Name: de novo generation of somatic stem cells by yap/taz
Uploaded: 2018-05-07T14:00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ at JoVE.com

Vi takker F. Camargo for gaven af Millie-YAPS127A mus; R26-rtTAM2 mus (stock #006965) blev købt fra The Jackson laboratorium. Vi takker Chiara Frasson og Giuseppe Basso hjælp til FACS procedurer. Dette arbejde støttes af AIRC særlige Program molekylære klinisk onkologi '' 5 promille '' og en AIRC PI-tilskud til Pia og ved Epigenetik flagskibsprojekt CNR-Miur tildeler S.P. Dette projekt har modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EUs Horisont 2020 forsknings- og innovationsprogram (tilskudsaftale DENOVOSTEM nr. 670126).

<ol>
	<li>Panciera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem/Progenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP/TAZ.">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li><li>Bar-Nur, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+conversion+induced+by+pluripotency+factors+involves+transient+passage+through+an+iPSC+stage.">Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).</li><li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+strategies,+mechanisms,+and+applications.">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+plasticity.+Plasticity+of+epithelial+stem+cells+in+tissue+regeneration.">Stem cell plasticity. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration.</a> Science. 344 (6189), 1242281 (2014).</li><li>Bai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yes-associated+protein+regulates+the+hepatic+response+after+bile+duct+ligation.">Yes-associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation.</a> Hepatology. 56 (3), 1097-1107 (2012).</li><li>Cai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+signaling+pathway+restricts+the+oncogenic+potential+of+an+intestinal+regeneration+program.">The Hippo signaling pathway restricts the oncogenic potential of an intestinal regeneration program.</a> Genes Dev. 24 (21), 2383-2388 (2010).</li><li>Elbediwy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+signalling+regulates+YAP+and+TAZ+to+control+skin+homeostasis.">Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis.</a> Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).</li><li>Taniguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gp130-Src-YAP+module+links+inflammation+to+epithelial+regeneration.">A gp130-Src-YAP module links inflammation to epithelial regeneration.</a> Nature. 519 (7541), 57-62 (2015).</li><li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+of+mutant+KRAS,+the+transcription+regulator+YAP+is+essential+for+neoplastic+progression+to+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Sci Signal. 7 (324), ra42 (2014).</li><li>Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP/TAZ+at+the+Roots+of+Cancer.">YAP/TAZ at the Roots of Cancer.</a> Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).</li><li>Azzolin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP/TAZ+incorporation+in+the+beta-catenin+destruction+complex+orchestrates+the+Wnt+response.">YAP/TAZ incorporation in the beta-catenin destruction complex orchestrates the Wnt response.</a> Cell. 158 (1), 157-170 (2014).</li><li>Stingl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li><li>Means, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+epithelial+plasticity+mediated+by+acinar+cell+transdifferentiation+and+generation+of+nestin-positive+intermediates.">Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates.</a> Development. 132 (16), 3767-3776 (2005).</li><li>Shi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+acinar+cell+organization+is+critical+to+preventing+Kras-induced+acinar-ductal+metaplasia.">Maintenance of acinar cell organization is critical to preventing Kras-induced acinar-ductal metaplasia.</a> Oncogene. 32 (15), 1950-1958 (2013).</li><li>Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Fernandez Vallone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trop2+marks+transient+gastric+fetal+epithelium+and+adult+regenerating+cells+after+epithelial+damage.">Trop2 marks transient gastric fetal epithelium and adult regenerating cells after epithelial damage.</a> Development. 143 (9), 1452-1463 (2016).</li><li>Yanger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cellular+reprogramming+occurs+spontaneously+during+liver+regeneration.">Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration.</a> Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).</li><li>Yui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP/TAZ-Dependent+Reprogramming+of+Colonic+Epithelium+Links+ECM+Remodeling+to+Tissue+Regeneration.">YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li><li>Pan, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+patterns+of+multipotentiality+in+Ptf1a-expressing+cells+during+pancreas+organogenesis+and+injury-induced+facultative+restoration.">Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration.</a> Development. 140 (4), 751-764 (2013).</li><li>Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+YAP+and+TAZ+in+physiology+and+disease.">Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 758-770 (2017).</li></ol>

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

Her præsenterer vi protokoller for at omprogrammere ex vivo terminalt differentieret epitelceller af forskellige væv ind i deres tilsvarende væv-specifikke stamceller (eller ySCs) ved forbigående ekspression af YAP, som rapporteret tidligere1. Vi har detaljerede to procedurer: en giver mulighed for omprogrammering af FACS-renset celler gennem lentiviral vektorer og en anden en, der undgår viral infektion og drager fordel af transgene YAP udtryk. Hver protokol præsenterer en effektiv strategi til at isolere og kultur primære differentierede celler og en strategi til at tvinge eksogene YAP genekspression i differentierede celler, generere de novo somatiske væv-specifikke udvides stamceller (jf. ordninger i figurer 1A og 2A).
Vi viste, at isolation strategier her præsenteret effektivt isolerer en ren population af differentierede celler, som det fremgår af det faktum, at vi aldrig fundet nogen udvækst fra negative kontrolprøver (tal 1 c og 2 C).
De lentiviral vektorer bruges i denne undersøgelse for omprogrammering af primære brystkirtler LD celler er doxycyclin inducerbar, tilbyder muligheden for en stram kontrol af transgenet udtryk; Dette giver mulighed for at tænde og slukke eksogene YAP udtryk på vil. Særlig opmærksomhed bør placeres i at undgå brugen af en overdreven viral titer, som dette kan være til skade for omprogrammering effektivitet. I tilfælde af primær acinar celler skiftede vi til en fuldt transgene tilgang til at opnå en YAP-afhængige omprogrammering med minimal manipulationer. Denne sidstnævnte strategi er også yderst velegnede til primær Pancreas acini, som isolerede acinar klynger er næppe imødekommenhed over for lentiviral infektion og meget skrøbelig. Den transgene strategi ansat tilbyder den samme fordel af doxycyclin-afhængige lentiviral vektorer for stram kontrol af genekspression. Desuden, den transgene strategi udnyttes med primære pancreas acini bærer den yderligere fordel af en meget højere omprogrammering effektivitet i forhold til viral-induceret omprogrammering af brystkirtler LD celler. Ud over de forskellige iboende plasticitet forbundet til celler, der stammer fra forskellige væv, kan den højere sats af pancreas omprogrammering være afledt fra den højere effektivitet af udtryk i forbindelse til ensartet og autonome YAP udtryk i alle eksplanterede celler. Især, har vi vist, at eksogene YAP er ikke længere nødvendig efter generation af ySCs (yMaSC kolonier og yDucts), uden at det påvirker deres selvfornyelse kapacitet. Dette er fordi ySCs genaktivere endogene YAP/TAZ og bruge dem til selvfornyelse, når eksogene YAP er slukket1.
Vi valideret forestillingen om, at ySCs faktisk opstå fra differentierede celler ved at kontrollere cellen i oprindelsen af vores omprogrammering eksperimenter gennem genetiske afstamning sporingen valideringer1.
Omfattende karakteriseringaf ySCs viser at YAP-induceret omprogrammering genererer normale somatiske SCs1 som jeg) på niveauet transkriptom ySCs vise massive overlapninger med indfødte SCs; II) ySCs vise differentiering potentielle og kan generere en multilineage afkom altid begrænset til identiteten af deres væv af oprindelse; III) ySCs er ikke-transformeret og ikke-tumorfremkaldende når transplanterede i vivo.
Her vi også beskrive procedurer for at opretholde og udvide i kultur både yMaSCs og yDucts som organoids indlejret i 100% basalmembranen matrix hydrogels. Disse betingelser giver mulighed for selv-organisering af ySCs i tre-dimensionelle organoids, der sikrer opretholdelsen af stemness egenskaber langsigtede i kultur, gør det muligt at udvide disse stamceller befolkninger på viljen til downstream analyser og applikationer. Af ukendte årsager, kunne vi ikke få yMaSC organoids ved at placere inficeret LD celler direkte i organoid kultur betingelser 7 dage efter doxycyclin behandling i plast vævskultur plade; med andre ord, er det mellemliggende vækst skridt i Brystkirtlerne koloni betingelser afgørende. I vores hænder kræver selv indfødte MaSCs brystkirtler koloni betingelser før passaging i organoid kultur. Desuden opnås den mest effektive organoid udvækst når vi undgå skaber de primære kolonier i enkelt celler, men snarere overføre de intakte kolonier i organoid kultur betingelser.
Organoid kultur betingelser også bærer fordel af at give mulighed for at cryopreserve ySCs, forudsat at organoids inddrives fra deres matricer, undgå celle dissociation før kryopræservering i kvælstof bad.
YAP omprogrammering procedure præsenteret kan konvertere forskellige differentieret celletyper stammer fra forskellige voksen væv i deres tilsvarende væv-specifikke stamceller (vi har testet den ved hjælp af brystkirtler, pancreas og neuronale celler)1. Til forskel fra iPSCs eller andre omprogrammering bestræbelser, kan YAP/induceret SCs bevare minderne om deres væv af oprindelse. Bemærk, nedtrapning differentiering af somatiske celler i cellerne begavet med stilk-lignende egenskaber er den eneste form for celle skæbne plasticitet og omprogrammering observeret in vivo, for eksempel efter vævsskader og understøtter sårheling5,17 , 18 , 19 , 20. det er bemærkelsesværdigt, at BJÆFFE og TAZ er i vid udstrækning undværes for normal homøostase, men afgørende for væv reparation i flere væv11,21. Konsekvent med en fysiologisk funktion af omprogrammering trin her beskrevet, har YAP/TAZ for nylig vist sig at være påkrævet i tarm regenerering i musemodeller af colitis ulcerosa patienter ved at forårsage en konvertering af voksne intestinale celler i en reparation epitel, der viser funktionerne i føtal gut19. YAP omprogrammering således udvider de nuværende induceret celle plasticitet strategier ved at give et middel til at generere somatiske stamceller, en stat, der har hidtil udfordrende for at fange in vitro. Denne fremgangsmåde, hvis udvides også til menneske-afledte celler, måske har bred relevans fra regenerativ medicin programmer til studiet af den somatiske stemness tilstand og til udbygning af somatiske stamceller celler in vitro.

Væv-specifikke somatiske stamceller (SCs) er kritiske for fornyelse af væv og reparation efter skade. Mulighed for at nemt isolere og ubegrænset udvide ex vivo somatiske SCs repræsenterer et kritisk spørgsmål for potentielle regenerative behandlinger samt for SC applikationer i grundforskning og sygdom modellering. Fremskridt i denne retning, men har været begrænset af vanskeligheden ved at indfange SC staten af forskellige epitelial organer in vitro. Faktisk i flere voksen væv bosiddende SCs kan ikke findes eller ikke være let tilgængelige, eller deres antal og regenerativ potentiale kan blive udhulet af ældning eller sygdom forhold. I 2016, begyndte vi at udfylde dette hul ved at rapportere dette udtryk for en enkelt transcriptional coactivator, YAP (ja-forbundet protein) eller dens nært beslægtede proteiner TAZ (transcriptional activator med en PDZ motiv), i terminalt differentieret celler effektivt skaber funktionelle, kan udvides, ikke-tumorfremkaldende, autologe cellepopulationer, der er operationelt og molekylært skelnes fra deres tilsvarende væv-specifikke SCs1. En puls af vedvarende YAP eller TAZ aktivitet for få dage er tilstrækkelig til at fremkalde udseendet af selvstændig fornyelse somatiske SCs. Dette er en stabil tilstand, der er ikke længere afhængige af kontinuerlig transgen udtryk, som det kan overføres gennem celle generationer uden yderligere udtryk for ektopisk YAP/TAZ1. Protokollen præsenteres her detaljer proceduren, der bruges til at generere de novo epitelial stem/stamceller i mælkekirtlen og bugspytkirtel, startende fra differentierede celler i disse væv. Denne procedure fylder en sort boks i den nuværende omprogrammering/transdifferentiation arena. Vigtigste bestræbelser i disse retninger har faktisk indtil videre centreret på celle overgang til slutbrugeren inducerede pluripotente stamceller (iPSC), efterfulgt af konvertering af disse embryonale og pluripotente SCs i mere differentierede celler. IPSCs er dog tumorfremkaldende en gang indført i voksent væv, at øge behovet for at udvikle protokoller til deres fuldstændige og effektive differentiering2. Men denne differentiering skridt, selv når det er muligt, kommer til en pris af langsigtede udvidelsesmuligheder, selvorganisering og orgel genindsættelse potentialer. Disse er væsentlige attributter for orgel regeneration, der er faktisk typisk kun af endogene væv-specifikke SCs og af de i øjeblikket beskrevet YAP-induceret SCs (ySCs). Ligeledes differentierede direkte transdifferentiation i én celletype til en anden ved hjælp af cocktails af forskellige transskription faktorer også generere celler, der mangler væsentlige proliferativ og stemness potentielle3.
Proceduren beskrevet her også udnytter den nyligt indførte organoid teknologi, hvorved endogene SCs kan udvides og differentieret ex vivo4. YAP-induceret SCs kan generere organoid-dannende SCs selv i eksperimentel, biologiske eller sygdom betingelser hvor endogene SCs ikke er til stede. Vi vil gerne bemærke, at typen celle plasticitet formidles af YAP på forskellen med andre omprogrammering procedurer, kan svare til den eneste form for tilbagevenden til et SC-lignende status, der opstår i levende væv. Genfangst af SC-lignende træk har været forbundet med væv reparation eller muterede aktivering5. Selvom undværes for homeostase af flere voksen væv, er YAP og/eller TAZ absolut afgørende for regenerering, tumorvækst og ekspansion af somatiske SCs i vitro1,6,7,8 ,9,10,11,12

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1099">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">10 mL sterile syringes</td>
			<td style="width:123px;">Rays</td>
			<td style="width:112px;">10LC</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm&#160; cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">15 mL sterile conical tubes</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">430052</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">24-well ultra low attachment plates</td>
			<td style="width:123px;">Costar</td>
			<td style="width:112px;">3473</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">40 mm cell strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:112px;">352340</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">48-well multiwell plates</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">353078</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">50 mL sterile conical tubes</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">430290</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">6-well multiwell plates</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">353046</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">12634028</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BPE</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>13028014</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">Collagenase, type I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>17018029</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dispase</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">1705-041</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">Disposable scalpels</td>
			<td style="width:123px;">Swann-Morton</td>
			<td style="width:112px;">0503</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">11320033</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">DMSO</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">D2650</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DnaseI</td>
			<td style="width:123px;">Roche</td>
			<td style="width:112px;">11284932001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">E5134</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51976</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FACS tubes (with strainer caps)</td>
			<td style="width:123px;">Falcon</td>
			<td style="width:112px;">352235</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM)</td>
			<td style="width:123px;">BioLegend</td>
			<td style="width:112px;">118208</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUdeltaGW-rtTA&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#19780&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-EGFP</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84041</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-MCS</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84008</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-wtYAP</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84009</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:481px;">FUW-tetO-YAPS94A</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84010</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">35050061</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">24020117</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30721</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heparin sodium salt</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">H3149&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer solution (1M)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">15630-056</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human R-Spondin1 (His Tag)</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>11083-H08H-5</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ITS-X</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>51500056</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">K-14 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>Ab7800&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">K-8 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>Ab14053&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">&#160;25030081</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail)</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">51-9003632</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel&#174; Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>0402</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72340</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish &#248; 94)</td>
			<td style="width:123px;">ROLL</td>
			<td style="width:112px;">18248</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 10x</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECM4004XL</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE Hamster Anti-Mouse CD61</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">553347</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">551129</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody</td>
			<td style="width:123px;">BioLegend</td>
			<td style="width:112px;">102222</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen I (coating)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">122-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen I for 3D culture</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3447-020-01&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant murine EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant murine FGF basic (bFGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td style="width:112px;">450-33</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>31870025</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris BASE&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814273001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0,05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Waymouth medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>31220023</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

de novo generation of somatic stem cells by yap/taz

Her præsenterer vi protokoller for at isolere primære differentierede celler og drej dem i stem/stamceller (SCs) af samme slægt af forbigående udtryk for transskription faktor YAP. Med denne metode konverteres luminale differentieret (LD) celler i mælkekirtlen mus til celler, der udviser molekylære og funktionelle egenskaber af brystkirtler SCs. YAP også slår fuldt differentierede i bugspytkirtlen eksokrine celler i pancreas kanalen-lignende stamfaderen. På samme måde til endogen, naturlige SCs, kan YAP-induceret stilk-lignende celler ("ySCs") i sidste ende udvides, som organoid kulturer lang sigt in vitro uden yderligere behov for ektopisk YAP/TAZ, som ySCs er udstyret med en arvelige selvstændig fornyelse SC-lignende tilstand.
Proceduren omprogrammering præsenteres her tilbyder muligheden for at generere og udvide in vitro- stamceller af forskellige væv kilder fra differentierede celler. Enkel udvidelse af somatiske celler ex vivo har konsekvenser for regenerativ medicin, for forståelse mekanismer af tumor indledning og generelt for celle og udviklingsmæssige biologi undersøgelser.

Generation af yMaSCs Overblik over den eksperimentelle strategi til at omprogrammere primære brystkirtler LD celler af forbigående udtryk af YAP er præsenteret i figur 1A. Primære brystkirtler LD epitelceller er renset af fluorescerende-aktiveret celle sortering13. Figur 1B repræsenterer en typisk sortering procedure at opnå tre forskellige delpopulationer: Basal celler (EpCAMlavCD49fhøjCD61-), luminale stamfader (LP) celler (EpCAMhøjCD49flavCD61+ ) og LD celler (EpCAMhøjCD49flavCD61-). Omhyggelig gating af de tre delpopulationer er afgørende for at isolere en ren forberedelse af LD celler, der er fuldt differentierede og helt vækst anholdt når seedede i mælkekirtlen kolonidannende betingelser (Se figur 1 c, venstre panel). Omvendt, når tilskyndet til at udtrykke eksogene YAP, LD celler begynde prolifererende for at danne letgenkendeligt tætte epitelial kolonier i 5% basalmembranen matrix suspension kulturer (figur 1 c). Effektiviteten af omprogrammering, attesteret omkring 3% for en typisk eksperiment, kan blive scoret ved at tælle antallet af kolonier over antallet af enkelt celler oprindeligt seedede i basalmembranen matrix suspension kulturer (fig. 1 d). Omprogrammerede luminale celler (yMaSCs) kan så være passage i 100% basalmembranen matrix organoid kultur betingelser (Se ordningen i figur 1A), selvstændige organisering i komplekse organoid-lignende strukturer, der udvikler omkring flere lumen og få vist bemærkelsesværdige selvfornyelse evne selv i mangel af doxycyclin (dvs. i mangel af transgene YAP udtryk) (figur 1E). Histologisk, yMaSC-afledte organoids vise en basal lag (K14 positive), står over for matrixen basalmembranen rekonstitueres ECM og en luminale lag (K8 positive), som står over for lumen-lignende hulrum i organoid (figur 1F). Denne arkitektur er skelnes fra organoids dannet af indfødte MaSCs (figur 1F).
Generation af yDucts Overblik over den eksperimentelle strategi til at omprogrammere primære pancreas acini ved forbigående ekspression af YAP er præsenteret i figur 2A. Hele acinar klynger er isoleret fra størstedelen af pancreas væv af en kombination af mild dissociation og størrelse udstødelse gennem filtrering. En typisk forberedelse er præsenteret i figur 2B. Efter isolering, skal acinar celle klynger vises som en suspension af eksokrine acinar enheder af homogen størrelse, med ingen forurening af endokrine Langerhanske øer eller fragmenter af pancreas duktalt træ og minimal dissociation til enkelt celler. Forurening af endokrine Holme eller duktalt fragmenter er en indikation af mangelfuld selektiv filtrering (trin 2.1.10), muligvis på grund af barske håndtering; uønskede dissociation af acinar klynger til enkelt celler kan skyldes overdreven collagenase behandling eller unbuffered aktivitet af Proteolytiske enzymer frigivet af det væv, som kan bremses af supplerende SBTI behandling.
En typisk acinar omprogrammering eksperiment er præsenteret i figur 2 c; inden for 5-7 dage af kultur i 3D kollagen-baseret hydrogel i overværelse af doxycyclin, pancreas acini stammer fra R26-rtTAM2/Millie-YAPS127A mus let vende i kanalen-lignende klynger (at vi hedder yDucts), består af en tynd éncellelag af epitelceller, der formere sig omkring en ekspanderende centralt hulrum. Omprogrammering effektivitet, hvilket er omkring 70% til en typisk eksperiment, kan let måles ved at score antallet af kanalen-lignende klynger over det samlede antal seedede acini (figur 2D). Den negative kontrol celler, dvs R26-rtTAM2 / + celler eller R26-rtTAM2/Millie-YAPS127A celler venstre uden doxycyclin, altid forblive som post mitotiske acinar klynger i disse dyrkningsbetingelser, som tidligere rapporteret1 ,14,15. Omprogrammerede yDucts kan derefter passaged på niveauet enkelt celle ind i Matrigel-baseret organoid kultur betingelser16 (Se ordningen i figur 2A), vise bemærkelsesværdige selvfornyelse evne selv i mangel af doxycyclin (dvs. i mangel af transgene YAP udtryk) (figur 2E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig1.jpg"> Figur 1: Dyrkning af primære brystkirtler LD celler og induktion af brystkirtler stamceller. (A) skematisk gengivelse af forsøgsmetoden vedtaget for at omprogrammere primære brystkirtler LD celler. (B) repræsentant FACS-plots illustrerer en typisk sortering procedure at rense LD celler. i) dissocierede celler er gated ifølge frem og side scatter for levende celler (P1, blå); II) befolkning P1 er derefter yderligere gated ifølge sin Lin profil: delpopulation af afstamning-negative celler (P2; grey) er valgt, undtagen afstamning-positive hæmatopoietisk celler; III) befolkning P2 er derefter adskilles i en EpCAMhøj (P3; gul + grøn) og en EpCAMlav (P6, red) delpopulationer; IV) P3 og P6 er derefter yderligere gated ifølge deres CD61/CD49f profil i tre delpopulationer: EpCAMlavCD49fhøjCD61- basale celler (P7, red), EpCAMhøjCD49flavCD61+ LP celler (P8, gul) EpCAMhøjCD49flavCD61- LD celler (P9; grøn). (C) billeder er illustrerende for LD celler, inficeret med de angivne konstruktioner, evne til at danne brystkirtler kolonier 15 dage efter såning i Brystkirtlerne koloni medium. Kun YAP-udtrykker celler tur i kolonidannende celler, hvorimod negativ kontrol celler (EGFP-inficeret) forbliver som vækst-anholdt enkelt celler. Skalalinjen = 50 μm. (D) kvantificering af kolonidannende evne til de angivne celler, som i (C). Data præsenteres som middelværdi + s.d. og er repræsentative for fem uafhængige eksperimenter, hver med seks tekniske replikater. (E) repræsentativt billede af YAP-omprogrammeret brystkirtler stamcelle-lignende celler (yMaSCs) efter 12 dage i organoid kultur betingelser i frisk tredimensionale 100% basalmembranen matrix hydrogel i mangel af doxycyclin. Skalalinjen = 100 μm. (F) repræsentative immunofluorescens billeder for den basale markør K14 (grønne) og den luminale markør K8 (rød) af organoids stammer fra de angivne celler, efter 12 dage i organoid kultur betingelser. Skalalinjen = 10 μm. Denne figur er gengivet fra Panciera et al., 20161. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig2.jpg"> Figur 2 : Isolering af primære pancreas acinar celler og induktion af pancreas stamfaderen. (A) skematisk gengivelse af forsøgsmetoden vedtaget for at omprogrammere primære pancreas eksokrine acinar celler. (B) repræsentativt billede af primære pancreas acini lige efter isoleret procedure (trin 2.1.14). Den acinar forberedelse skal vises som en homogen suspension af acinar klynger, med minimal tilstedeværelsen af enkelt celler. Skalalinjen = 400 μm. (C) repræsentative billeder af primære pancreas acini stammer fra R26-rtTAM2 (øverste paneler)eller R26-rtTAM2; Millie-YAPS127A (lavere paneler) mus og kulturperler i 3D-kollagen-baseret hydrogel i 5 dage med eller uden Doxycyclin (doxy), som angivet. Kun konvertere YAP-udtrykker primære acini celler vokser som cyste-lignende organoid efter doxycyclin tilsætning. Skalere barer = 70 μm. (D) kvantificering af pancreas acini evne til at danne duktalt organoids ved transgene YAP overekspression som i (C). Data præsenteres som middelværdi + s.d. og er repræsentative for fem uafhængige forsøg, udført med fire tekniske replikater. (E) repræsentativt billede af YAP-reprogramed duktalt-lignende celler (yDucts) efter tre passager i frisk tredimensionale 100% basalmembranen matrix hydrogel i mangel af doxycyclin. Skalalinjen = 130 μm. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Isolering af primære brystkirtler celler</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ca2 + chelaterende løsning</td>
			<td>Opbevares ved 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>0,02% w/V</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Kollagen jeg belægning løsning</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eddikesyre 0.02N, pH 3,23</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Rotte hale kollagen (belægning)</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase løsning</td>
			<td>Opbevares ved 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Dissociation Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase stamopløsning</td>
			<td>400 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stamopløsningen collagenase jeg</td>
			<td>600 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hæmolytisk løsning</td>
			<td>Opbevares ved 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl løsning</td>
			<td>1 dele</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisBase 20.6 g/L</td>
			<td>9 dele</td>
		</tr>
<tr>
<td>justere pH til 7.2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS/PS</td>
			<td>Opbevares ved 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>2 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase stamopløsning</td>
			<td>Filter 0,2 µm, opbevares ved 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase fra kvæg testiklerne (pulver)</td>
			<td>2.000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumfosfat Buffer 1 M pH7.3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl løsning</td>
			<td>Opbevar ved T. amb.</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl</td>
			<td>7.1 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>justere pH til 7.65</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Sortering løsning</td>
			<td>Filter 0,2 µm, opbevares ved 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES pH 7</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Vaske Medium #1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vaske Medium #2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Brystkirtler 2D næringssubstratet</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparin</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamin</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>murine bFGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murine EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Induktion og Passaging af yMaSCs</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Brystkirtler koloni Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparin</td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamin</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Matrigel (tilføje umiddelbart før såning)</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>murine bFGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murine EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Brystkirtlerne Organoid Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>Avancerede DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>GlutaMax</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparin</td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>menneskelige Noggin</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murine bEGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murine EGF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Generation af yMaSCs. Sammensætning af alle forskellige dyrkningsmedier og løsninger kræves for isolation af primære brystkirtler LD celler og induktion af yMaSCs (afsnit 1.)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Isolering af primære pancreas acini</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar næringssubstratet</td>
		</tr>
<tr>
<td>BPE</td>
			<td>50 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dexamethason</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITS-X</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Waymouth's Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar vask Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>RPMI Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar inddrivelse Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acinar næringssubstratet</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collagenase jeg opløsning A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acinar vask Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Stamopløsningen collagenase jeg</td>
			<td>360 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS/PS</td>
			<td>Opbevares ved 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS (fosfatbufferet saltopløsning)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stamopløsningen collagenase jeg</td>
			<td>Opbevares ved-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagenase, type jeg (pulver)</td>
			<td>6.000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Passaging af pancreas organoids</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collagenase jeg løsning B</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS 1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Stamopløsningen collagenase jeg</td>
			<td>240 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Pancreas Organoid Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>Avanceret DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>gastrin</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>menneskelige FGF10</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>menneskelige Noggin</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murine EGF</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-acetylcystein</td>
			<td>1,25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinamid</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Generation af yDucts. Sammensætning af alle forskellige dyrkningsmedier og løsninger kræves for isolation af primær acinar celler og induktion og passaging af yDucts (afsnit 2.)

Watch this Scientific Journal Video about De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ at JoVE.com

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

Tilgængeligheden af somatiske SCs er afgørende for regenerativ medicin, sygdom modellering og få indsigt i SC egenskaber. Præsenterer her vi eksperimentelle strategier til at omprogrammere, in vitro, differentieret voksne celler ind i deres tilsvarende udvideligt væv-specifikke stem/stamceller af forbigående udtryk for den enkelt transcriptional Co aktivator YAP.

De Novo Generation af somatiske stamceller af YAP/TAZ

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

Research

JoVE Journal

Biology

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Omprogrammering humane somatiske celler i induceret pluripotente stamceller (IPSC&#39;er) under anvendelse af retroviral vektor med GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generering af mus afledt fra induceret pluripotente stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein VISDOM: A Workbench for<em&gt; I silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Design af biomolekyler

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Menneskelige induceret pluripotente stamceller fra humane somatiske celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og stamcelle i Voksen Mouse calvarie knoglemarv

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...