelo de ratón de cáncer de páncreas Syngeneic para estudiar los efectos de la electroporación Irreversible

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Un modelo murino Syngeneic bioluminiscente y fluorescente ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Trasplante ortotópico de células de Adenocarcinoma de pulmón Syngeneic para estudiar la expresión de PD-L1

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Imitando y manipulando Metaplasia pancreática Acinar Ductal en cultivo celular 3-dimensional

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Aislamiento y caracterización de modelos de organoide de adenocarcinoma ductal pancreático derivados del paciente

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultrasonido-Guiado Implantación Ortotópica de Adenocarcinoma Ductal Pancreático Murino

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Aislamiento de líquidos proximales para investigar el microambiente tumoral del adenocarcinoma pancreático

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

Un modelo ortotópico de ratón reseccional de cáncer de páncreas

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...