Name: immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry
Uploaded: 2018-10-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr Jody Barbeau - för kritisk läsning och redigering av manuskriptet och tacka Ralph Manuel för utformning av konstverk. Författarna vill även tacka Crown Bioscience onkologi immunonkologiska biomarkör laget och onkologi I Vivo team, för deras stora tekniska insatser.

Alla protokoll och tilläggsavtal eller förfaranden som inbegriper skötsel och användning av djur kommer att granskas och godkännas av Crown Bioscience institutionsvård av djur och använda kommittén (IACUC) före genomförandet av studier. Skötsel och användning av djur kommer vanligtvis att utföras enligt AAALAC (Föreningen för bedömning och ackreditering av laboratorium djur vård) internationella riktlinjer som rapporterats i Guide för vård och använda av försöksdjur, nationell forskning Rådet (2011...

<ol>
	<li>Chevrier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Immune+Atlas+of+Clear+Cell+Renal+Cell+Carcinoma.">An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma.</a> Cell. 169 (4), 736-749 (2017).</li><li>Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+immune+responses+in+the+tumor+microenvironment.">Monitoring immune responses in the tumor microenvironment.</a> Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).</li><li>Mosely, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+Selection+of+Syngeneic+Preclinical+Tumor+Models+for+Immunotherapeutic+Drug+Discovery.">Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery.</a> Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).</li><li>R&#252;hle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry.">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).</li><li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+focal+adhesion+kinase+renders+pancreatic+cancers+responsive+to+checkpoint+immunotherapy.">Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy.</a> Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).</li><li>Gunderson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruton+Tyrosine+Kinase-Dependent+Immune+Cell+Cross-talk+Drives+Pancreas+Cancer.">Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer.</a> Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).</li><li>Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+modeling+for+immuno-oncology.">Experimental animal modeling for immuno-oncology.</a> Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).</li><li>Takao, K., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+greatly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).</li><li>Payne, K. J., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-cell+lineage+commitment:+translation+from+mice+to+humans.">Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans.</a> Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>von Herrath, M. G., Nepom, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+translation:+barriers+to+implementing+clinical+immunotherapeutics+for+autoimmunity.">Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity.</a> J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).</li><li>Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+to+evaluate+novel+and+conventional+therapeutic+strategies+for+cancer.">Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer.</a> Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).</li><li>Erdag, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotype+and+immunohistologic+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+are+associated+with+clinical+outcome+in+metastatic+melanoma.">Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma.</a> Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).</li><li>Guti&#233;rrez-Garcia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+and+not+immunophenotypic+algorithms+predicts+prognosis+in+patients+with+diffuse+large+B-cell+lymphoma+treated+with+immunochemotherapy.">Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy.</a> Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).</li><li>Paiva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1/PD-1+presence+in+the+tumor+microenvironment+and+activity+of+PD-1+blockade+in+multiple+myeloma.">PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma.</a> Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).</li><li>Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+nature+of+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice.">Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).</li><li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Landscape+in+Early+Lung+Adenocarcinoma+by+Paired+Single-Cell+Analyses.">Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses.</a> Cell. 169 (4), 750-765 (2017).</li><li>Mahoney, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+Antibodies+to+Its+Cytoplasmic+Domain+Most+Clearly+Delineate+Cell+Membranes+in+Immunohistochemical+Staining+of+Tumor+Cells.">PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).</li><li>Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+expression+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+is+a+poor+prognostic+factor+in+patients+with+high+CD8++tumor-infiltrating+lymphocytes:+highly+sensitive+detection+using+phosphor-integrated+dot+staining.">PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining.</a> Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImmunoScore+Signature:+A+Prognostic+and+Predictive+Tool+in+Gastric+Cancer.">ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer.</a> Ann. Surg. , (2016).</li><li>Ribas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+Blockade+Expands+Intratumoral+Memory+T+Cells.">PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).</li></ol>

Även om studier med SC tumörer görs lättare, kan orthotopically implanteras tumörer modeller potentiellt vara mer relevant för prekliniska farmakologiska studier (särskilt I/O utredningar) att ge förbättrad översättbarhet. Denna rapport syftar till att hjälpa intresserade läsare/publiken för att kunna direkt visualisera de tekniska förfaranden som kan användas i deras respektive forskning. Våra protokoll visar att ortotop implantation av PDAC kan leda till effektiv tumörtillväxt, liknar SC implantation...

Pankreas duktal adenokarcinom (PDAC) orsakar nästan hälften en miljon dödlighet world-wide årligen, en av de topp 5 cancer mördarna. Det finns några effektiva behandlingsalternativ och inga godkända immunterapier; Därför behövs desperat nya behandlingar. Cancer är alltmer att erkännas som immunologiska sjukdomar, inklusive PDAC, förutom de genetiska sjukdomarna som kallas idag. Immunologiska och genetiska faktorer skulle sannolikt avgöra sjukdom prognos samt behandling utfall. Tumörer undgå värd immun övervakning och så småningom avancera för att orsaka död. Många av dessa immuna processer förekommer inom den tumör närmiljön (TME)1,2,3,4 där olika typer av immunceller interagera med tumörceller, med varandra och med andra tumör stromaceller komponenter, direkt eller indirekt via cytokiner som i slutändan avgör sjukdom resultatet. Karakterisering av tumör immun komponenter av TME eller tumör immunophenotyping, inklusive subtypning, numrering och lokalisering av olika härstamningar av immunceller, är därför avgörande för att förstå anti-tumor immunitet. När det gäller PDAC, har det föreslagits att förhöjda tumör-infiltrera suppressiv makrofager (TAM) och B-celler har lett till förebyggande av T-cell infiltration eller aktivering och höga nivåer av fibros5,6.
Det gemensamma förhållningssättet till utreda immun TMEs experimentellt skulle använda surrogat tumör prekliniska djurmodeller, främst relevant mus tumör modeller7, särskilt mus syngena (homograft) eller genetiskt modifierade musmodeller (GEMM) av cancer, den förmodade likheten mellan mus och människa för tumörer och immunitet8,9. I verkligheten är det underförstått att det finns inneboende skillnader mellan två arter10,11.
Transplanterade mus tumörer har betydande operativa fördelar över spontana tumörer7, nämligen synkroniserade tumörutveckling, i motsats till den föräldra GEMM spontana tumörutveckling. Homografts av spontana murina tumörer anses primära tumörer har aldrig varit manipulerade in vitro-och spegling ursprungliga mus tumör histo- / molekylär patologi7, samt möjligt immuna profiler. Dessa murina homografts anses ofta vara ”en mus version av patientderiverade xenograft (PDXs)”. De har därför sannolikt en bättre översättbarhet än konventionella syngena cell linje-derived mus tumörer12. Särskilt härrör många homografts från specifika GEMM där specifika mänskliga sjukdomsmekanismer, e.g. onkogena driver mutationer, är konstruerade, och dessa homografts bör därför ha fördelar till deras kliniska relevans. I synnerhet utveckla KPC GEMM mus PDAC inom 15 – 20 veckor ålder, som morfologiskt recapitulates mänskliga sjukdomar med huvudsakligen brunn - till måttligt-differentierade glandular arkitektur och höganrikat stroma. Denna modell recapitulates också de vanligaste genetiska särdrag av mänskliga PDAC, nämligen Kras aktiverande mutation och P53 förlust-av-funktion, som förekommer i 90% och 75% av mänskliga PDAC, respektive5,6.
Platser av transplantation har också föreslagits för att spela en roll i modell översättbarhet. Specifik vävnad omgivningen, såsom en motsvarande ortotop miljö, kan vara en nisch för specifika tumörer till framsteg, i motsats till den enhetliga subkutan (SC) miljöer för vanligen transplanterade tumörer. Det skulle vara av särskilt intresse om och/eller, vilken skillnad finns mellan de två platserna som transplantation, vad gäller immun-närmiljön och relevansen för människa cancer, t.ex. När det gäller PDAC.
En av de viktigaste aspekterna av immun profilering, eller immunophenotyping, är att fastställa tumör-infiltrera immunceller av olika härstamningar, numrerar, relativa andel inom tumörer, samt deras aktivering stater och platser. Detta inkluderar tumör-infiltratrating lymphoctyes (TILs, både T- och B-), tumör-infiltrera makrofager (TAMs), tumör-infiltrera naturliga mördarceller (NKs) och tumör-resident dendritiska celler3,13,14 , 15 , 16 , 17och subcellulär lokalisering av vissa celler18,19,20, etc. Fluorescens aktiverad Cell sortering (FACS) eller flöde flödescytometri är en encellig detection-teknik som ofta används för att mäta de specifika parametrarna i en cell. Flerfärgade flow flödescytometri åtgärder flera markörer på en enda cell3,4,21 och är den vanligaste metoden för att fastställa antal och relativa andel av olika undergrupper av immunceller, inklusive de inom tumörer.
Denna rapport beskriver procedurer för profilering tumör-infiltrera immunceller: 1) Implantation av ortotop PDAC mus tumör homografts, tillsammans med SC implantation; (2) tumör vävnad skörd och enda cell förberedelse via tumör dissociation; (3) Flödesanalys för flödescytometri av alla celler härstammar från tumörer som utgångspunkt; (4) jämförelse av baslinjen profiler både metoder för transplantation.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine</td>
			<td>\</td>
			<td>SAS3119</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trocar 20</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>2mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotic and antimycotic</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
			<td>Daily pharmacy purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Air chemical</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood</td>
			<td>AIRTECH</td>
			<td>BSC-1300IIA2</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine LSRFortessa X-20</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibodies</td>
			<td>BD</td>
			<td>\</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration</td>
			<td>BD</td>
			<td>354248</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffers</td>
			<td>BD</td>
			<td>554656</td>
			<td>Mincing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Staining Buffer</td>
			<td>BD</td>
			<td>563794</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td>553142</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell filters</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>70&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>routine blood tube</td>
			<td>BD-Vacutainer</td>
			<td>365974</td>
			<td>2mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td>vs 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3 Fix/Perm kit</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810R,5920R</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td>\</td>
			<td>vs 10.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable, sterile scalpels</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J12100</td>
			<td>11#</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife handle</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>J11010</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>Y00030</td>
			<td>Eye scissors 10cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye scissors and tweezers</td>
			<td>Jin zhong</td>
			<td>JD1060</td>
			<td>Eye tweezers 10cm with teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable liquid nitrogen tank</td>
			<td>Jinfeng</td>
			<td>YDS-175-216</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Metter Toledo</td>
			<td>AL204</td>
			<td>0-100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi C-tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi Gentle MACS with heater blocks</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-018-306</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-096-730</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryopreservation tube</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>375418</td>
			<td>1.8ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME</td>
			<td>PathClear</td>
			<td>3442-005-01</td>
			<td>\</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringes</td>
			<td>Shanghai MIWA medical industry</td>
			<td>\</td>
			<td>1-5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog software</td>
			<td>Studylog</td>
			<td>\</td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Balance and supporting USB</td>
			<td>OHAUS</td>
			<td>SE601F</td>
			<td>Balance and supporting USB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studylog-Data line of vernier calipers</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>926.6721</td>
			<td>Data line of vernier calipers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Sylvac</td>
			<td>910.1502.10</td>
			<td>Sylvac S-Cal pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339653</td>
			<td>50mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>339651</td>
			<td>15mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>KLCS-288</td>
			<td>4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>PLF-276</td>
			<td>&#8212;20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>DW-862626</td>
			<td>&#8212;80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>am7021</td>
			<td>\</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunophenotyping of orthotopic homograft (syngeneic) of murine primary kpc pancreatic ductal adenocarcinoma by flow cytometry

Homograft (syngena) tumörer är arbetshästen i dagens immunonkologiska (I/O) preklinisk forskning. Den tumör närmiljön (TME), särskilt dess immun-komponenter, är avgörande för prognos och Prediktion av behandlingsresultat, särskilt de av immunterapi. TME immun-komponenter består av olika undergrupper av tumör-infiltrera immunceller som taxeras av flerfärgade FACS. Pankreas duktal adenokarcinom (PDAC) är bland de dödligaste malignances saknar bra behandlingsalternativ, således ett brådskande och otillfredsställda medicinska behov. En viktig orsak till dess icke-lyhördhet för olika terapier (kemo-, målinriktad, I/O) har varit dess rikliga TME, bestående av fibroblaster och leukocyter som skydda tumörceller från dessa behandlingar. Orthotopically implanterade PDAC tros mer exakt återta TME av mänskliga pankreas cancer än konventionell subkutan (SC) modeller.
Homograft tumörer (KPC) är transplantationer av mus spontana PDAC härrör från genetiskt modifierade KPC-möss (KrasG12D / +/P53- / -/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). Den primära tumor vävnaden skärs i små fragment (~ 2 mm3) och transplanteras subkutant (SC) till syngena mottagare (C57BL/6, 7 – 9 veckor gamla). Homografts var sedan kirurgiskt orthotopically transplanteras på bukspottkörteln av nya C57BL/6 möss, tillsammans med SC-implantation, som nådde tumör volymer av 300 – 1000 mm3 av 17 dagar. Endast tumörer av 400 – 600 mm3 var skördas per godkänt obduktion förfarande och rengöras för att avlägsna de intilliggande icke-tumörvävnad. De var separerade per protokoll använder en vävnad dissociator i enskild cell suspensioner, följt av färgning med utsedda paneler av fluorescently-märkta antikroppar för olika markörer av olika immunceller (lymfoida, myeloisk och NK, DCs). De färgade proverna analyserades med flerfärgade FACS för att bestämma antalet immunceller som olika härstamningar, samt deras relativa procentandel inom tumörer. Immun profiler av ortotop tumörer jämfördes sedan med SC tumörer. De preliminära uppgifterna visade förhöjt infiltrera TILs/TAMs i tumörer över bukspottkörteln och högre B-cell infiltration i ortotop i stället för SC tumörer.

Ortotop implantation av PDAC resulterade i snabb tumörtillväxt liknar den som ses för SC implantation. Efter givaren tumör fragment var implanteras i mottagarens möss, både subkutant och orthotopically enligt protokoll som beskrivs i steg 2.1 och 2.2, inopererad KPC homograft tumörer visade liknande snabba tillväxt som visas i figur 1A . KPC homograft tumörer skördas vid olika tidpunkter visas i figur 1B och representan...

Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry at JoVE.com

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Det experimentella förfarandet på immunophenotyping av murina ortotop PDAC homografts syftar till profilering av tumör immuno-mikromiljö. Tumörer är orthotopically implanteras via kirurgi. Tumörer i 200 – 600 mm3 i storlek var skördas och skiljas för att förbereda encelliga suspensioner, följt av flera immun markör FACS analys med hjälp av olika fluorescently-märkt antikroppar.

Immunophenotyping av ortotop Homograft (syngena) av murina primära KPC pankreas duktal adenokarcinom av flödescytometri

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Detta meddelande kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i Immunophenotyping i Murine modeller, till exempel markörer som används för att identifiera olika immunitet härstamningar och åldrande strategier. Den stora fördelaktiga av denna teknik är att markören och åldrande stategies, när immunophenotyping, kan gälla en mängd olika murine modeller. Övervaka kroppsvikten hos C57 Black 6-möss med hjälp av en balans.Också, övervaka tumörvolymen av tumör varierande givare möss av kaliber mätning. Efter dödshjälp av djuret i en biohazard huva enligt protokollet, sterilisera huden runt tumören med hjälp av Iodophor svabbprover. Efter kirurgiska ta bort tumören som beskrivs i textprotokollet, placera tumören i en petriskål som innehåller 20 milliliter PBS som har pre-kyld till 4 grader Celsius.Om det finns förorenande blod, överföra tumören till en annan Petri-skålen och tvätta tumören med PBS. Skär av tumören på mitten. Ta bort eventuella extra hud, kärl, förkalkning, och nekros.Välj bara intakta bitar av tumör och placera dem i en steril 50 milliliter centrifugrör. Tillsätt 20 milliliter PBS innan du transporterar rör till ett separat djurrum för farmakologiska studier. För att förbereda för orthotopic implantation, fixera en helt bedövande mus på ett experiment ombord i rätt lateral position.Desinficera huden runt mjälten med jod och sedan de-iodinate med 75%etylalkohol. Hitta medianpunkten för mjälten och gör ett 1 centimeter vertikalt snitt på buken för att exponera mjälten. Försiktigt, dra ut en del av bukspottkörteln vävnad under mjälten med hjälp av platt spets pincett.Och sutro mus homograft tumör bit från C-musen på bukspottkörteln av mottagaren musen av 9-O bsorbable kirurgiska sutur. Stäng buken med en 6-O siden sutur med dubbelsöm. Uppnå homeostas genom komprimering.Efter avslutad tumörimplantation, hålla djuret i en varm bur så länge ingen blödning eller tumörvävnad läckage uppstår. Övervaka djuret tills de återfår tillräckligt med medvetande för att upprätthålla sternal recumbency. Returnera djuret till djurrummet efter full återhämtning från anestesi.Övervaka tumören varierande möss genom palpering buken nära mjälte och välj ut möss med ortopiska tumörer. För varje tumör, förbereda ett C-rör med tumör matsmältningsbuffert. Använd 3 milliliter av matsmältningsbuffert för tumörfragment mindre än 0,8 gram för att säkerställa att tumören är helt smält.Märk tumören med studiekoden, tumören, mus-ID, behandlingsgrupp och tumörvikt. Samla in tumören från musen. Tvätta tumören i kalla PBS och rensa ut vävnaden fäst på tumören.Placera tumör i digestion media i en brunn av en steril 6-väl platta. Håll tumören på plats med steril pincett eller pincett och skiva med en skalpell. Skiva tumören tillräckligt bra för att bryta sig in i mindre bitar.Nu, placera tumörbitarna tillbaka i C-röret och använd den återstående matsmältningsbufferten för att tvätta plattan. Överför vätskan i C-röret och placera den på is tills matsmältningen. Slå sedan på dissociator med värmare.Placera tumör dissociation C-röret upp och ner i hylsan på den lediga positionen. Justera status för rörposition från Ledig till Vald. Välj ett dissociationsprogram följer av valet av den mapp som krävs där listan över program visas.Efter avslutad program, ta C-rör av dissociator och snurra kort för att palla provet. Nu, åter upphäva proverna och lägg dem i en cell sil ovanför en 50 milliliter rör. Tvätta cellen genom cellsilen med 10 milliliter tvättbuffert för att ge en enda cellfjädring.Efter centrifugeringsröret vid 300 G i 5 minuter, kassera supernatanten och dra upp cellerna på ett återuppseänd med 5 milliliter tvättbuffert. Räkna livskraftiga celler och justera cellkoncentrationen till 1 miljon cell per rör eller per prov. Utför immunpaneldesign, immunfärgning och fluorescens minus en kontroll som detalj i textprotokollet.Förbered UltraComp pärlor medan flödet instrumenten värms upp genom att virveling dem noggrant före användning. Märk ett separat provrör på 12 x 75 millimeter för varje fluorokromer konjugerade antikroppar. Tillsätt 100 mikroliter färgningsbuffert till varje rör följt av en hel droppe av pärlorna.Lägg till antikroppar och utför infärgningsproceduren enligt beskrivningen i textprotokollet. Tillsätt sedan 0,5 milliliter färgningsbuffert till varje pärla pellet och helt åter upphäva via virvel. Nu, set Flow cytometry PMT spänning per mål vävnad för det givna experimentet.Kör provet genom prov genom Flow cytometry för datainsamling genom att få på singlet pärla befolkningen per framåt scatter och sida avläsningar scatter. Ställ in flödet runt 200 till 300 händelser per sekund. Ange lämplig kompensation för en given fluorescein FITC konjugation antikroppar med hjälp av en FL1 kontra FL1 dot plot.Placera en kvadrant grind så att de negativa pärlorna är inom den nedre vänstra kvadranten och de positiva pärlorna är inom övre eller nedre högra kvadranten. Justera kompensationsvärdena tills medianen för fluorescensentiteten för varje population är ungefär lika. Upprepa dessa steg för alla rör.Nu, fortsätt att förvärva faktiska fläckprover. Kör kompensationsguiden och spara inställningen med formatet:datum, experiment och dina initialer. Orthotopic implantation av bukspottskörteln duktal adenocarcinom resulterade i snabb tumör tillväxt liknande den som ses i subkutan implantation.Representativa hematoxylin och eosin färgning bilder visas och visa liknande tillväxt av subkutana och orthotopic implantat. Rimligt hög livskraftiga celler avkastning erhölls från tumören provet av båda typer av implantation. Den representativa FACS splat visar livskraftiga celler från tumör separeras från de döda cellerna och cell skräp.Visas här, är en tumör infiltrera en immunprofil jämförelse av de stora och täljare cellpopulationen av flera viktiga delmängder av tumör immunceller. Subkutan kontra ortopic homograft av cancer i bukspottskörteln visas. Uppgifterna visar tydligt att tumören har avsevärt öka immuncell infiltration som jämför med bukspottkörteln av friska möss.Dessutom hittades olika procentsatser av tumör infiltrera immun cell delmängder i orthotopic kontra subkutan homografts. Till exempel, Det finns betydligt fler B-celler i orthotopic än i subkutan. Samtidigt som man försöker detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att förbereda alla tillhörande material och reagenser i förväg.Efter att ha sett den här videon, bör du ha en god förståelse för hur man utför FACS analys för murine modeller.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Fluorescerande Orthotopic musmodell för cancer i bukspottskörteln

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

En musmodell av trötthet inducerad av perifera bestrålning

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

En syngena pankreascancer musmodell att studera effekterna av irreversibel elektroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

En självlysande och fluorescerande ortotop syngena murina modell av Androgen-beroende och kastrationsresistent prostatacancer

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Ortotop Transplantation av syngena lunga adenokarcinom celler att studera PD-L1-uttryck

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Härma och manipulera bukspottskörteln Acinar-till-duktal metaplasi i 3-dimensionell cellodling

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolering och karakterisering av patient-derived bukspottskörteln ductal adenocarcinom Organoid modeller

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultraljud-guidad ortotopisk implantation av murin Pancreatic ductal adenocarcinom

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolering av proximala vätskor för att undersöka tumörmikromiljön i bukspottskörtelns adenokarcinom

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

En ortopisk sambandsmusmodell av bukspottskörtelcancer

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...